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Adaptation de 3' Amplification rapide des ADNc se termine pour mapper les transcriptions en Cancer

Published: March 28, 2018 doi: 10.3791/57318

Chioniso Patience Masamha¹, Zachery Todd¹

¹Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy and Health Sciences, Butler University

Summary

Deux différentes 3' amplification rapide des extrémités d’ADNc (3' course) protocoles décrit ici faire usage de deux différents ADN polymérases pour mapper les séquences qui incluent une partie de la trame de lecture ouverte (ORF), le codon d’arrêt et l’entière région 3' UTR de transcription utilisant l’ARN issus de lignées de cellules cancéreuses différent.

Abstract

La maturation des ARNm eucaryotes implique 3' fin formation qui implique l’addition d’une queue poly (a). Afin de cartographier l’extrémité 3' d’un gène, la méthode traditionnelle de choix est 3' amplification rapide des extrémités d’ADNc (3' RACE). Protocoles pour 3' RACE nécessitent la conception soignée et la sélection des amorces imbriquées au sein de la région 3' non traduite (3' UTR) du gène cible d’intérêt. Cependant, avec quelques modifications, le protocole peut être utilisé pour inclure l’entière région 3' UTR et séquences dans le cadre de lecture ouvert (ORF), fournissant une image plus complète de la relation entre l’ORF et la région 3' UTR. Il s’agit en plus d’identifier le signal de polyadénylation (Fe), ainsi que le site de clivage et polyadénylation fourni par classiques 3' RACE. Expansé 3' RACE peut détecter insolite 3' UTR, y compris des fusions de gènes au sein de la région 3' UTR, et les informations de séquence peuvent être utilisées pour prédire le potentiel miRNA accepteurs comme AU riche déstabiliser les éléments qui peuvent affecter la stabilité de la transcription.

Introduction

La formation de l’extrémité 3' est une étape cruciale dans la maturation des ARNm qui comprend le clivage de l’ARN pré-messager en aval d’un PAS suivie par l’ajout de ~ 250 untemplated adénines, qui forment la queue poly (a)¹^,². La protéine de liaison de poly (a) (PABP) se lie à la queue poly (a), et cela protège la transcription de l’ARNm de la dégradation et facilite la traduction¹.

Les estimations actuelles suggèrent que 70 % des gènes humains ont plusieurs PASs et donc subir une alternative polyadénylation, entraînant plusieurs extrémités de 3'³. Ainsi, il est important d’identifier où la queue poly (a) s’adapte sur le reste de la région 3' UTR, en plus d’identifier les FE utilisés par toute transcription donnée. L’avènement de la nouvelle génération de séquençage a entraîné l’identification simultanée de la 3' UTR et le col de milliers de gènes. Cette augmentation de capacité de séquençage a nécessité le développement d’algorithmes bioinformatiques pour analyser les données impliquant la polyadénylation alternative de l’extrémité 3'. Pour la détection de novo ou la validation du PAS et par conséquent de cartographie de l’extrémité 3' des gènes individuels de données de séquençage à grande échelle, 3' RACE reste la méthode de choix⁴^,⁵. Les séquences incluses dans les produits de cDNA de 3' course normalement n'incluent qu’une partie de la région 3' UTR qui contient la queue poly (a), le site de clivage, le PAS et les séquences en amont du PAS. Contrairement à la PCR, qui requiert la conception et l’utilisation des amorces spécifiques et inverses de gène, 3' RACE ne nécessite que deux gènes imbriqué avant des amorces spécifiques. Par conséquent, PCR requiert une connaissance plus détaillée de la séquence nucléotidique d’une grande région du gène étant amplifiés⁴^,⁶. Depuis 3' RACE utilise le même inverser apprêt que cibles la poly (a) la queue pour les transcriptions polyadénylé RNA, seulement les amorces avant doivent être gène spécifique, ainsi, exigeant seulement la connaissance d’une région beaucoup plus petite de l’ARNm. Cela permet l’amplification des régions dont les séquences ne sont pas complètement caractérisé⁴^,⁷. Cela a permis à 3' course permettant non seulement de déterminer l’extrémité 3' d’un gène, mais également déterminer et caractériser les grandes régions en amont du PAS qui forment une partie importante de la région 3' UTR. En combinant 5' course avec la mis à jour le 3' course qui comprend des portions plus importantes de la région 3' UTR et régions adjacentes, on peut pleinement séquence ou cloner une toute transcription ARNm de l’extrémité 5' à son extrémité de 3'⁸.

L’identification récente d’un roman CCND1-MRCK transcription de gène fusion de lignées de cellules de lymphome du manteau et de patients atteints de cancer en est un exemple de cette demande de mis à jour le 3' RACE. La région 3' UTR consistait en des séquences de gènes les CCND1 et MRCK et était récalcitrant à miRNA règlement⁹. Les deux imbriqués CCND1 avant des amorces spécifiques sont complémentaires dans la région immédiatement adjacente et en aval du codon CCND1 . Bien que le séquençage de transcriptome entier ainsi que des outils bioinformatiques spécifique peut être utilisé pour détecter des fusions de gènes au sein de la 3' UTR¹⁰, nombreux laboratoires peuvent n’ont pas les ressources financières ou l’expertise de bioinformatique pour faire usage de cette technologie. 3' RACE est donc une alternative pour l’identification de novo et la validation des gènes de roman fusion impliquant la région 3' UTR. Considérant la drastique augmentation du nombre de gènes de fusion signalés ainsi que de lire par l’intermédiaire de transcriptions, 3' RACE est devenu un outil puissant pour la caractérisation des séquences de gène¹¹^,¹². En outre, des études récentes ont montré que différentes séquences au sein de la région 3' UTR ainsi que la longueur de la région 3' UTR peut affecter mRNA stabilité de transcription, localisation, traduisibilité et fonction¹³. Due en partie à un intérêt accru dans la cartographie du transcriptome, il y a eu une augmentation du nombre des différents ADN polymérases, en cours d’élaboration pour une utilisation en laboratoire. Il est important de déterminer quels types de modifications peuvent être apportées à la 3' Protocole de course en afin d’utiliser le répertoire disponible des ADN polymérases.

Ce travail rapports adaptation 3' course de cartographier l’ensemble 3' UTR, les FE et 3' fin site de clivage de la transcription de ANKHD1 à l’aide d’imbriqués amorces au sein de la section ANKHD1 de la transcription et deux différents ADN polymérases.

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Protocol

Porter une blouse, des gants et des lunettes de sécurité en tout temps lors de l’exécution de toutes les procédures dans le présent protocole. S’assurer que les contenants/tubes contenant le réactif de l’isothiocyanate de phénol et de guanidine sont ouverts uniquement dans une hotte certifiée et éliminer les déchets de phénol dans un conteneur désigné. Utiliser des réactifs, des conseils et des tubes stériles DNAse/RNAse-libre.

1. Culture cellulaire

Cultiver la lignée cellulaire HeLa et deux suspension manteau cell lymphoma lignées cellulaires, Granta-519 et Jeko-1, en DMEM contenant 10 % FBS et 100 U/mL de pénicilline/streptomycine dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂ à 37 ° C. Diluer les cellules 01:10 et compter à l’aide d’un compteur de particules¹⁴.
Pour l’extraction de l’ARN, plaque de 500 000 cellules/puits dans une plaque 6 puits (2 mL de milieu / puits). Après incubation pendant 24 h, recueillir RNA des cellules.

2. Extraction de l’ARN

Récolte des cellules
Remarque : À l’exception de l’étape de centrifugation, effectuez toutes les étapes énumérées dans une hotte de culture de tissus pour maintenir la stérilité.
1. Pour les cellules en suspension (Jeko-1 et Granta-519) :
  1. Transférer les cellules (en collaboration avec 2 mL de médias) dans un tube de 15 mL et centrifuger à 1 725 x g pendant 5 min. aspirer les médias et laisser le culot cellulaire dans le fond du tube.
  2. Resuspendre le culot dans 50 µL de 1 x Phosphate Buffered Saline (PBS). Ajouter 500 µL de réactif d’isothiocyanate phénol et guanidine monophasique à chaque échantillon dans le tube de microtubes de 1,5 mL. Bien mélanger et laisser à température ambiante (RT) pendant 5 min, tout en renversant le tube microcentrifuge, toutes les 1 min.
2. Pour les cellules adhérentes (HeLa) :
  1. Aspirer les milieux de culture cellulaire de chaque puits. Ajouter 1 mL de PBS dans chaque cupule pour éliminer les débris.
  2. Retirez le PBS et ajouter 500 µL de réactif d’isothiocyanate phénol et guanidine monophasique dans chaque puits.
  3. Incuber à RT pendant 5 min avec le doux balancement. Transférer dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
Lyse cellulaire
1. Congeler le mélange de cellule de l’isothiocyanate de phénol et de guanidine à-20 ° C pendant 1 h.
  Remarque : Le mélange peut être laissé à-20 ° C durant la nuit ou jusqu'à ce que nécessaire.
2. Décongeler le phénol et guanidine isothiocyanate cellule le mélange sur la glace. Ajouter 100 µL de chloroforme dans le tube de microcentrifuge sous une hotte PCR. Vortex de l’échantillon pour 10-15 s jusqu'à ce que le mélange soit opaque et rose. Incuber l’échantillon sur la glace (à 4 ° C) pendant 15 min.
3. Centrifuger l’échantillon pendant 15 min à 20 800 x g et 4 ° C. Retirer délicatement la phase aqueuse incolore supérieure (~ 200 µL) et transfert dans un nouveau tube de microtubes de 1,5 mL.
Précipitation d’ARN
1. Ajouter un volume égal d’isopropanol à chaque échantillon. Ajouter 1 µL de coprecipitant (voir Table des matières) pour chaque échantillon pour agir comme un support pour l’ARN et aident à visualiser l’ARN dans les étapes suivantes. Incuber les échantillons à-80 ° C pendant au moins 4 h. Pour de meilleurs résultats, laisser incuber pendant la nuit à-80 ° C.
2. Transférer l’échantillon dans une centrifugeuse refroidie. Centrifuger pendant 35 min à 20 800 x g / 4 ° C ; l’ARN apparaîtra comme une tache bleue sur le fond du tube. Retirer délicatement l’isopropanol de l’échantillon. Ajouter 500 µL d’éthanol à 80 % et Resuspendre le culot brièvement Vortexer pendant 3 s.
3. Centrifuger l’échantillon à 20 800 x g à RT pendant 5 min. Retirez tout l’éthanol de l’échantillon. L’échantillon a laissé sécher à l’air pour environ 10 min. remettre en suspension l’échantillon dans 35 µL d’eau exempte de RNAse. Placer sur un bloc chauffant (65 ° C) pendant 5 min pour que l’ARN soit entièrement en solution et immédiatement placer le tube sur la glace.
4. Déterminer la concentration de l’ARN total à l’aide d’un spectrophotomètre comme décrit précédemment, excepté utiliser 1,5 µL de l’échantillon de RNA au lieu de 1 µL¹⁵. Vous pouvez également exécuter 1 µg d’ARN total sur un gel d’agarose à 1 % pour déterminer l’intégrité de la RNA.

3. traitement de DNase

Après quantification de l’ARN, effectuer le traitement de la DNAse sur l’ARN total se dégrader tout l’ADN génomique. Pour chaque échantillon, ajouter les réactifs suivants du kit de DNAse RNAse-libre pour faire une réaction totale de 20 µL à mélanger dans un tube de microcentrifuge distincts :
1. Mélanger 2 µL de DNase 10 X tampon de réaction avec 4,4 µg d’ARN total. Porter à un total de 14 µL avec de l’eau.
2. Ajouter 2 µL de DNAse RNase-libre. Incuber à 37 ° C pendant 30 min en présence de 2 µL d’inhibiteur de RNase (à partir du Kit de Transcription inverse).
3. Ajouter 2 µL de Solution d’arrêt et de la chaleur sur un bloc chauffant pendant 10 min à 70 ° C pour inactiver les enzymes de la DNAse.
  Remarque : Le traitement de DNAse est facultatif.

4. synthèse de cDNA

Pour un volume de réaction finale de 50 µL :

Pour un volume de réaction finale de 50 µL : transfert 22 µL de la DNase traités RNA pour un nouveau tube, ou un transfert 4 µg d’ARN total avec de l’eau supplémentaire à un volume total de 22 µL dans un nouveau tube. Ajouter 2 µL de l’amorce T7 oligo dT₂₅ de solution d’apprêt 10 µM. La séquence pour l’amorce T7 oligo dT₂₅ est 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'.
Dans le kit de Transcription inverse ajouter 2 µL de l’inhibiteur de RNase (20 U/µL), 8 µL du tampon réaction 5 x, 4 µL des dNTPs 10 mM et 2 µL de la transcriptase inverse (200 U/µL).
Remarque : Mettre en place une réaction sans la transcriptase inverse d’agir comme témoin négatif.
Incuber à 42 ° C pendant 1 h. transfert directement à la glace. Chauffer le tube à 75 ° C pendant 5 min et placer le tube sur la glace.

5. apprêt recherche de transcription de gène de Fusion

Conception d’amorce
1. Télécharger la séquence d’ADNc depuis le navigateur de génome d’Ensemble (ENST00000360839.6/NM_017747) et d’identifier une région au sein de l’ORF de la transcription de cible (ANKHD1) en amont du codon stop. Copiez et collez l’ensemble de la région (jusqu'à 700 nucléotides) contenant des séquences en amont du codon stop dans la région d’entrée de séquence du logiciel de conception apprêt (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>).
2. Sélectionnez l’option Afficher les design personnalisé, puis sélectionnez 10 pour le nombre d’amorces que le système doit générer (résultats à retourner) et laisser tous les autres paramètres définis par défaut.
3. Choisissez cinq amorces vers l’avant et deux amorces inverses qui ne se chevauchent pas. Commandez des amorces et reconstituer avec de l’eau exempte de RNAse/DNAse à une concentration finale de 10 µM. Plus de détails sur la conception d’amorce générale pour PCR sont couverts ailleurs¹⁶.
PCR pour identifier les amorces potentielles pour une utilisation dans les 3' RACE
Remarque : Pour déterminer les amorces finales avant d’utiliser dans la réaction, tester les amorces en mettant en place différentes combinaisons d’amorces et inverses pour PCR régulière dans une hotte de PCR.
1. Transférer l’ADNc (2 µL) dans un tube PCR frais 0,5 mL. Ajouter 1 µL de l’amorce vers l’avant et 1 µL de l’apprêt inverse (d’une solution d’amorce de 10 mM). Faire jusqu'à 12,5 µL en ajoutant 8,5 µL d’eau exempte de nucléase. Ajouter 12,5 µL du 2 x PCR-à-Gel Master Mix.
2. Utiliser les conditions suivantes PCR de cyclisme thermiques : 95 ° C pendant 2 min suivie de 29 cycles de 95 ° C pendant 30 s, 60 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 1 min. régler le cycle final à 68 ° C pendant 7 min.
3. Après le PCR, exécuter les produits sur un gel d’agarose de 1 % coloré au bromure d’éthidium. Détails de l’électrophorèse sont comme décrit précédemment avec quelques modifications¹⁷.
  1. Dissoudre 1 g d’agarose dans 100 mL de tampon Tris-acétate (TAE) dans un ballon jaugé de 250 mL. Cuire dans un four à micro-ondes.
  2. Laisser refroidir pendant 1 min et ajouter 7,5 µL de solution de bromure d’éthidium (10 mg/mL de bouillon) sous une hotte. Bien mélanger en agitant le flacon et versez dans un appareil de gel horizontal. Laisser à ta dans la hotte de laboratoire pendant au moins 30 min permettre le gel se solidifier.
  3. Couvrir le gel 1 x TAE et charger 10 µL du produit PCR sur le gel d’agarose avec 3-5 µL de l’échelle de poids moléculaire de l’ADN. Courir à 175 V pour 10 min. visualiser les produits à l’aide d’un système imageur et si une séparation des produits est nécessaire, exécutez le gel pour un 5-10 min supplémentaire.
Choix des amorces imbriquées pour 3' RACE
1. Analyser les résultats du gel d’agarose PCR pour sélectionner des amorces qui ont une bande PCR distincte, forte et unique. Utiliser le primaire plus 5' (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3') ainsi que l’amorce de₂₅ oligodT T7 dans la première PCR exécuter.
2. Sélectionnez l’amorce imbriquée qui est situé en aval de la première primaire (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3') et l’utiliser avec l’amorce T7 (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3') dans le deuxième jeu de la réaction PCR.

6. optimisation des 3' RACE pour cartographier la région 3' UTR à l’aide de deux différentes Enzymes

Remarque : Il y a eu une augmentation de la diversité des ADN polymérases utilisées pour l’ACP ; donc, nous avons voulu déterminer les conditions standards qui peuvent être appliquées même si vous utilisez différentes enzymes pour 3' réactions PCR de course. Les amorces inverses pour toute transcription sont maintenus constants ; les seuls changements sont dans les amorces avant imbriqués qui sont spécifiques pour la transcription de la cible.

Protocole 1:3 ' course en utilisant une ADN polymérase modifiée de Pyrococcus furiosus (Pfu)
1. Première PCR
  1. Transférer 1 µL d’ADNc dans un tube PCR et ajouter 5 µL de tampon de réaction 10 x Pfu . Ajouter 1 µL de la première amorce avant imbriqué, 1 µL de l’amorce T7 de₂₅ oligodT et 1 µL des dNTPs (d’une solution de 10 mM).
  2. Rendre jusqu'à 49 µL volume total en ajoutant 40 µL d’eau. Ajouter 1 µL d’ADN polymérase de Pfu et bien mélanger. Exécutez la PCR à l’aide du profil de la PCR dans le tableau 1.
2. Deuxième PCR
  1. Transférer 2 µL des produits de la PCR première dans un nouveau tube PCR et mélanger 5 µl de tampon de réaction PfuUltra II x en 10. Ajouter 1 µL de la seconde amorce PCR imbriqué et 1 µL de l’amorce T7 1 µL des dNTPs (solution de 10 mM).
  2. Rendre jusqu'à 49 µL volume de réaction totale en ajoutant 39 µL d’eau. Ajouter 1 µL de Pfu polymérase de l’ADN. Exécutez le PCR utilisant le même profil PCR comme la première installation PCR (tableau 1).
Protocole 2:3 ' course en utilisant une ADN polymérase chimérique, consistant en un domaine de liaison ADN fusionné à un Pyrococcus-comme relecture mélange maître de la polymérase PCR
1. Première PCR
  1. Transférer 1 µL d’ADNc dans un tube PCR. Ajouter 1 µL de la première amorce avant imbriqué et 1 µL de l’amorce T7 de₂₅ oligodT. Faire jusqu'à 25 µL en ajoutant 22 µL d’eau.
  2. Ajouter 25 µL de 2 x PCR Master Mix et bien mélanger. Utiliser les conditions cyclisme PCR décrites dans le tableau 2.
2. Deuxième PCR
  1. Transfert 2 µL des produits de la PCR première dans un nouveau tube PCR. Ajouter 1 µL de la seconde amorce PCR imbriquée avec 1 µL de l’apprêt inverse T7.
  2. Faire jusqu'à 25 µL en ajoutant 22 µL d’eau. Ajouter 25 µL de 2 X PCR Master Mix. Exécutez le PCR utilisant le même profil PCR comme la première installation PCR (tableau 2).

7. vérifier le deuxième produit PCR de 3' RACE.

Prendre 5 à 10 µL du deuxième produit de PCR (et le produit dès le 1er tour de RFT si la transcription est abondamment exprimée) et exécuter sur gel d’agarose. Mettre en place le gel et exécutez l’électrophorèse comme décrit précédemment (étapes 5.2.3.1 à 5.2.3.3). Visualiser les résultats sur un imageur.

8. séquençage et la Purification du produit

Purifier les produits PCR de gel depuis la deuxième PCR en utilisant le Gel et la PCR Fragment ADN nettoyage système conformément au protocole du fabricant.
Effectuer Sanger séquençage (vous pouvez également envoyer le gel purifié des échantillons de produits PCR et les amorces de séquençage approprié à un laboratoire de séquençage). Analyser les données de séquençage après Sanger séquençage.
Télécharger le logiciel d’analyse de séquence (voir Table des matières) et importez les fichiers de trace dans le logiciel. Utilisation les QVs individuels de Base PURE (valeurs de qualité) pour obtenir la Base appel information¹⁸. Télécharger le chromatogramme avec traces de haute qualité pour le visionnement.
En option : Le produit purifié de gel peut être cloné à l’aide d’un kit de clonage approprié et les clones isolés envoyés pour Sanger séquençage.

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Representative Results

Recherche de Primer avant imbriqués :

Le gel d’agarose La figure 1 montre deux produits distincts du gel PCR (pistes 1 et 2) qui utilisent le même avant apprêt mais différentes amorces inverses. Lane 3 a un produit PCR distinct et une amorce et inverse distincte. Les amorces idéales à utiliser pour la réaction PCR basé sont ceux qui donnent un produit PCR distinct (voie 3). L’apprêt avant utilisé dans les voies 1 et 2 donne la bande plus forte et donne aux produits PCR du plus grands (prévues) est utilisé comme la première amorce vers l’avant. L’amorce imbriquée deuxième pour la deuxième série de réactions de PCR en 3' RACE est l’apprêt avant de 3 voies.

Différents ADN polymérases utilisées en 3' course produisent des résultats similaires :

Deux différents ADN polymérases produit les mêmes produits PCR tailles malgré les différentes conditions de cyclisme de PCR pour la 3' RACE (Figure 2). Il n’y a qu’une seule bande distincte pour le produit attendu de la PCR. Tout le négatif de la transcriptase inverse du contrôle négatif (-) n’ont pas une bande, ne montrant aucune contamination génomique de l’ARN utilisé dans la synthèse de cDNA, ainsi que dans des réactions subséquentes en aval.

Résultats du séquençage Sanger :

Les produits PCR ont été gel purifié et envoyé pour Sanger séquençage. Les résultats affichés dans la Figure 3 a montrent une portion d’un chromatographe en phase de séquence de Sanger séquençage. Une séquence représentative identifie l’emplacement du codon, signal de polyadénylation putatif et le site de clivage, ainsi que le poly (A) queue du produit de course 3' (Figure 3 b).

Figure 1 : Identification des deux amorces avant spécifique de gène imbriqués à utiliser en 3' RACE. Montré est un exemple de produits PCR de différentes combinaisons de gènes spécifiques avant et amorces inverses à l’aide de cDNA de HeLa exécutent sur un bromure d’éthidium teinté de gel d’agarose avec l’échelle de poids moléculaire (mw). Voies 1 et 2 sont des produits PCR du même gène spécifique avant l’apprêt mais différentes amorces inverses. Les flèches pointent vers le produit attendu de la PCR pour chaque voie. En plus de la bande pour le produit attendu de la PCR, il y a une bande additionnelle. Le seul produit PCR à 3 voies est d’une amorce spécifique imbriqué avant et arrière différents gènes et montre la seule bande attendue.

Figure 2 : vérification de la 3' RACE venant de la deuxième série de réactions PCR. Produits de la réaction PCR deuxième avec (A) l’ADN Pfu polymérase et (B) chimère ADN polymérase est dirigées sur un gel d’agarose au bromure d’éthidium. Lanes représentés par (-) proviennent de l’échantillon témoin négatif pour chaque lignée cellulaire lors de la synthèse de cDNA de l’ARN a été réalisée en l’absence de l’enzyme transcriptase inverse. Voies 1 et 2 sont des produits PCR de réplicats biologiques de chaque lignée cellulaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : cartographie les produits PCR de la 3' RACE. (A) A la partie d’un chromatogramme de la séquence d’un RACE produit de 3' gel purifié montrant le signal de polyadénylation prédites et l’emplacement de la queue poly (a). (B) représentant des séquences de données de séquençage Sanger montrant le codon d’arrêt, le signal de polyadénylation (Fe), le site de clivage et de fixation de la queue poly (a) ainsi qu’une section des séquences queue poly (A). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Étape du cycle	Température et durée	Nombre de cycles
Dénaturation initiale	95 ° C pendant 3 min	1
Recuit et l’extension initiale	50 ° C pendant 5 min et 72 ° C pendant 10 min	1
Subcyles (dénaturation, recuit et extension)	95 ° C pendant 40 s, 50 ° C pendant 1 min et 72 ° C pendant 3 min	20
Cycle final (dénaturation, recuit et extension)	95 ° C pendant 40 s, 50 ° C pendant 1 min et 72 ° C pendant 15 min	1
Maintenez	4 ° C, ∞

Tableau 1 : Pfu ADN polymérase PCR cyclisme conditions pour 3' RACE.

Étape du cycle	Température et durée	Nombre de cycles
Dénaturation initiale	98 ° C pendant 3 min	1
Recuit et l’extension initiale	50 ° C pendant 5 min et 72 ° C pendant 10 min	1
Subcyles (dénaturation, recuit et extension)	98 ° C pendant 30 s, 50 ° C pendant 1 min et 72 ° C pendant 4 min	20
Cycle final (dénaturation, recuit et extension)	98 ° C pendant 30 s, 50 ° C pendant 1 min et 72 ° C pendant 15 min	1
Maintenez	4 ° C, ∞

Tableau 2 : Chimère ADN polymérase PCR cyclistes des conditions.

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Discussion

Malgré l’avènement des technologies de séquençage parallèle massive, sur une base de gène par gène, 3' RACE reste la méthode la plus facile et plus économique pour identifier les PAS et les nucléotides adjacents à la queue poly (a). L’adaptation décrite ici développe en utilisant 3' course à amplifier et carte des séquences qui incluent une partie de l’ORF, le codon d’arrêt et l’entière région 3' UTR de la transcription ARNm de ANKHD1 . Un avantage majeur de la 3' RACE est que, avec quelques adaptations mineures, produits de 3' RACE peuvent être clonés dans autres vecteurs pour faciliter l’interrogatoire en aval de 3' UTR fonction y compris miRNA ciblage, essais de stabilité ainsi qu’autres dosages mécanistes. Ceci est possible en incluant des sites d’enzymes de restriction dans l’amorce imbriquée séquences⁹^,¹⁰. Des ajustements sont possibles pour inclure uniquement la région 3' UTR sans toutes les séquences de l’ORF de clonage pour 3' UTR essais fonctionnels⁵.

Un facteur déterminant du succès de la 3' RACE est le développement d’amorces imbriquées qui ciblent le gène d’intérêt. Les séquences d’ADNc depuis le navigateur de génome Ensembl sont recommandés pour mieux identifier les régions sans polymorphismes afin de développer des amorces optimales. Idéalement, plusieurs imbriqué avant amorces aussi bien qu’au moins deux amorces inverses dans le gène d’intérêt peuvent être analysés au moyen du PCR standard pour identifier les meilleur deux gène imbriquée des amorces spécifiques à utiliser. Dans cette étude l’apprêt avant premier gène, spécifiques, initialement retenu pour 3' RACE a donné deux bandes avec PCR standard utilisé couramment dans le laboratoire. Malheureusement, la conception d’amorce était limitée par le nombre important de SNP dans la transcription d’intérêt. SNP dans la transcription de cible conduire à incompatibilité entre les amorces et la cible, qui peut se traduire par un recuit inefficace et l’amplification et devrait être ramenée à un minimum de¹⁹. La présence d’au moins quatre SNP dans une amorce, ou la présence d’une combinaison de cinq incompatibilités (trois en un apprêt et deux dans l’autre) peut entraîner une inhibition complète de la réaction PCR, et donc la seule option est de concevoir plusieurs amorces²⁰. Au lieu de concevoir des amorces plus pour obtenir une seule bande pour la norme que PCR utilisée pour la recherche de primer dans les expériences rapportées ici, les conditions de cyclisme de PCR et les ADN polymérases utilisées par la suite en 3' RACE ont été modifiés afin d’optimiser la probabilité de obtenir une bande spécifique. La température de dénaturation est passée à 98 ° C, pour l’un de l’ADN polymérases (une augmentation de 95 ° C utilisée dans la recherche de l’amorce). Pour les deux ADN polymérases utilisées dans la 3' RACE PCR, la durée de la dénaturation initiale a été porté à 3 min au lieu de la recommandée 30 s à 2 min afin de dénaturer complètement la matrice d’ADNc. L’amorce T7 oligo dT₂₅ est prédit par exemple potentiellement forme faibles structures secondaires, qui peuvent réduire la disponibilité des amorces²¹. Augmenter la longueur de la dénaturation initiale et la température rompt toute structures secondaires et contribue à produire la seule bande spécifique après le cycle final de la 3' RACE. En outre, la bande non spécifique est plus léger que les bandes attendus, ce qui suggère qu’il est apparu aux cycles supérieurs de PCR (jusqu'à 35 cycles) ; limiter les cycles PCR à seulement 20 réduit l’amplification de la bande non spécifiques.

Un autre potentiel de 3' course, comme d’autres réactions de PCR basé, est incomplète amplification de la région de cible²². Par conséquent, pour les deux enzymes thermophiles, la température de recuit initiale a été fixée à 50 ° C pendant 5 min optimiser le recuit des amorces à la cible et cela a été suivie par une température de l’extension initiale à 72 ° C pendant 10 min. Le cycle PCR final pour chaque enzyme avait une dernière prorogation délai de 15 min à 72 ° C. Ces étapes d’extension étaient plus longues que celles recommandées par le fabricant de l’ADN polymérases. L’étape de la longue extension (élongation) permet la synthèse complète des amplicons incomplète, permettant une extension complète de l’amplification initiaux et finaux produits¹⁶.

Étapes PCR qui se produisent dans la 3' RACE sont très sensibles, donc ils peuvent détecter l’ADN génomique (ou autres contaminations de l’ADN) au lieu de la transcription des ARNm cible, entraînant plusieurs bandes inattendues sur le gel de²². Une façon de prévenir la contamination est d’effectuer le travail de la PCR dans une hotte PCR dédiée, porter des gants et utiliser des réactifs propres et stérilisés à l’autoclave tubes stériles Pipetter conseils. En PCR régulière, amorces et inverses peuvent être conçus afin qu’ils sont trouvent sur différents exons (à travers des amorces intron) ; de cette façon, un produit PCR anormalement élevé signifierait qu’une région contenant un intron a été amplifiée. Cependant, cela ne peut pas toujours être réalisable dans le cas où seulement le 3' séquence UTR, situé dans le même terminal exon, est la cible de 3' amplification de course. L’ARN peut également être pré-traitées avec de l’enzyme de DNAse avant la synthèse de cDNA. L’utilisation de l’amorce de₂₅ T7 oligo dT pour amorcer la réaction de la transcriptase inverse au lieu d’un hexanucléotide aléatoire pour la première synthèse de cDNA de brin de RNA diminue également l’amplification des produits génomiques. Enfin et surtout, mise en place d’un contrôle négatif (le « – » voies dans la Figure 2), où la synthèse de cDNA est paramétrée en absence de transcriptase inverse est fortement recommandée. Le contrôle est soumis à des mesures identiques pour les autres échantillons dans les procédures subséquentes 3' RACE. La présence d’une bande dans ce contrôle indique une contamination potentielle de l’ADN génomique.

Malgré les défis susmentionnés, 3' RACE est un outil puissant dans la cartographie des extrémités 3' sur une base de gènes individuels. L’avènement de la technologie de prochaine génération a conduit à une augmentation dans le répertoire de transcriptions disposant de moyens 3' extrémités résultant de polyadénylation alternatif, qui peut ou ne peut pas impliquer l’épissage alternatif. Pour ajouter à la complexité, dans les cellules cancéreuses, réarrangements chromosomiques sont fréquents et peuvent entraîner des gènes oncogènes fusion produits²³. La fusion entre les deux gènes peut impliquer l’ORF ou, dans certains cas, impliquent seulement les séquences dans le 3' UTR⁹^,¹⁰. En outre, il existe également des joints/co-transcribed gènes qui sont transcrits en même temps, mais peuvent se traduire de différentes protéines¹¹. 3' RACE peuvent être adaptées pour mapper tous ces transcriptions uniques, anormales ainsi que les transcriptions normales. Ceci est important car ces transcriptions anormales peuvent finir par servir de biomarqueurs spécifiques des maladies ou des cibles de médicaments spécifiques, par exemple, le médicament Imatinib ciblant le gène de fusion BCR-ABL1 dans le cancer.

Par conséquent, 3' RACE est une technique très polyvalente qui peut être utilisée pour amplifier les transcriptions normales, identifier roman 3' UTR et fusions de gènes nouveaux au sein de la 3' UTR⁵^,⁹. Dans ce rapport, 3' RACE a été utilisée pour amplifier et cartographier le codon d’arrêt, le PAS et l’entière région 3' UTR de la transcription de ANKHD1 à l’aide de différents ADN polymérases. L’approche décrite permet de cartographier l’extrémité 3' de toute transcription polyadénylé.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier Bettine Gibbs pour son aide technique.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HeLa cells	ATCC	CCL-2	Cervical cancer cell line.
Jeko-1 cells	ATCC	CRL-3006	Mantle cell lymphoma cell line.
Granta-519 cells	DSMZ	ACC-342	Mantle cell lymphoma cell line.
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	F6178	Fetal bovine serum for cell culture.
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisherScientific	15140122	Antibiotic and antimycotic.
GlycoBlue	Ambion	AM9545	Coprecipitant.
DMEM	ThermoFisherScientific	10569044	Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.
Nuclease Free-Water	ThermoFisherScientific	AM9938	Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution	Corning	21-030	1X PBS.
Chloroform	Sigma Aldrich	C7559-5VL
2-propanol	Sigma Aldrich	I9516
Reagent Alcohol	Sigma Aldrich	793175	Ethanol
Ethidium Bromide solution	Sigma Aldrich	E1510
TRIzol Reagent	ThermoFisherScientific	15596026	Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.
2X Extender PCR-to-Gel Master Mix	Amresco	N867	2X PCR-to-Gel Master Mix containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.
10mM dNTP	Amresco	N557
RQ1 RNase-Free DNase	Promega	M6101	Dnase treatment kit.
Gel Loading Dye Orange (6X)	New England BioLabs	B7022S
2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer	ThermoFisherScientific	F531S	2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.
PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase	Agilent Technologies	600670	Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).
RevertAid RT Reverse Transcription Kit	Thermo Fischer	K1691	Used for reverse transcription of mRNA into cDNA synthesis. Kit includes Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.
Pefect size 1Kb ladder	5 Prime	2500360	Molecular weight DNA ladder.
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III	Alpha Innotech		Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel.
Low Molecular Weight Ladder	New England BioLabs	N3233L	Molecular weight DNA ladder.
Vortex Mixer	MidSci	VM-3200
Mini Centrifuge	MidSci	C1008-R
Dry Bath	MidSci	DB-D1
NanoDrop 2000C	ThermoFisherScientific	ND-2000C	Spectrophotometer.
Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System	BioRad	1704469	Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel
PowerPac Basic Power Supply	BioRad	1645050	Power supply for gel electrophoresis.
Agarose	Dot Scientific	AGLE-500
Mastercycler Gradient	Eppendorf	950000015	PCR thermocycler.
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Centrifuge	Eppendorf	5430R
Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System	Promega	A9281
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli cells	ThermoFisherScientific	K280020
MyPCR Preparation Station Mystaire	MidSci	MY-PCR24	Hood dedicated to PCR work.
Hamilton SafeAire II fume hood	ThermoFisherScientific		Fume hood.
Beckman Coulter Z1 Particle Counter	Beckman Coulter	6605698	Particle counter. For counting cells before plating for RNA extraction.
Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0	Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific)		Software to analyze Sanger sequencing data.

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References

Mandel, C., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing. Cell Mol Life Sci. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
Danckwardt, S., Hentze, M., Kulozik, A. 3' end mRNA processing: Molecular mechanisms and implications for health and disease. EMBO J. 27 (3), 482-498 (2008).
Derti, A., et al. A quantitative atlas of polyadenylation in five mammals. Genome Res. 22 (6), 1173-1183 (2012).
Sambrook, J., Russell, D. W. Rapid amplification of 3′ cDNA ends (3′-RACE). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
Masamha, C. P., et al. CFIm25 regulates glutaminase alternative terminal exon definition to modulate miR-23 function. RNA. 22 (6), 830-838 (2016).
Rodu, B. Molecular Biology in Medicine: The polymerase chain reaction: the revolution within. Am J Med Sci. 299 (3), 210-216 (1990).
Bertioli, D. Rapid amplification of cDNA ends. PCR Cloning Protocols: Methods in Molecular Biology. White, B. A. 67, Humana Press. 233-238 (1997).
Freeman, L. A. Cloning full-length transcripts and transcript variants using 5' and 3' RACE. Lipoproteins and Cardiovascular Disease: Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Freeman, L. 1027, Humana Press. 3-17 (2013).
Masamha, C. P., Albrecht, T. R., Wagner, E. J. Discovery and characterization of a novel CCND1/MRCK gene fusion in mantle cell lymphoma. J Hematol Oncol. 9 (1), 1-5 (2016).
Parker, B. C., et al. The tumorigenic FGFR3-TACC3 gene fusion escapes miR-99a regulation in glioblastoma. J Clin Investig. 123 (2), 855-865 (2013).
Prakash, T., et al. Expression of conjoined genes: Another mechanism for gene regulation in eukaryotes. PLOS ONE. 5 (10), e13284 (2010).
Mertens, F., Johansson, B., Fioretos, T., Mitelman, F. The emerging complexity of gene fusions in cancer. Nat Rev Cancer. 15 (6), 371-381 (2015).
Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs. Trends Cell Biol. 26 (3), 227-237 (2016).
International Committee For Standardization In, H., et al. Protocol for evaluation of automated blood cell counters. Clin Lab Haematol. 6 (1), 69-84 (1984).
Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), e2565 (2010).
Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
Curtis, P. C., Thomas, J. L., Phillips, N. R., Roby, R. K. Optimization of primer specific filter metrics for the assessment of mitochondrial DNA sequence data. Mitochondrial DNA. 21 (6), 191-197 (2010).
Letowski, J., Brousseau, R., Masson, L. Designing better probes: Effect of probe size, mismatch position and number on hybridization in DNA oligonucleotide microarrays. J Microbiol Methods. 57 (2), 269-278 (2004).
Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays. Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).
Singh, V. K., Govindarajan, R., Naik, S., Kumar, A. The effect of hairpin structure on PCR amplification efficiency. Mol Biol Today. 1, 67-69 (2000).
Kalle, E., Kubista, M., Rensing, C. Multi-template polymerase chain reaction. Biomol Detect Quant. 2, 11-29 (2014).
Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. The landscape of kinase fusions in cancer. Nat Commun. 5, 4846 (2014).

Adaptation de 3' Amplification rapide des ADNc se termine pour mapper les transcriptions en Cancer

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Masamha, C. P., Todd, Z. Adapting 3' … More

Masamha, C. P., Todd, Z. Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer. J. Vis. Exp. (133), e57318, doi:10.3791/57318 (2018).

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