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Genetics

Adattamento 3' amplificazione veloce di CDNA finisce per mappare le trascrizioni in cancro

Published: March 28, 2018 doi: 10.3791/57318
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy and Health Sciences, Butler University

Summary

I due diversi 3' amplificazione veloce delle estremità del cDNA (3' gara) protocolli descritto qui fanno uso di due diversi DNA polimerasi per mappare sequenze che includono un segmento dell'open reading frame (ORF), il codone di arresto e l'intero regione 3' UTR di una trascrizione usando RNA ottenute da linee cellulari tumorali differenti.

Abstract

Maturazione degli mRNA eucariotico coinvolge 3' fine formazione, che prevede l'aggiunta di una coda di poli (a). Al fine di mappare il 3' estremità di un gene, il tradizionale metodo di scelta è 3' amplificazione veloce delle estremità del cDNA (3' gara). Protocolli per 3' gara richiedono l'attenta progettazione e selezione degli iniettori annidati all'interno di regione 3' non tradotta (3' UTR) del gene target di interesse. Tuttavia, con alcune modifiche il protocollo può essere utilizzato per includere l'intera regione 3' UTR e sequenze all'interno l'open reading frame (ORF), fornendo un quadro più completo del rapporto tra l'ORF e 3' UTR. Ciò è oltre alla identificazione del segnale poliadenilazione (PAS), così come il sito di clivaggio e poliadenilazione fornito dai convenzionali 3' gara. Espanso 3' gara in grado di rilevare insolito 3' UTR, tra cui fusioni del gene all'interno di 3' UTR, e le informazioni di sequenza possono essere utilizzate per prevedere i potenziali siti di legame di miRNA così come AU ricca destabilizzare gli elementi che possono influenzare la stabilità della trascrizione.

Introduction

La formazione dell'estremità 3' è un passo fondamentale nella maturazione di mRNA che comprende il clivaggio del pre-mRNA a valle di un PAS seguita dall'aggiunta di ~ 250 tipo adenine, che compongono la coda di poli (a)1,2. La proteina legante il poli (a) (PABP) si lega alla coda di poli (a), e questo protegge la trascrizione di mRNA da degradazione e facilita la traduzione1.

Le stime attuali suggeriscono che il 70% dei geni umani hanno passaggio multiplo e quindi sono sottoposti ad poliadenilazione alternativa, con conseguente più 3' estremità3. Pertanto, è importante identificare dove la coda di poli (a) si attacca al resto del 3' UTR, nonché a identificare il PAS utilizzato da qualsiasi trascrizione dato. L'avvento di sequenziatori di ultima generazione ha provocato l'identificazione simultanea del 3' UTR e il passaggio di migliaia di geni. Questo aumento della capacità di sequenziamento ha richiesto lo sviluppo di algoritmi bioinformatici per analizzare i dati che coinvolgono poliadenilazione alternativa dell'estremità 3'. Per l'individuazione del de novo o la convalida della PAS e quindi mapping dell'estremità 3' dei singoli geni da dati di sequenziamento su larga scala, 3' gara rimane il metodo di scelta4,5. Le sequenze incluse nei prodotti di cDNA di 3' gara normalmente includono solo una parte del 3' UTR che contiene la coda di poli (a), il luogo di fenditura, la PAS e le sequenze a Monte della PAS. A differenza di PCR, che richiede la progettazione e la scelta del gene specifico primer forward e reverse, 3' gara richiede solo due primers gene nidificati specifici in avanti. Quindi, la PCR richiede una conoscenza più dettagliata della sequenza del nucleotide di una grande regione del gene di essere amplificato4,6. Dato che 3' gara utilizza lo stesso reverse primer che obiettivi il poli (a) di coda per tutte le trascrizioni di poliadenilazione RNA, solo i primer in avanti devono essere gene specifico, così, solo che richiedono la conoscenza di una regione significativamente più piccola del mRNA. In questo modo l'amplificazione delle regioni in cui le sequenze non sono completamente caratterizzato4,7. Questo ha permesso 3' gara per essere utilizzato non solo per determinare l'estremità 3' del gene, ma a anche determinare e caratterizzare grandi regioni a Monte della PAS che formano una parte significativa del 3' UTR. Combinando 5' corsa con modificate 3' gara che comprende porzioni più grandi di 3' UTR e regioni fiancheggianti, è possibile completamente di sequenza o clonare un'intero trascrizione di mRNA dall'estremità 5' alla sua 3' estremità8.

Un esempio di questa applicazione di modificate 3' gara è la recente identificazione di un romanzo di trascrizione del gene CCND1-MRCK fusione da linee cellulari di linfoma a cellule mantellari e malati di cancro. 3' UTR ha consistito di sequenze di geni MRCK sia il CCND1 ed era ricalcitrante a miRNA regolamento9. I due nidificati CCND1 avanti primers specifici erano complementari alla regione immediatamente adiacente e a valle del codone di arresto di CCND1 . Anche se l'intero trascrittoma sequenziazione insieme strumenti bioinformatici specifico può essere utilizzato per rilevare le fusioni del gene entro i 3' UTR10, molti laboratori potrebbero mancare le risorse finanziarie o perizia di bioinformatica per fare uso di questa tecnologia. Quindi, 3' gara è un'alternativa per de novo identificazione e validazione di geni di fusione romanzo che coinvolge il regione 3' UTR. Considerando il drastico aumento del numero di geni di fusione segnalati nonché a leggere attraverso le trascrizioni, 3' gara è diventata un potente strumento nella caratterizzazione genica sequenze11,12. Inoltre, recenti studi hanno dimostrato che diverse sequenze all'interno di 3' UTR, nonché la lunghezza del 3' UTR può influenzare la stabilità di trascrizione mRNA, la localizzazione, la traducibilità e funzione13. Dovuto in parte a un crescente interesse nella mappatura del transcriptome, c'è stato un aumento del numero di differenti polimerasi del DNA in fase di sviluppo per l'utilizzo in laboratorio. È importante determinare quali tipi di modifiche possono essere reso a 3' protocollo di gara in ordine di utilizzare il repertorio disponibile di polimerasi del DNA.

Questo lavoro rapporti adattandosi 3' gara per mappare l'intero regione 3' UTR, la PAS e il sito di clivaggio estremità 3' della trascrizione ANKHD1 utilizzando nidificati Primer all'interno della sezione di ANKHD1 della trascrizione e due diversi DNA polimerasi.

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Protocol

Indossare un camice da laboratorio, guanti e occhiali di sicurezza in ogni momento durante l'esecuzione di tutte le procedure in questo protocollo. Assicurarsi che i contenitori/provette contenenti il reagente di fenolo e guanidina isotiocianato sono aperti solo in un cappuccio certificata e smaltire i rifiuti di fenolo in un contenitore designato. Utilizzare i reagenti, i suggerimenti e privo di DNasi e RNasi provette sterili.

1. coltura cellulare

  1. Crescere la linea delle cellule HeLa e due sospensioni mantello cella linee cellulari di linfoma, Granta-519 e Jeko-1, in DMEM contenente 10% FBS e 100 U/mL di penicillina/streptomicina in un incubatore con 5% CO2 a 37 ° C. Diluire le celle 01:10 e contare utilizzando un contatore di particelle14.
  2. Per l'estrazione di RNA, piastra 500.000 cellule/pozzetto in un piatto ben 6 (media di 2 mL per pozzetto). Dopo incubazione per 24 h, raccogliere RNA dalle cellule.

2. estrazione del RNA

  1. Raccolta delle cellule
    Nota: Fatta eccezione per la fase di centrifugazione, eseguire tutti i passaggi elencati in una cappa di coltura del tessuto per mantenere la sterilità.
    1. Per cellule in sospensione (Jeko-1 e Granta-519):
      1. Trasferire le cellule (insieme con 2 mL di terreno) in una provetta da 15 mL e centrifugare a 1.725 x g per 5 min, aspirato i media e lasciare il pellet cellulare nella parte inferiore del tubo.
      2. Risospendere il pellet cellulare in 50 µ l di tampone fosfato salino (PBS): 1x. Aggiungere 500 µ l di reagente di isotiocianato di fenolo e guanidina monofasica a ciascun campione nel tubo per microcentrifuga da 1,5 mL. Mescolare bene e lasciare a temperatura ambiente (TA) per 5 min mentre invertendo il tubo del microcentrifuge ogni 1 min.
    2. Per le celle aderenti (HeLa):
      1. Aspirare il terreno di coltura delle cellule da ciascun pozzetto. Aggiungere 1 mL di PBS in ciascun pozzetto per lavare via i detriti.
      2. Rimuovere il PBS e aggiungere 500 µ l di reagente di isotiocianato di fenolo e guanidina monofasica ad ogni pozzetto.
      3. Incubare per 5 minuti con dolce dondolo a RT. Trasferire in una provetta di microcentrifuga da 1,5 mL.
  2. Lisi delle cellule
    1. Congelare il fenolo e guanidina isotiocianato miscela di cella a-20 ° C per 1 h.
      Nota: Il mix può essere lasciato a-20 ° C durante la notte o fino a quando necessario.
    2. Scongelare il fenolo e guanidina isotiocianato miscela di cella sul ghiaccio. Aggiungere 100 µ l di cloroformio al tubo del microcentrifuge in una cappa PCR. Vortexare il campione per 10-15 s fino a quando la miscela è rosa e opaco. Incubare il campione in ghiaccio (a 4 ° C) per 15 minuti.
    3. Centrifugare il campione per 15 min a 20.800 x g e a 4 ° C. Rimuovere con cautela la fase acquosa incolore superiore (~ 200 µ l) e il trasferimento ad un nuovo tubo per microcentrifuga da 1,5 mL.
  3. Precipitazione di RNA
    1. Aggiungere un volume equivalente di isopropanolo per ogni campione. Aggiungere 1 µ l di coprecipitant (vedere Tabella materiali) per ogni campione per agire come un elemento portante per il RNA e aiutano a visualizzare il RNA nei passaggi successivi. Incubare il campione a-80 ° C per almeno 4 ore. Per risultati ottimali, incubare per una notte a-80 ° C.
    2. Trasferire il campione ad una centrifuga refrigerata. Centrifuga per 35 min a 20.800 x g / 4 ° C; il RNA apparirà come un puntino blu sulla parte inferiore del tubo. Rimuovere con cautela l'isopropanolo dal campione. Aggiungere 500 µ l di etanolo di 80% e risospendere il pellet brevemente nel Vortex per 3 s.
    3. Centrifugare il campione a 20.800 x g a RT per 5 min. rimuovere tutto l'etanolo dall'esempio. Lasciate che il campione asciugare all'aria per circa 10 min. Risospendere il campione in 35 µ l di acqua RNAsi-libera. Posto su un blocco di calore (65 ° C) per 5 min garantire che il RNA è completamente in soluzione e collocare immediatamente il tubo sul ghiaccio.
    4. Determinare la concentrazione di RNA totale usando uno spettrofotometro come precedentemente descritto, tranne usare 1,5 µ l del campione di RNA invece di 1 µ l15. Facoltativamente, eseguire 1 µ g di RNA totale su un gel di agarosio all'1% per determinare l'integrità del RNA.

3. trattamento dnasi

  1. Dopo la quantificazione del RNA, eseguire dnasi trattamento sul RNA totale di degradare qualsiasi DNA genomic. Per ogni campione, è necessario aggiungere i seguenti reagenti dal kit di dnasi RNAsi-libera per fare una reazione totale di 20 µ l della miscela in una provetta da microcentrifuga separati:
    1. Mescolare 2 µ l di dnasi 10 X tampone di reazione con 4,4 µ g di RNA totale. Portare ad un totale di 14 µ l con acqua.
    2. Aggiungere 2 µ l di dnasi RNAsi-libera. Incubare a 37 ° C per 30 min in presenza di 2 µ l di inibitore di RNAsi (dal Kit di trascrizione inversa).
    3. Aggiungere 2 µ l di soluzione bloccante e calore su un blocco di calore per 10 min a 70 ° C per inattivare l'enzima dnasi.
      Nota: Trattamento della dnasi è facoltativo.

4. sintesi del cDNA

Per un volume di reazione finale di 50 µ l:

  1. Per un volume di reazione finale di 50 µ l: trasferimento 22 µ l della dnasi trattati RNA in un nuovo tubo, o trasferimento 4 µ g di RNA totale con aggiunta di acqua ad un volume totale di 22 µ l in una nuova provetta. Aggiungere 2 µ l di primer T7 oligo dT25 da 10 µM primer soluzione. La sequenza per il primer di T7 oligo dT25 è 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'.
  2. Dal kit di trascrizione inversa aggiungere 2 µ l dell'inibitore di RNAsi (20 U / µ l), 8 µ l di tampone di reazione di 5x, 4 µ l di 10 mM dNTPs e 2 µ l della trascrittasi inversa (200 U / µ l).
    Nota: Impostare una reazione senza trascrittasi inversa ad agire come controllo negativo.
  3. Incubare a 42 ° C per 1 h. trasferimento direttamente al ghiaccio. Riscaldare il tubo a 75 ° C per 5 min e posizionare il tubo sul ghiaccio.

5. ricerca primer per la trascrizione del Gene di fusione

  1. Disegno dell'iniettore
    1. Scarica la sequenza del cDNA dal browser genoma Ensemble (ENST00000360839.6/NM_017747) e identificare una regione all'interno del ORF della trascrizione destinazione (ANKHD1) a Monte del codone di arresto. Copiare e incollare l'intera regione (fino a 700 nucleotidi) che contengono le sequenze a Monte del codone di stop nella regione voce sequenza del software di progettazione primer (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>).
    2. Selezionare l'opzione di design personalizzato Visualizza e selezionare 10 per il numero degli iniettori che il sistema deve generare (risultati da restituire) e lasciare tutti gli altri parametri impostati di default.
    3. Scegliere cinque primer in avanti e due iniettori d'inversione che non si sovrappongono. Ordine di primer e ricostituire con RNAsi/dnasi-libera di acqua ad una concentrazione finale di 10 µM. Maggiori dettagli circa il disegno di primer universali per la PCR sono trattate altrove16.
  2. PCR per identificare potenziali primer per l'utilizzo in successive 3' gara
    Nota: Per determinare i primer forward finali da utilizzare nella reazione, test i primer progettati impostando combinazioni diverse di forward e reverse primer per PCR regolari in una cappa PCR.
    1. Trasferire il cDNA (2 µ l) in una provetta PCR fresca 0,5 mL. Aggiungere 1 µ l di primer in avanti e 1 µ l di primer inverso (da una soluzione di primer 10 mM). Fai fino a 12,5 µ l aggiungendo 8,5 µ l di acqua priva di nucleasi. Aggiungere 12,5 µ l di 2x Gel di PCR Master Mix.
    2. Utilizzare le seguenti condizioni di ciclismo termiche PCR: 95 ° C per 2 min seguita da 29 cicli di 95 ° C per 30 s, 60 ° C per 30 s e 72 ° C per 1 min. impostare il ciclo finale a 68 ° C per 7 min.
    3. Dopo la PCR, è necessario eseguire i prodotti su un gel di agarosio 1% colorato con bromuro di etidio. Dettagli dell'elettroforesi sono come precedentemente descritto con poche modifiche17.
      1. Sciogliere 1 g di agarosio in 100 mL di tampone Tris-acetato (TAE) in un pallone da 250 mL. Fate bollire in un forno a microonde.
      2. Lasciare raffreddare per 1 min e aggiungere 7,5 µ l di soluzione di bromuro di etidio (10 mg/mL di brodo) in una cappa aspirante. Miscelare bene agitando la beuta e versare in un apparato di gel orizzontale. Lasciare la RT nella cappa fumi per almeno 30 minuti consentire il gel a solidificare.
      3. Coprire il gel con 1 tampone di x TAE e caricare 10 µ l di prodotto PCR su gel di agarosio insieme a 3-5 µ l della scala di peso molecolare di DNA. Eseguire a 175 V per 10 min. visualizzare i prodotti che utilizzano un dispositivo di imaging e se è necessaria una ulteriore separazione di prodotti, eseguire il gel per altri 5-10 min.
  3. Selezione degli iniettori annidati per 3' gara
    1. Analizzare i risultati del gel dell'agarosi PCR per selezionare gli iniettori che hanno una banda PCR distinta, forte e unica. Utilizzare il primer 5'-la maggior parte (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3') insieme con il primer di25 T7 oligodT nella PCR prima eseguire.
    2. Selezionare il primer nidificato che si trova a valle del primo iniettore (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3') e utilizzarlo con il primer di T7 (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3') nel secondo set di reazioni di PCR.

6. ottimizzazione del 3' gara per mappare il regione 3' UTR utilizzando due diversi enzimi

Nota: C'è stato un aumento nella diversità delle polimerasi del DNA usato per la PCR; Pertanto, abbiamo voluto determinare condizioni standard che possono essere applicate anche quando si utilizzano diversi enzimi per 3' reazioni di PCR di gara. Iniettori d'inversione per qualsiasi trascrizione vengono mantenuti costanti; le uniche modifiche sono nei primer forward nidificati che sono specifici per la trascrizione di destinazione.

  1. Protocollo 1:3 ' gara utilizzando una DNA polimerasi modificata da Pyrococcus furiosus (Pfu)
    1. Prima PCR
      1. Trasferire 1 µ l di cDNA in una provetta PCR e aggiungere 5 µ l di tampone di reazione Pfu x 10. Aggiungere 1 µ l di primo iniettore avanti nidificato, 1 µ l di primer T7 oligodT25 e 1 µ l di dNTP (da una soluzione di 10 mM).
      2. Fai fino a 49 µ l di volume totale aggiungendo 40 µ l di acqua. Aggiungere 1 µ l di Pfu DNA polimerasi e mescolare bene. Eseguire la PCR utilizzando il profilo PCR nella tabella 1.
    2. Seconda PCR
      1. Trasferire 2 µ l dei prodotti di PCR prima ad un nuovo tubo PCR e mescolare con 5 µ l di tampone di reazione di Ultra II di Pfux 10. Aggiungere 1 µ l di primer PCR annidato secondo, 1 µ l di primer T7 e 1 µ l di dNTP (soluzione di 10 mM).
      2. Fai fino a 49 µ l di reazione totale aggiungendo 39 µ l di acqua. Aggiungere 1 µ l di Pfu DNA polimerasi. Eseguire la PCR utilizzando lo stesso profilo PCR come la prima installazione PCR (tabella 1).
  2. Protocollo 2:3 ' gara utilizzando una DNA polimerasi chimerica costituito da un dominio di legame del DNA fuso a un Pyrococcus-come correzione di bozze mix master di polimerasi PCR
    1. Prima PCR
      1. Trasferire 1 µ l di cDNA in una provetta PCR. Aggiungere 1 µ l di primo iniettore nidificato in avanti e 1 µ l di primer T7 oligodT25 . Fai fino a 25 µ l aggiungendo 22 µ l di acqua.
      2. Aggiungere 25 µ l di Master Mix PCR: 2x e mescolare bene. Utilizzare la PCR ciclismo condizioni descritte nella tabella 2.
    2. Seconda PCR
      1. Trasferire 2 µ l dei prodotti di PCR prima ad un nuovo tubo PCR. Aggiungere 1 µ l di primer PCR nidificati secondo insieme con 1 µ l di primer reverse T7.
      2. Fai fino a 25 µ l aggiungendo 22 µ l di acqua. Aggiungere 25 µ l di 2x PCR Master Mix. Eseguire la PCR utilizzando lo stesso profilo PCR come la prima installazione PCR (tabella 2).

7. verificare il secondo prodotto PCR di 3' gara.

  1. Prendere 5-10 µ l di prodotto di PCR secondo (come prodotto dal primo turno di PCRs se la trascrizione è abbondantemente espresso) ed eseguire su un gel di agarosio. Impostare il gel ed eseguire l'elettroforesi come descritto in precedenza (passaggi 5.2.3.1 a 5.2.3.3). Visualizzare i risultati su un dispositivo di imaging.

8. sequenziamento e purificazione del prodotto

  1. Purificare i prodotti PCR di gel dalla seconda PCR usando il Gel e sistema di Clean-Up di PCR frammento del DNA secondo il protocollo del produttore.
  2. Eseguire Sanger sequenziamento (in alternativa, inviare il gel purificata campioni di prodotto PCR e primer di sequenziamento appropriato ad un laboratorio di sequenziamento). Analizzare i dati di sequenziamento dopo Sanger sequenziamento.
  3. Scarica il software di analisi di sequenza (Vedi Tabella materiali) e importare i file di traccia nel software. Utilizzare il QVs individuali di Base pura (valori di qualità) per ottenere la Base chiamata informazioni18. Scarica il cromatogramma con tracce di alta qualità per la visualizzazione.
    Facoltativo: Il gel prodotto purificato può essere clonato utilizzando un apposito kit di clonazione e i cloni isolati inviati per Sanger sequenziamento.

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Representative Results

Ricerca nidificata Forward Primer:

Il gel di agarosio da La figura 1 Mostra due distinti prodotti di gel PCR (corsie 1 e 2) che utilizzano lo stesso forward primer ma diversi iniettori d'inversione. Lane 3 ha un prodotto PCR distinto e ha un distinto primer forward e reverse. I primer ideali da utilizzare per la reazione di PCR di base sono quelli che danno un prodotto di PCR distinto (Lane 3). Il forward primer utilizzato nelle corsie 1 e 2 dà la band più forte e dà i più grandi prodotti di PCR (previsti) e viene utilizzato come il primo iniettore in avanti. Il secondo primer nidificati per il secondo set di reazioni di PCR in 3' gara è il primer forward da Lane 3.

Polimerasi del DNA diversi utilizzati in 3' gara produrre risultati simili:

Due diversi DNA polimerasi prodotto gli stessi prodotti PCR dimensioni pur avendo diverse condizioni PCR in bicicletta per 3' gara (Figura 2). C'è solo una banda distinta per il prodotto PCR previsto. Tutti di meno della trascrittasi inversa controlli negativi (-) non hanno una band, non mostrando nessuna contaminazione genomica del RNA utilizzato nella sintesi di cDNA così come nelle successive reazioni a valle.

Risultati di sequenziamento Sanger:

I prodotti PCR sono stati gel purificato e inviato per Sanger sequenziamento. I risultati mostrati in Figura 3A mostrano una porzione di un cromatografo di sequenza da Sanger sequenziamento. Una sequenza rappresentativa identifica la posizione del codone di stop, segnale di poliadenilazione putativo e il sito di clivaggio, come pure il poly (A) coda nel prodotto RACE 3' (Figura 3B).

Figure 1
Figura 1: identificazione di due primer avanti specifici di gene nidificati da utilizzare in gara 3'. Indicato è un esempio dei prodotti di PCR da diverse combinazioni del gene specifico in avanti ed iniettori d'inversione, usando il cDNA di HeLa eseguire su un bromuro di etidio macchiato del gel dell'agarosi con la scala di peso molecolare (mw). Corsie 1 e 2 sono i prodotti di PCR dal primer forward specifico di gene stesso ma diversi iniettori d'inversione. Le frecce indicano il prodotto PCR previsto per ogni corsia. Oltre la band per il prodotto PCR previsto, vi è una banda aggiuntiva. Il singolo prodotto di PCR in Lane 3 è da un primer differenti del gene specifico nidificato in avanti e retromarcia e Mostra la singola banda prevista.

Figure 2
Figura 2: verifica dei 3' gara prodotti dal secondo set di reazioni di PCR. Prodotti dalla seconda reazione di PCR con la polimerasi di DNA chimerico (B) e (A) Pfu DNA polimerasi sono stati eseguiti su un gel di agarosio con etidio bromuro. Corsie raffigurate da (-) sono dal campione di controllo negativo per ogni linea cellulare quando sintesi di cDNA da RNA è stato effettuato in assenza dell'enzima trascrittasi inversa. Corsie 1 e 2 sono i prodotti di PCR da replicati biologici di ogni linea cellulare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: i prodotti di PCR di 3' gara di Mapping. (A), A parte di un cromatogramma di sequenza di un gel purificato 3' gara prodotto mostrando il segnale di poliadenilazione previsto e la posizione della coda di poli (a). (B) rappresentante sequenze da dati di sequenziamento Sanger mostrando il codone di stop, il segnale di poliadenilazione (PAS), il sito di clivaggio e l'attaccamento della coda poli (a), nonché una sezione delle sequenze di coda di poli (A). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Passaggio di ciclo Temperatura e durata Numero di cicli
Denaturazione iniziale 95 ° C per 3 min 1
Iniziale di ricottura e di estensione 50 ° C per 5 min e 72 ° C per 10 min 1
Subcyles (denaturazione, ricottura ed estensione) 95 ° C per 40 s, 50 ° C per 1 min e 72 ° C per 3 min 20
Ultimo ciclo (denaturazione, ricottura ed estensione) 95 ° C per 40 s, 50 ° C per 1 min e 72 ° C per 15 min 1
Tenere premuto 4 ° C, ∞

Tabella 1: Pfu DNA polimerasi in bicicletta di PCR per 3' gara.

Passaggio di ciclo Temperatura e durata Numero di cicli
Denaturazione iniziale 98 ° C per 3 min 1
Iniziale di ricottura e di estensione 50 ° C per 5 min e 72 ° C per 10 min 1
Subcyles (denaturazione, ricottura ed estensione) 98 ° C per 30 s, 50 ° C per 1 min e 72 ° C per 4 min 20
Ultimo ciclo (denaturazione, ricottura ed estensione) 98 ° C per 30 s, 50 ° C per 1 min e 72 ° C per 15 min 1
Tenere premuto 4 ° C, ∞

Tabella 2: Chimerico DNA polimerasi PCR ciclismo condizioni.

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Discussion

Nonostante l'avvento delle tecnologie di sequenziamento massivo parallelo, su una base di gene di gene, 3' gara rimane ancora il metodo più facile ed economico per identificare la PAS e nucleotidi adiacenti per la coda di poli (a). L'adattamento qui descritto si espande con 3' gara per amplificare sia mappa sequenze che includono una parte di ORF, il codone di arresto e l'intero regione 3' UTR della trascrizione del mRNA di ANKHD1 . Dei principali vantaggi di 3' gara è che con pochi piccoli adattamenti, prodotti da 3' gara possono essere clonati in altri vettori per facilitare interrogatorio a valle di 3' UTR funzione che includono miRNA targeting, analisi di stabilità, così come altri test meccanicistico. Questo può essere fatto includendo degli enzimi di limitazione siti entro i9,di sequenze nidificate primer10. Possono effettuare regolazioni per includere solo il 3' UTR senza alcuna sequenza da ORF per clonazione per 3' UTR saggi funzionali5.

Un elemento determinante del successo di 3' gara è lo sviluppo degli iniettori annidati che il gene di interesse di destinazione. Le sequenze di cDNA dal browser genoma Ensembl sono raccomandate per meglio identificare le aree senza polimorfismi al fine di sviluppare primer ottimale. Idealmente, parecchi annidati in avanti il primer così come almeno due iniettori d'inversione all'interno del gene di interesse possono essere sottoposti a screening utilizzando standard di PCR per identificare i primers specifici per due nidificati gene migliori da utilizzare. In questo studio il primo iniettore avanti specifico gene inizialmente selezionato per 3' gara ha dato due bande con PCR standard abitualmente utilizzati in laboratorio. Purtroppo, il disegno di primer è stato limitato dal numero significativo di SNPs nella trascrizione di interesse. SNPs nella trascrizione di destinazione portano alla mancata corrispondenza tra il primer e la destinazione, che può portare a ricottura inefficiente e amplificazione e dovrebbe essere ridotto ad un minimo di19. La presenza di almeno quattro SNPs in un iniettore o il verificarsi di una combinazione di cinque mismatch (tre in uno primer e due in altro) può provocare l'inibizione completa della reazione PCR, e quindi l'unica opzione è quello di progettare più primer20. Invece di progettare più primer per ottenere una singola banda per lo standard che PCR utilizzata per la ricerca di primer in esperimenti riportati qui, le condizioni PCR in bicicletta e la polimerasi del DNA utilizzati successivamente in 3' gara sono stati alterati al fine di ottimizzare la probabilità di ottenere una banda specifica. La temperatura di denaturazione è stata aumentata a 98 ° C per una delle polimerasi del DNA (un aumento da 95 ° C utilizzato nella ricerca primer). Per entrambi polimerasi del DNA usate nel 3' RACE PCR, la durata di denaturazione iniziale è stato aumentato a 3 min invece la raccomandata 30 s a 2 min al fine di snaturare completamente il modello di cDNA. Il primer di T7 oligo dT25 ad esempio è preveduto per potenzialmente forma debole strutture secondarie, che possono ridurre la disponibilità di primer21. Aumentando la lunghezza di denaturazione iniziale e la temperatura si rompe qualsiasi strutture secondarie e aiuta a produrre la singola banda specifica dopo il ciclo finale di 3' gara. Inoltre, la band non specifico era più leggera rispetto le bande previste, suggerendo che è apparso a cicli PCR più elevati (fino a 35 cicli); limitare i cicli PCR per solo 20 riduce l'amplificazione della band non specifici.

Un altro potenziale di 3' gara, come altre reazioni di PCR basata, è incompleta amplificazione di destinazione regione22. Quindi, per entrambi gli enzimi termofili la temperatura di annealing iniziale è stata fissata a 50 ° C per 5 min ottimizzare la ricottura degli iniettori alla destinazione e questa è stata seguita da una temperatura iniziale estensione a 72 ° C per 10 min. L'ultimo ciclo PCR per ogni enzima ha un tempo di estensione finale di 15 min a 72 ° C. Procedura di estensione era più lunga di quelli raccomandati dai produttori delle polimerasi del DNA. Il passo lungo extension (allungamento) permette sintesi completa degli ampliconi incompleta, consentendo la piena estensione dell'amplificazione iniziale e finale prodotti16.

Passaggi PCR che si verificano in 3' gara sono altamente sensibili, così essi possono rilevare DNA genomic (o altra contaminazione di DNA) invece la trascrizione di mRNA bersaglio, con conseguente parecchie fasce imprevisti sui gel22. Un modo per prevenire la contaminazione è quello di eseguire il lavoro PCR in un cappuccio PCR dedicato, indossare i guanti e utilizzare reagenti puliti e sterilizzato nell'autoclave provette sterili e puntali per pipette. Nella normale PCR, primer forward e reverse può essere progettato in modo sono situati su diversi esoni (attraverso gli iniettori introne); in questo modo, un prodotto PCR anormalmente grande indicherebbe che una regione contenente un introne è stata amplificata. Tuttavia, questo potrebbe non essere sempre fattibile nel caso in cui solo il 3' UTR sequenza, che si trova all'interno dell'esone terminale stesso, è la destinazione per 3' amplificazione gara. In alternativa, il RNA può essere pre-trattato con enzima dnasi prima sintesi del cDNA. L'uso del primer T7 oligo dT25 per innescare la reazione della trascrittasi inversa invece di una hexanucleotide casuale per prima sintesi del cDNA di filo da RNA diminuisce anche l'amplificazione dei prodotti genomici. Ultimo ma non meno importante, creazione di un controllo negativo (il "–" corsie nella Figura 2), dove la sintesi del cDNA sono impostato in assenza della trascrittasi inversa è altamente raccomandato. Il controllo è sottoposto a passi identici agli altri esempi nelle procedure di gara successivi 3'. La presenza di una banda in questo controllo significa potenziale contaminazione di DNA genomico.

Nonostante le sfide di cui sopra, 3' gara è un potente strumento di mappatura 3' estremità su una base di singolo gene. L'avvento della tecnologia di prossima generazione ha portato ad un aumento nel repertorio di trascrizioni che hanno alternative 3' estremità risultanti da poliadenilazione alternativa, che può o non può comportare lo splicing alternativo. Per aggiungere la complessità, in cellule tumorali, le riorganizzazioni cromosomiche sono frequenti e possono provocare gene oncogeno fusione prodotti23. La fusione tra i due geni può comportare la ORF o, in alcuni casi, coinvolgono solo sequenze entro i 3' UTR9,10. Inoltre, ci sono anche gemelli conjoined/co-transcribed geni, che sono trascritti contemporaneamente, ma possono essere tradotto in proteine differenti11. 3' gara può essere adattata per mappare ogni queste trascrizioni uniche, anormale, nonché trascrizioni normale. Questo è importante perché queste trascrizioni anormale possono finire per servire come biomarcatori specifici di malattia o bersagli farmacologici specifici, ad esempio, il gene di fusione BCR-ABL1 nel cancro è destinato il farmaco Imatinib.

3' gara è quindi una tecnica estremamente versatile che può essere utilizzata per amplificare le trascrizioni normale, identificare romanzo 3' UTR e fusioni del gene romanzo entro il 3' UTR5,9. In questo rapporto, 3' gara è stata usata per amplificare e mappare il codone di stop, la PAS e l'intero regione 3' UTR della trascrizione ANKHD1 utilizzando diversi DNA polimerasi. L'approccio descritto può essere utilizzato per eseguire il mapping all'estremità 3' di qualsiasi trascrizione di poliadenilazione.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Vorremmo riconoscere Bettine Gibbs per il suo aiuto tecnico.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HeLa cells ATCC CCL-2 Cervical cancer cell line.
Jeko-1 cells ATCC CRL-3006 Mantle cell lymphoma cell line.
Granta-519 cells DSMZ ACC-342 Mantle cell lymphoma cell line.
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F6178 Fetal bovine serum for cell culture.
Penicillin/Streptomycin ThermoFisherScientific 15140122 Antibiotic and antimycotic.
GlycoBlue Ambion AM9545 Coprecipitant.
DMEM ThermoFisherScientific 10569044 Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.
Nuclease Free-Water ThermoFisherScientific AM9938 Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution Corning 21-030 1X PBS.
Chloroform Sigma  Aldrich C7559-5VL
2-propanol Sigma Aldrich I9516
Reagent Alcohol Sigma Aldrich 793175 Ethanol
Ethidium Bromide solution Sigma Aldrich E1510
TRIzol Reagent ThermoFisherScientific 15596026 Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.
2X Extender PCR-to-Gel Master Mix Amresco N867 2X PCR-to-Gel Master Mix  containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.
10mM dNTP Amresco N557
RQ1 RNase-Free DNase Promega M6101 Dnase treatment kit.
Gel Loading Dye Orange (6X) New England BioLabs B7022S
2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer ThermoFisherScientific F531S 2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.
PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase Agilent Technologies 600670 Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).
RevertAid RT Reverse Transcription Kit Thermo Fischer K1691 Used for  reverse transcription of mRNA into  cDNA synthesis. Kit includes  Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.
Pefect size 1Kb ladder 5 Prime 2500360 Molecular weight DNA ladder.
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III Alpha Innotech Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel.
Low Molecular Weight Ladder New England BioLabs N3233L Molecular weight DNA ladder.
Vortex Mixer MidSci VM-3200
Mini Centrifuge MidSci C1008-R
Dry Bath MidSci DB-D1
NanoDrop 2000C ThermoFisherScientific ND-2000C Spectrophotometer.
Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System BioRad 1704469 Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel
PowerPac Basic Power Supply BioRad 1645050 Power supply for gel electrophoresis.
Agarose Dot Scientific AGLE-500
Mastercycler Gradient Eppendorf 950000015 PCR thermocycler.
Centrifuge Eppendorf 5810 R
Centrifuge Eppendorf 5430R
Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System Promega A9281
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot  TOP10 Chemically Competent E. coli cells ThermoFisherScientific K280020
MyPCR Preparation Station Mystaire MidSci MY-PCR24 Hood dedicated to PCR work.
Hamilton SafeAire II fume hood ThermoFisherScientific Fume hood.
Beckman Coulter Z1 Particle Counter Beckman Coulter 6605698 Particle counter. For counting cells before plating  for RNA extraction.
Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0 Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific) Software to analyze Sanger sequencing data.

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References

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Genetica problema 133 trascrizioni estremità 3' 3' amplificazione veloce delle estremità del cDNA (3' gara) reazione a catena della polimerasi segnale di poliadenilazione (PAS) poliadenilazione
Adattamento 3' amplificazione veloce di CDNA finisce per mappare le trascrizioni in cancro
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Masamha, C. P., Todd, Z. Adapting 3' … More

Masamha, C. P., Todd, Z. Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer. J. Vis. Exp. (133), e57318, doi:10.3791/57318 (2018).

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