De to forskellige 3′ hurtige forstærkning af cDNA ender (3′ RACE) protokoller beskrevet her gøre brug af to forskellige DNA polymeraser til at knytte sekvenser, der omfatter et segment af åben behandling ramme (ORF), stop-codon og den hele 3′ UTR af et udskrift ved hjælp af RNA fremstillet af forskellige kræft cellelinjer.
Modning af eukaryote mRNAs indebærer 3′ enden dannelse, som omfatter tilføjelse af en poly(A) hale. For at kortlægge 3′ enden af et gen, er den traditionelle metode til valg 3′ hurtige forstærkning af cDNA ender (3′ RACE). Protokoller for 3′ RACE kræver omhyggelige design og valg af indlejrede primere i den 3′ utranslaterede region (3′ UTR) target-gen af interesse. Dog med et par ændringer kan til protokollen bruges til at omfatte hele 3′ UTR og sekvenser i åben læsning rammen (ORF), giver et mere omfattende billede af forholdet mellem ORF og 3′ UTR. Dette er ud over identifikation af polyadenylation signalet (PAS), og på spaltning og polyadenylation webstedet leveres af konventionelle 3′ RACE. Udvidet 3′ RACE kan opdage usædvanlige 3′ UTRs, herunder gen fusioner inden for 3′ UTR, og sekvensen oplysninger kan bruges til at forudsige potentielle miRNA bindingssteder samt AU rige destabiliserende elementer, der kan påvirke stabiliteten i afskriften.
Dannelsen af 3′-enden er et kritisk skridt i mRNA modning, der omfatter kløvningen af pre-mRNA nedstrøms for et PAS, efterfulgt af tilsætning af ~ 250 untemplated adenines, som udgør poly(A) hale1,2. Poly(A) bindende protein (PABP) bindes til poly(A) hale, og dette beskytter mRNA udskrift fra nedbrydning, og letter oversættelse1.
Aktuelle skøn viser, at 70% af menneskelige gener har flere PASs, og således gennemgår alternative polyadenylation, hvilket resulterer i flere 3′ ender3. Det er således vigtigt at identificere hvor poly(A) hale tillægger resten af 3′ UTR, samt identificere de PAS, anvendes af enhver given udskrift. Fremkomsten af næste generation sequencing har resulteret i den samtidige identifikation af 3′ UTRs og PASs af tusindvis af gener. Denne stigning i sekventering kapacitet har kræves udvikling af bioinformatic algoritmer til analyse af data vedrørende alternative polyadenylation i 3′ enden. For de novo påvisning eller validering af PAS og dermed tilknytning til 3′ enden af enkelte gener fra store skala sequencing data, forbliver 3′ RACE metode valg4,5. De sekvenser, der er inkluderet i cDNA produkter af 3′ RACE normalt omfatter kun en del af 3′ UTR, der indeholder poly(A) hale, webstedet kavalergang, PAS og sekvenser opstrøms af PAS. I modsætning til PCR, som kræver udformning og anvendelse af genet specifikke frem og bak primere, kræver 3′ RACE kun to gen specifikke indlejrede fremad primere. Derfor, PCR kræver en mere detaljeret viden om nucleotidsekvensen af en stor region af genet bliver forstærket4,6. Siden 3′ RACE bruger omvendt det samme primer at mål poly(A) hale for alle polyadenylated RNA udskrifter, kun de forreste primere skal gen specifikke, således kun kræver kendskab til en betydeligt mindre region i mRNA. Dette giver mulighed for forstærkning af regioner, hvis sekvenser ikke er fuldt karakteriseret4,7. Dette har tilladt 3′ RACE skal bruges ikke kun til at bestemme 3′ enden af et gen, men at også bestemme og karakterisere store områder opstrøms i de PAS, der udgør en betydelig del af 3′ UTR. Ved at kombinere 5′ RACE med den modificerede 3′ RACE, der omfatter større dele af 3′ UTR og flanken regioner, er det muligt at fuldt sekvens eller klone en hele mRNA udskrift fra 5′-enden til sine 3′ enden8.
Et eksempel på denne anvendelse af modificerede 3′ RACE er den seneste identifikation af en roman CCND1-MRCK fusion gen udskrift fra Mantle celle lymfom cellelinjer og kræftpatienter. 3′ UTR bestod af sekvenser fra både CCND1 og MRCK gener og var genstridige miRNA forordning9. De to indlejrede CCND1 specifikke fremad primere var supplement til området umiddelbart tilstødende og neden for CCND1 stop-codon. Selv om hele transkriptom sekventering sammen med specifikke bioinformatic værktøjer kan anvendes til at påvise gen fusioner inden for 3′ UTR10, mange laboratorier kan manglende finansielle midler eller bioinformatic ekspertise til at gøre brug af denne teknologi. Derfor, 3′ RACE er et alternativ til de novo identifikation og validering af nye fusion gener der involverer 3′ UTR. I betragtning af den drastiske stigning i antallet af rapporterede fusion gener samt læse gennem afskrifter, er 3′ RACE blevet et stærkt værktøj i kendetegner gen sekvenser11,12. Derudover har nylige undersøgelser vist, at forskellige sekvenser i 3′ UTR såvel som længden af 3′ UTR kan påvirke mRNA udskrift stabilitet, lokalisering, translatability og funktion13. Delvis på grund af en øget interesse i kortlægning af transkriptom, har der været en stigning i antallet af forskellige DNA polymeraser der udvikles til brug i laboratoriet. Det er vigtigt at fastslå, hvad slags ændringer kan være foretaget 3′ RACE protokol i for at udnytte det tilgængelige repertoire af DNA polymeraser.
Dette arbejde rapporter tilpasning 3′ RACE at kortlægge den hele 3′ UTR, PAS, og 3′ enden kavalergang site af ANKHD1 udskrift ved hjælp af indlejret primere i afsnittet ANKHD1 i afskriften og to forskellige DNA polymeraser.
På trods af fremkomsten af massive parallelle sekventering teknologier, på grundlag af genet af genet, 3′ RACE er stadig den nemmeste og mest økonomiske metode til at identificere de PAS og nukleotider støder op til poly(A) hale. Tilpasning beskrives her udvides ved hjælp af 3′ RACE til både forstærke og knytte sekvenser, der omfatter en del af ORF, stop-codon og den hele 3′ UTR af ANKHD1 mRNA udskrift. En stor fordel ved 3′ RACE er, at med et par mindre tilpasninger, produkter fra 3′ RACE kan klones til …
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne anerkende Bettine Gibbs for hendes teknisk hjælp.
HeLa cells | ATCC | CCL-2 | Cervical cancer cell line. |
Jeko-1 cells | ATCC | CRL-3006 | Mantle cell lymphoma cell line. |
Granta-519 cells | DSMZ | ACC-342 | Mantle cell lymphoma cell line. |
Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal bovine serum for cell culture. |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFisherScientific | 15140122 | Antibiotic and antimycotic. |
GlycoBlue | Ambion | AM9545 | Coprecipitant. |
DMEM | ThermoFisherScientific | 10569044 | Gibco brand cell culture media with GlutaMAX. |
Nuclease Free-Water | ThermoFisherScientific | AM9938 | Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated). |
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution | Corning | 21-030 | 1X PBS. |
Chloroform | Sigma Aldrich | C7559-5VL | |
2-propanol | Sigma Aldrich | I9516 | |
Reagent Alcohol | Sigma Aldrich | 793175 | Ethanol |
Ethidium Bromide solution | Sigma Aldrich | E1510 | |
TRIzol Reagent | ThermoFisherScientific | 15596026 | Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent. |
2X Extender PCR-to-Gel Master Mix | Amresco | N867 | 2X PCR-to-Gel Master Mix containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search. |
10mM dNTP | Amresco | N557 | |
RQ1 RNase-Free DNase | Promega | M6101 | Dnase treatment kit. |
Gel Loading Dye Orange (6X) | New England BioLabs | B7022S | |
2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer | ThermoFisherScientific | F531S | 2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents. |
PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase | Agilent Technologies | 600670 | Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu). |
RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fischer | K1691 | Used for reverse transcription of mRNA into cDNA synthesis. Kit includes Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript. |
Pefect size 1Kb ladder | 5 Prime | 2500360 | Molecular weight DNA ladder. |
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III | Alpha Innotech | Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel. | |
Low Molecular Weight Ladder | New England BioLabs | N3233L | Molecular weight DNA ladder. |
Vortex Mixer | MidSci | VM-3200 | |
Mini Centrifuge | MidSci | C1008-R | |
Dry Bath | MidSci | DB-D1 | |
NanoDrop 2000C | ThermoFisherScientific | ND-2000C | Spectrophotometer. |
Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | BioRad | 1704469 | Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel |
PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | Power supply for gel electrophoresis. |
Agarose | Dot Scientific | AGLE-500 | |
Mastercycler Gradient | Eppendorf | 950000015 | PCR thermocycler. |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System | Promega | A9281 | |
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli cells | ThermoFisherScientific | K280020 | |
MyPCR Preparation Station Mystaire | MidSci | MY-PCR24 | Hood dedicated to PCR work. |
Hamilton SafeAire II fume hood | ThermoFisherScientific | Fume hood. | |
Beckman Coulter Z1 Particle Counter | Beckman Coulter | 6605698 | Particle counter. For counting cells before plating for RNA extraction. |
Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0 | Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific) | Software to analyze Sanger sequencing data. |