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3 ' अनुकूलन सीडीएनए के तेजी से प्रवर्धन के लिए कैंसर में टेप नक्शा समाप्त होता है

Published: March 28, 2018 doi: 10.3791/57318

Chioniso Patience Masamha¹, Zachery Todd¹

¹Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy and Health Sciences, Butler University

Summary

दो अलग 3 सीडीएनए के तेजी से प्रवर्धन (3 ' दौड़) प्रोटोकॉल यहां वर्णित दो अलग डीएनए polymerases का उपयोग करने के लिए दृश्य है कि खुले पढ़ने के फ्रेम (ओआरएफ), बंद codon, और एक प्रतिलिपि के पूरे 3 ' UTR आरएनए का उपयोग कर एक खंड शामिल नक्शा बनाने अलग कैंसर सेल लाइनों से प्राप्त की ।

Abstract

eukaryotic mRNAs की परिपक्वता 3 ' अंत गठन है, जो एक पाली के अलावा शामिल है (एक पूंछ) शामिल है । आदेश में एक जीन के 3 ' अंत नक्शा करने के लिए, पसंद की पारंपरिक विधि सीडीएनए समाप्त होता है की ' 3 तेजी से प्रवर्धन (3 ' दौड़) । 3 ' दौड़ के लिए प्रोटोकॉल सावधान डिजाइन और नेस्टेड प्राइमरों के चयन के भीतर 3 ' unअनुवादित क्षेत्र (3 ' UTR) ब्याज की लक्ष्य जीन की आवश्यकता होती है । हालांकि, कुछ संशोधनों के साथ प्रोटोकॉल के लिए पूरे 3 ' UTR और दृश्यों को शामिल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है खुले पढ़ने के फ्रेम (ओआरएफ), के बीच संबंधों की एक और व्यापक तस्वीर उपलब्ध कराने के ओआरएफ और 3 ' UTR । इस polyadenylation संकेत (क़दम), साथ ही दरार और polyadenylation पारंपरिक 3 ' दौड़ द्वारा प्रदान की साइट की पहचान के अलावा है । विस्तारित 3 ' दौड़ 3 ' UTR के भीतर जीन संलयन सहित असामांय 3 ' UTRs, का पता लगाने, और अनुक्रम जानकारी के लिए संभावित miRNA बाध्यकारी साइटों की भविष्यवाणी के रूप में अच्छी तरह के रूप में AU अमीर तत्वों है कि प्रतिलिपि की स्थिरता को प्रभावित कर सकते है इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

3 ' के अंत के गठन mRNA परिपक्वता में एक महत्वपूर्ण कदम है कि पूर्व के दरार शामिल है एक के अलावा के बाद एक क़दम के mRNA बहाव ~ 250 unadeninesed, जो पाली (एक) पूंछ¹^,²। पाली (एक) बंधन प्रोटीन (PABP) पाली (एक) पूंछ को बांध, और यह क्षरण से mRNA प्रतिलिपि की रक्षा करता है, और अनुवाद की सुविधा¹।

वर्तमान अनुमान का सुझाव है कि मानव जीन के 70% से अधिक पास है, और इस तरह वैकल्पिक polyadenylation से गुजरना, एकाधिक 3 ' में जिसके परिणामस्वरूप ' समाप्त होता है³। इस प्रकार, यह महत्वपूर्ण है की पहचान जहां पाली (एक) पूंछ 3 ' UTR के आराम करने के लिए देता है, साथ ही साथ किसी भी प्रतिलिपि द्वारा इस्तेमाल किया क़दम की पहचान । अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के आगमन 3 ' UTRs और जीन के हजारों की तादात के एक साथ पहचान में हुई है । अनुक्रमण क्षमता में यह वृद्धि 3 ' अंत के वैकल्पिक polyadenylation शामिल डेटा का विश्लेषण करने के लिए bioinformatic एल्गोरिदम के विकास की आवश्यकता है. de नोवो पता लगाने या क़दम और इसलिए बड़े पैमाने पर अनुक्रमण डेटा से व्यक्तिगत जीन के 3 ' अंत के मानचित्रण के सत्यापन के लिए, 3 ' दौड़ विकल्प की विधि बनी हुई है⁴^,⁵. 3 ' दौड़ के सीडीएनए उत्पादों में शामिल अनुक्रम आम तौर पर 3 ' UTR है कि पाली (एक) पूंछ, दरार साइट, क़दम, और इस क़दम का जुगाड़ ऊपर शामिल है के केवल एक भाग शामिल हैं । पीसीआर, जो डिजाइन और जीन के उपयोग की आवश्यकता के विपरीत विशिष्ट आगे और रिवर्स प्राइमरों, ' 3 रेस केवल दो जीन विशिष्ट नेस्टेड आगे प्राइमरों की आवश्यकता है । इसलिए, पीसीआर⁴^,⁶प्रवर्धित किया जा रहा जीन के एक बड़े क्षेत्र के न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम के एक अधिक विस्तृत ज्ञान की आवश्यकता है । 3 ' दौड़ के बाद से एक ही रिवर्स प्राइमर है कि लक्ष्य पाली (एक) सभी polyadenylated आरएनए टेप के लिए पूंछ का उपयोग करता है, केवल आगे प्राइमरों जीन विशिष्ट होना चाहिए, इस प्रकार, केवल mRNA के एक काफी छोटे क्षेत्र के ज्ञान की आवश्यकता होती है । यह क्षेत्रों जिसका अनुक्रम पूरी तरह से⁴^,⁷विशेषता नहीं है के प्रवर्धन सक्षम बनाता है । यह 3 ' दौड़ के लिए एक जीन के 3 ' अंत निर्धारित करने के लिए ही नहीं इस्तेमाल किया जा करने की अनुमति दी है, लेकिन यह भी निर्धारित करने के लिए और क़दम है कि 3 ' UTR का एक महत्वपूर्ण हिस्सा फार्म के ऊपर बड़े क्षेत्रों की विशेषता । 3 ' UTR और पार्श्व क्षेत्रों के बड़े भाग शामिल है कि संशोधित 3 दौड़ के साथ 5 ' दौड़ के संयोजन से, यह पूरी तरह से अनुक्रम या 5 ' अंत से अपने 3 ' अंत तक एक पूरे mRNA प्रतिलिपि क्लोन करने के लिए संभव है⁸।

संशोधित 3 दौड़ के इस आवेदन का एक उदाहरण है एक उपंयास CCND1-MRCK संलयन मेंटल सेल लिंफोमा सेल लाइनों और कैंसर रोगियों से जीन प्रतिलिपि की हाल ही में पहचान है । 3 ' UTR ने मिलकर CCND1 और MRCK जीन दोनों से जुगाड़ किया और miRNA रेगुलेशन⁹को अड़ियल बना दिया । दो नेस्टेड CCND1 विशिष्ट आगे प्राइमर क्षेत्र के पूरक थे तुरंत आसंन और CCND1 बंद codon के बहाव । हालांकि पूरे transcriptome विशिष्ट bioinformatic उपकरण के साथ अनुक्रमण 3 ' UTR¹⁰के भीतर जीन संलयन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, कई प्रयोगशालाओं वित्तीय संसाधनों या bioinformatic विशेषज्ञता इस तकनीक का उपयोग करने के लिए कमी हो सकती है । इसलिए, 3 ' दौड़ de नोवो पहचान और उपंयास संलयन 3 ' UTR शामिल जीन के सत्यापन के लिए एक विकल्प है. रिपोर्ट फ्यूजन जीन की संख्या में भारी वृद्धि को ध्यान में रखते हुए के रूप में अच्छी तरह के रूप में टेप के माध्यम से पढ़ें, 3 ' दौड़ निस्र्पक जीन अनुक्रम में एक शक्तिशाली उपकरण बन गया है¹¹^,¹²। इसके अलावा, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि 3 ' UTR के भीतर अलग दृश्यों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से 3 ' UTR की लंबाई mRNA प्रतिलिपि स्थिरता, स्थानीयकरण, अनुवाद को प्रभावित कर सकते हैं, और समारोह¹³। transcriptome मानचित्रण में एक वृद्धि की रुचि के हिस्से में कारण, वहां विभिंन डीएनए polymerases की संख्या में वृद्धि की गई है प्रयोगशाला में इस्तेमाल के लिए विकसित किया जा रहा है । यह निर्धारित करने के लिए क्या संशोधनों के प्रकार 3 ' रेस प्रोटोकॉल के लिए बनाया जा सकता है ताकि डीएनए polymerases के उपलब्ध प्रदर्शनों की व्यवस्थाओं का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

यह काम 3 ' दौड़ के लिए पूरे 3 ' UTR, क़दम नक्शा, और 3 ' के अंत में ANKHD1 प्रतिलिपि के दरार साइट के अनुकूलन की रिपोर्ट की प्रतिलिपि के ANKHD1 खंड के भीतर नेस्टेड प्राइमरों का उपयोग करके और दो अलग डीएनए polymerases ।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में सभी प्रक्रियाओं प्रदर्शन करते हुए हर समय एक प्रयोगशाला कोट, दस्ताने, और सुरक्षा चश्मा पहनते हैं । सुनिश्चित करें कि कंटेनरों/phenol और guanidine isothiocyanate रिएजेंट युक्त ट्यूब केवल एक प्रमाणित हुड में खोला गया है, और एक निर्दिष्ट कंटेनर में phenol कचरे के निपटान । DNAse/RNAse-मुक्त बाँझ ट्यूबों, सुझावों, और रिएजेंट का प्रयोग करें ।

1. सेल संस्कृति

हेला सेल लाइन और दो सस्पेंशन मेंटल सेल लिंफोमा सेल लाइनों, Granta-519 और Jeko-1, DMEM में 10% FBS और 100 U/एमएल पेनिसिलिन/Streptomycin के साथ एक humidified मशीन में 5% कं₂ में 37 डिग्री सेल्सियस से अधिक हो जाना । 1:10 कोशिकाओं को पतला और एक कण काउंटर का उपयोग कर गिनती¹⁴.
आरएनए निष्कर्षण के लिए, प्लेट 500,000 कोशिकाओं में/अच्छी तरह से एक 6 अच्छी थाली (प्रति अच्छी तरह से 2 मिलीलीटर मीडिया) । 24 घंटे के लिए मशीन के बाद, कोशिकाओं से आरएनए इकट्ठा ।

2. आरएनए निष्कर्षण

कटाई कक्ष
नोट: केंद्रापसारक कदम के अपवाद के साथ, एक ऊतक संस्कृति हूड में सभी सूचीबद्ध कदम प्रदर्शन को बाँझ बनाए रखने के ।
1. निलंबन कक्षों के लिए (Jeko-1 and Granta-519):
  1. कोशिकाओं स्थानांतरण (एक साथ मीडिया के 2 मिलीलीटर के साथ) के लिए एक 15 मिलीलीटर ट्यूब, और 5 मिनट के लिए १,७२५ x g पर केंद्रापसारक मीडिया महाप्राण और ट्यूब के तल में सेल गोली छोड़ दें ।
  2. 1x फास्फेट के 50 µ एल में सेल गोली reसस्पेंड (पंजाब) खारा । 1.5 एमएल isothiocyanate ट्यूब में प्रत्येक नमूने के लिए 500 µ l को monophasic phenol और guanidine microcentrifuge रिएजेंट के साथ जोड़ें । अच्छी तरह से मिश्रण और microcentrifuge ट्यूब हर 1 मिनट औंधा जबकि 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर छोड़ दें ।
2. अनुयाई कोशिकाओं (हेला) के लिए:
  1. प्रत्येक कुआं से सेल कल्चर मीडिया को महाप्राण । बंद मलबे धोने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से पंजाब के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  2. पंजाबियों निकालें और monophasic phenol और guanidine isothiocyanate एजेंट के 500 µ एल जोड़ने के लिए एक अच्छी तरह से ।
  3. कोमल कमाल के साथ 5 मिनट के लिए आर टी पर मशीन । एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण ।
सेल lysis
1. 1 ज के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर phenol और guanidine isothiocyanate सेल मिश्रण फ्रीज ।
  नोट: मिश्रण रात भर में या जरूरत है जब तक-20 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दिया जा सकता है ।
2. बर्फ पर phenol और guanidine isothiocyanate सेल मिक्सचर को गल लें । एक पीसीआर हुड में microcentrifuge ट्यूब के लिए क्लोरोफॉर्म के 100 µ एल जोड़ें । भंवर 10-15 एस के लिए नमूना जब तक मिश्रण गुलाबी और अपारदर्शी है । 15 मिनट के लिए (4 डिग्री सेल्सियस से कम) बर्फ पर नमूना मशीन ।
3. २०,८०० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए नमूना केंद्रापसारक । ध्यान से ऊपरी बेरंग जलीय चरण (~ 200 µ एल) को हटाने और एक नया 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण ।
आरएनए वर्षण
1. प्रत्येक नमूने के लिए isopropanol की एक बराबर मात्रा जोड़ें । coprecipitant के 1 µ l जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) आरएनए के लिए एक वाहक के रूप में कार्य करने के लिए प्रत्येक नमूने के लिए और बाद में चरणों में आरएनए कल्पना मदद करते हैं । पर नमूना-80 डिग्री सेल्सियस के लिए ंयूनतम 4 ज । सबसे अच्छा परिणाम के लिए,-80 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
2. एक ठंडा केंद्रापसारक के लिए नमूना हस्तांतरण । २०,८०० x g/4 डिग्री सेल्सियस पर 35 मिनट के लिए केंद्रापसारक; आरएनए ट्यूब के नीचे एक नीला धब्बा के रूप में दिखाई देगा । नमूने से isopropanol को सावधानीपूर्वक निकालें । 80% इथेनॉल के 500 µ एल जोड़ें और संक्षेप में 3 एस के लिए भंवर से गोली reसस्पेंड ।
3. 5 मिनट के लिए आरटी पर २०,८०० x जी में नमूना केंद्रापसारक । नमूने से सभी इथेनॉल निकालें । नमूना हवा के बारे में 10 मिनट के लिए शुष्क चलो. RNAse-मुफ्त पानी के 35 µ एल में नमूना पुनर्स्थगित । एक गर्मी ब्लॉक पर प्लेस (65 ° c) 5 मिनट के लिए सुनिश्चित करें कि शाही सेना समाधान में पूरी तरह से है, और तुरंत बर्फ पर ट्यूब जगह है ।
4. पहले वर्णित के रूप में एक spectrophotometer का उपयोग कुल आरएनए की एकाग्रता का निर्धारण, 1 µ l¹⁵के बजाय आरएनए नमूना के 1.5 µ l का उपयोग को छोड़कर. वैकल्पिक रूप से, आरएनए अखंडता का निर्धारण करने के लिए 1% agarose जेल पर कुल आरएनए के 1 µ g को चलाएं ।

3. DNase उपचार

आरएनए के ठहराव के बाद, किसी भी जीनोमिक डीएनए को नीचा करने के लिए कुल आरएनए पर DNAse उपचार करते हैं । प्रत्येक नमूने के लिए, एक अलग microcentrifuge ट्यूब में एक 20 µ l कुल प्रतिक्रिया मिश्रण बनाने के लिए RNAse-free DNAse किट से निम्नलिखित एजेंट जोड़ें:
1. कुल आरएनए के 4.4 µ g के साथ DNase 10x प्रतिक्रिया बफर के 2 µ एल मिश्रण. पानी के साथ कुल 14 µ l को लायेंगे ।
2. RNase-मुक् DNAse के 2 µ l को जोड़ें । (रिवर्स प्रतिलेखन किट से) RNase अवरोध करनेवाला के 2 µ एल की उपस्थिति में 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
3. DNAse एंजाइम को निष्क्रिय करने के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए एक गर्मी ब्लॉक पर रोक समाधान और गर्मी के 2 µ एल जोड़ें ।
  नोट: DNAse उपचार वैकल्पिक है ।

4. सीडीएनए संश्लेषण

50 µ के एक अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा के लिए l:

50 µ एल के एक अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा के लिए: एक नई ट्यूब करने के लिए DNase का इलाज आरएनए के 22 µ एल हस्तांतरण, या एक नई ट्यूब के लिए 22 µ एल की कुल मात्रा के लिए जोड़ा पानी के साथ 4 µ ग्राम आरएनए का स्थानांतरण. 10 µ m प्राइमरी सॉल्यूशन से T7 oligo dT₂₅ प्राइमरी के 2 µ l जोड़ें । T7 oligo डीटी₂₅ प्राइमर के लिए अनुक्रम 5 '-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 ' है ।
रिवर्स प्रतिलेखन किट से RNase अवरोधक के 2 µ एल जोड़ें (20 u/µ l), 5x प्रतिक्रिया बफर के 8 µ एल, 10 मिमी µ के 4 dNTPs एल, और रिवर्स µ के 2 transcriptase एल (200 यू/µ एल) ।
नोट: एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करने के लिए रिवर्स transcriptase के बिना एक प्रतिक्रिया सेट करें ।
1 एच के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी बर्फ के लिए सीधे स्थानांतरण । 5 मिनट के लिए 75 ° c पर ट्यूब गर्मी और बर्फ पर ट्यूब जगह है ।

5. फ्यूजन जीन प्रतिलिपि के लिए प्राइमर खोज

प्राइमरी डिजाइन
1. पहनावा जीनोम ब्राउज़र (enst 00000360839.6/NM_017747) से सीडीएनए अनुक्रम डाउनलोड करें, और लक्ष्य प्रतिलिपि के ओआरएफ के भीतर एक क्षेत्र की पहचान (ANKHD1) रोक codon के ऊपर । पूरे क्षेत्र (700 न्यूक्लियोटाइड) को कॉपी और पेस्ट करें जिसमें प्राइमरी डिजाइन सॉफ्टवेयर (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>) के अनुक्रम प्रविष्टि क्षेत्र में स्टॉप codon के ऊपर जुगाड़ लगा हो ।
2. चुनें कस्टम डिजाइन विकल्प का चयन करें और प्राइमरों की संख्या के लिए 10 का चयन करें कि प्रणाली (परिणाम वापसी के लिए) उत्पंन करना चाहिए और अंय सभी मानकों को डिफ़ॉल्ट सेट छोड़ दें ।
3. पांच आगे प्राइमरों और दो रिवर्स प्राइमरों कि ओवरलैप नहीं चुनते हैं । आदेश प्राइमरों और RNAse/DNAse के साथ पुनर्गठन-10 µ एम के एक अंतिम एकाग्रता के लिए नि: शुल्क पानी । पीसीआर के लिए जनरल प्राइमरी डिजाइन के बारे में अधिक जानकारी¹⁶कहीं कवर कर रहे हैं ।
पीसीआर बाद 3 ' दौड़ में उपयोग के लिए संभावित प्राइमरों की पहचान के लिए
नोट: प्रतिक्रिया में उपयोग करने के लिए अंतिम आगे प्राइमरों का निर्धारण करने के लिए, एक पीसीआर हुड में नियमित रूप से पीसीआर के लिए आगे और रिवर्स प्राइमरों के विभिन्न संयोजनों की स्थापना करके डिजाइन प्राइमरों का परीक्षण करें ।
1. सीडीएनए (2 µ l) को एक फ्रेश 0.5 एमएल पीसीआर ट्यूब पर ट्रांसफर कर दीजिये । आगे प्राइमर के 1 µ एल जोड़ें और रिवर्स प्राइमर के 1 µ एल (एक 10 मिमी प्राइमरी समाधान से) । nuclease-फ्री वॉटर के 8.5 µ l को जोड़कर 12.5 µ l तक कर लें । 2x पीसीआर-टू-जेल मास्टर मिक्स के 12.5 µ एल जोड़ें ।
2. निम्नलिखित पीसीआर थर्मल सायक्लिंग शर्तों का उपयोग करें: 95 डिग्री सेल्सियस के लिए 95 ° c के 29 चक्र के बाद 30 एस के लिए, 60 ° c 30 s के लिए, और 72 ° c 1 min. के लिए 68 ° c पर अंतिम चक्र निर्धारित 7 मिनट के लिए ।
3. पीसीआर के बाद, एक 1% agarose जेल ethidium ब्रोमाइड के साथ दाग पर उत्पादों चलाते हैं । ट्रो के विवरण के रूप में पहले कुछ संशोधनों के साथ वर्णित है¹⁷।
  1. Tris-एसीटेट (ताे) के 100 मिलीलीटर में agarose के 1 ग्राम को भंग कर 250 मिलीलीटर कुप्पी में बफर करें । एक माइक्रोवेव में उबाल लें ।
  2. 1 मिनट के लिए शांत करने के लिए छोड़ दो और ethidium ब्रोमाइड समाधान के 7.5 µ एल जोड़ें (10 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक) एक धुएं डाकू में । कुप्पी घूमता है और एक क्षैतिज जेल तंत्र में डालना द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं । जेल को जमना के लिए अनुमति देने के लिए कम से 30 मिनट तक धुएं के हुड में आरटी में छोड़ दें ।
  3. 1x ताे बफर के साथ जेल को कवर करें और पीसीआर उत्पाद के 10 µ l को agarose जेल पर एक साथ एक साथ 3-5 µ l के साथ डीएनए आणविक भार सीढ़ी पर लोड करे । 10 मिनट के लिए 175 वी पर भागो एक imager का उपयोग कर उत्पादों कल्पना, और अगर आगे जुदाई उत्पादों की जरूरत है, एक अतिरिक्त 5-10 मिनट के लिए जेल चलाते हैं ।
3 ' दौड़ के लिए नेस्टेड प्राइमरों का चयन
1. एक विशिष्ट, मजबूत, एकल पीसीआर बैंड है कि प्राइमरों का चयन करने के लिए पीसीआर agarose जेल के परिणामों का विश्लेषण । पहली पीसीआर चलाने में T7 oligodT₂₅ प्राइमरी के साथ मिलकर 5 '-सबसे प्राइमरी (ANKHD15 '-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3 ') का प्रयोग करें ।
2. नेस्टेड प्राइमर है कि पहले प्राइमर के बहाव में स्थित है का चयन करें (ANKHD1 5 '-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3 '), और यह T7 प्राइमर के साथ प्रयोग करें (5 '-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3 ') पीसीआर प्रतिक्रियाओं के दूसरे सेट में ।

6. अनुकूलन 3 ' रेस दो अलग एंजाइमों का उपयोग कर 3 ' UTR नक्शा करने के लिए

नोट: पीसीआर के लिए इस्तेमाल डीएनए polymerases की विविधता में वृद्धि हुई है; इसलिए, हम भी 3 ' दौड़ पीसीआर प्रतिक्रियाओं के लिए अलग एंजाइम का उपयोग करते समय लागू किया जा सकता है कि मानक शर्तों का निर्धारण करना चाहता था । किसी भी प्रतिलिपि के लिए रिवर्स प्राइमरों लगातार रखा जाता है; केवल परिवर्तन नेस्टेड आगे प्राइमर है कि लक्ष्य प्रतिलिपि के लिए विशिष्ट है में हैं ।

प्रोटोकॉल 1:3 ' एक संशोधित डीएनए पोलीमरेज़ से Pyrococcus furiosus (Pfu ) का उपयोग दौड़
1. पहली पीसीआर
  1. एक पीसीआर ट्यूब के लिए सीडीएनए के 1 µ एल स्थानांतरण और 10x Pfu प्रतिक्रिया बफर के 5 µ एल जोड़ें । पहले नेस्टेड आगे प्राइमर के 1 µ एल जोड़ें, T7 oligodT₂₅ प्राइमर के 1 µ एल, और µ के 1 dNTPs एल (एक 10 मिमी समाधान से) ।
  2. पानी के 40 µ l को जोड़कर 49 µ l कुल मात्रा तक बनाएं । Pfu DNA पोलीमरेज़ के 1 µ l को डालकर अच्छी तरह मिला लें । पीसीआर प्रोफ़ाइल का उपयोग कर तालिका 1में भाग ।
2. दूसरी पीसीआर
  1. पहली पीसीआर से एक नई पीसीआर ट्यूब उत्पादों के 2 µ एल स्थानांतरण और 10x Pfuअल्ट्रा द्वितीय प्रतिक्रिया बफर के 5 µ एल के साथ मिश्रण । दूसरी नेस्टेड पीसीआर प्राइमर के 1 µ एल जोड़ें, T7 प्राइमर के 1 µ एल, और dNTPs के 1 µ एल (10 मिमी समाधान) ।
  2. अप करने के लिए 49 µ l कुल प्रतिक्रिया मात्रा 39 µ l को जोड़ कर पानी की. Pfu DNA पोलीमरेज़ के 1 µ l को जोड़ें । पहले पीसीआर सेटअप (टेबल 1) के रूप में ही पीसीआर प्रोफाइल का इस्तेमाल कर पीसीआर चलाएं ।
प्रोटोकॉल 2:3 ' एक chimeric डीएनए का उपयोग कर एक डीएनए बाइंडिंग डोमेन से जुड़े पोलीमरेज़ एक Pyrococcus-की तरह ठीक करना पोलीमरेज़ पीसीआर मास्टर मिक्स के साथ रेस
1. पहली पीसीआर
  1. एक पीसीआर ट्यूब सीडीएनए के 1 µ एल स्थानांतरण । पहले नेस्टेड फॉरवर्ड प्राइमरी के 1 µ एल जोड़ें और 1 µ एल के T7 oligodT₂₅ प्राइमर । पानी के 22 µ l को जोड़कर 25 µ l तक बना लें ।
  2. 2x पीसीआर मास्टर मिश्रण के 25 µ एल जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण । तालिका 2में वर्णित पीसीआर साइकलिंग शर्तों का उपयोग करें ।
2. दूसरी पीसीआर
  1. पहली पीसीआर से एक नई पीसीआर ट्यूब उत्पादों के 2 µ एल स्थानांतरण । एक साथ दूसरी नेस्टेड पीसीआर प्राइमरी के 1 µ एल जोड़ें T7 रिवर्स प्राइमर के 1 µ एल के साथ ।
  2. पानी के 22 µ l को जोड़कर 25 µ l तक बना लें । 2x पीसीआर मास्टर मिक्स के 25 µ एल जोड़ें । पहले पीसीआर सेटअप (टेबल 2) के रूप में ही पीसीआर प्रोफाइल का इस्तेमाल कर पीसीआर चलाएं ।

7.3 ' दौड़ की दूसरी पीसीआर उत्पाद की जांच करें ।

ले 5-10 µ दूसरा पीसीआर उत्पाद के एल (के रूप में अच्छी तरह से उत्पाद के रूप में पीसीआर के पहले दौर से अगर प्रतिलिपि प्रचुर मात्रा में व्यक्त की है) और एक agarose जेल पर चला रहे हैं । जेल सेट और ट्रो चलाने के रूप में पहले से वर्णित (कदम 5.2.3.3 के लिए 5.2.3.1) । एक imager पर परिणाम कल्पना ।

8. उत्पाद शुद्धि और अनुक्रमण

निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार जेल और पीसीआर टुकड़ा डीएनए साफ-अप प्रणाली का उपयोग कर दूसरी पीसीआर से जेल पीसीआर उत्पादों को शुद्ध ।
सैंज अनुक्रमण प्रदर्शन (वैकल्पिक रूप से, एक अनुक्रमण प्रयोगशाला के लिए जेल शुद्ध पीसीआर उत्पाद के नमूनों और उचित अनुक्रमण प्राइमरों भेजें) । सैंज sequencing के बाद sequencing डेटा का विश्लेषण ।
डाउनलोड अनुक्रम विश्लेषण सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिकादेखें) और सॉफ्टवेयर में ट्रेस फ़ाइलों को आयात. आधार कॉल जानकारी¹⁸प्राप्त करने के लिए व्यक्तिगत शुद्ध आधार QVs (गुणवत्ता मान) का उपयोग करें । देखने के लिए उच्च गुणवत्ता के निशान के साथ वर्णलेख डाउनलोड करें ।
वैकल्पिक: जेल शुद्ध उत्पाद एक उपयुक्त क्लोनिंग किट का उपयोग कर क्लोन किया जा सकता है और अलग क्लोन के लिए भेजा गया sequencing ।

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Representative Results

नेस्टेड आगे प्राइमर खोज:

से agarose जेल चित्रा 1 दो अलग पीसीआर जेल उत्पादों (लेन 1 और 2) जो एक ही आगे प्राइमर लेकिन अलग रिवर्स प्राइमर का उपयोग दिखाता है । लेन 3 एक अलग पीसीआर उत्पाद है और एक अलग आगे और रिवर्स प्राइमर है । आदर्श प्राइमरों पीसीआर आधारित प्रतिक्रिया के लिए उपयोग करने के लिए उन है कि एक अलग पीसीआर उत्पाद (लेन 3) दे रहे हैं । आगे प्राइमर गलियों में इस्तेमाल किया 1 और 2 मजबूत बैंड देता है और सबसे बड़ी पीसीआर उत्पादों (अपेक्षित) देता है, और पहले आगे प्राइमर के रूप में प्रयोग किया जाता है । दूसरा ' 3 दौड़ में पीसीआर प्रतिक्रियाओं के दूसरे सेट के लिए नेस्टेड प्राइमर लेन 3 से आगे प्राइमर है ।

अलग डीएनए Polymerases 3 ' दौड़ में इस्तेमाल इसी तरह के परिणाम का उत्पादन:

दो अलग डीएनए polymerases 3 ' रेस (चित्रा 2) के लिए अलग पीसीआर सायक्लिंग शर्तों होने के बावजूद एक ही आकार पीसीआर उत्पादों का उत्पादन किया । अपेक्षित पीसीआर उत्पाद के लिए केवल एक अलग बैंड है । शूंय से रिवर्स transcriptase नकारात्मक नियंत्रण के सभी (-) एक बैंड नहीं है, आरएनए का कोई जीनोमिक संदूषण सीडीएनए संश्लेषण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बाद में बहाव प्रतिक्रियाओं में इस्तेमाल किया दिखा ।

सैंज अनुक्रमणक परिणाम:

पीसीआर उत्पादों को शुद्ध जेल थे और सैंज अनुक्रमण के लिए भेजा । चित्रा 3 ए में दिखाए गए परिणाम, ओरिजिनल sequencing से अनुक्रम chromatograph के एक भाग को दिखाते हैं । एक प्रतिनिधि अनुक्रम स्टॉप codon, ख्यात polyadenylation सिग्नल, और क्लीवेज साइट के स्थान की पहचान करता है, साथ ही पाली (ए) टेल इन 3 ' रेस प्रोडक्ट (फिगर ३ बी).

चित्रा 1: दो नेस्टेड जीन विशिष्ट आगे प्राइमरों की पहचान के लिए 3 ' दौड़ में उपयोग करें । दिखाया हेला सीडीएनए आणविक वजन (मेगावाट) सीढ़ी के साथ एक ethidium ब्रोमाइड दाग agarose जेल पर चलाने का उपयोग कर जीन विशिष्ट आगे और रिवर्स प्राइमर के विभिंन संयोजनों से पीसीआर उत्पादों का एक उदाहरण है । लेन 1 और 2 एक ही जीन विशिष्ट फॉरवर्ड प्राइमर लेकिन अलग रिवर्स प्राइमर से पीसीआर उत्पादों रहे हैं । तीर प्रत्येक लेन के लिए अपेक्षित पीसीआर उत्पाद को इंगित करते हैं । आशा पीसीआर उत्पाद के लिए बैंड के अलावा, वहां एक अतिरिक्त बैंड है । 3 लेन में एकल पीसीआर उत्पाद एक अलग जीन विशिष्ट आगे और रिवर्स प्राइमर नेस्टेड से है और एकल उंमीद बैंड से पता चलता है ।

चित्रा 2: पीसीआर प्रतिक्रियाओं के दूसरे सेट से 3 ' दौड़ उत्पादों का सत्यापन । (क) के साथ दूसरी पीसीआर की प्रतिक्रिया से उत्पाद Pfu डीएनए पोलीमरेज़ और (ख) Chimeric डीएनए पोलीमरेज़ agarose ethidium के साथ एक ब्रोमाइड जेल पर चलाए गए थे. द्वारा चित्रित गलियों (-) प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए नकारात्मक नियंत्रण नमूना से कर रहे हैं जब आरएनए से सीडीएनए संश्लेषण रिवर्स transcriptase एंजाइम के अभाव में किया गया था. गलियाँ 1 और 2 प्रत्येक सेल लाइन की जैविक प्रतिकृति से पीसीआर उत्पाद हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चित्रा 3:3 ' दौड़ के पीसीआर उत्पादों मानचित्रण । (एक) एक जेल के एक अनुक्रम वर्णलेख के एक भाग 3 ' रेस उत्पाद की भविष्यवाणी polyadenylation संकेत दिखा और पाली (एक) पूंछ के स्थान शुद्ध । (B) प्रतिनिधि अनुक्रम को सैंज sequencing डेटा से रोक codon, polyadenylation संकेत (क़दम), पाली के क्लीवेज और आसक्ति स्थल (ए) पूंछ के साथ ही पाली के एक खंड (क) पट जुगाड़ दिखा रहा है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

सायकल स्टेप	तापमान और अवधि	चक्रों की संख्या
प्रारंभिक विकार	3 मिनट के लिए 95 ° c	1
प्रारंभिक एनीलिंग और विस् तार	5 मिनट के लिए 50 ° c और 72 ° c 10 मिनट के लिए	1
Subcyles (विकार, एनीलिंग और विस् तार)	95 ° c के लिए 40 एस, 50 ° c 1 मिनट के लिए, और 72 ° c 3 मिनट के लिए	20
अंतिम चक्र (विकार, एनीलिंग और विस्तार)	95 ° c के लिए 40 एस, 50 ° c 1 मिनट के लिए, और 72 ° c 15 मिनट के लिए	1
पकड़	4 ° c, ∞

तालिका 1: Pfu डीएनए पोलीमरेज़ पीसीआर साइकलिंग शर्तों for 3 ' रेस ।

सायकल स्टेप	तापमान और अवधि	चक्रों की संख्या
प्रारंभिक विकार	98 3 मिनट के लिए ° c	1
प्रारंभिक एनीलिंग और विस् तार	5 मिनट के लिए 50 ° c और 72 ° c 10 मिनट के लिए	1
Subcyles (विकार, एनीलिंग और विस् तार)	30 एस के लिए 98 ° c, 50 ° c 1 मिनट के लिए, और 72 ° c 4 मिनट के लिए	20
अंतिम चक्र (विकार, एनीलिंग और विस्तार)	30 एस के लिए 98 ° c, 50 ° c 1 मिनट के लिए, और 72 ° c 15 मिनट के लिए	1
पकड़	4 ° c, ∞

तालिका 2: Chimeric डीएनए पोलीमरेज़ पीसीआर सायक्लिंग शर्तें ।

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Discussion

बड़े पैमाने पर समानांतर अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के आगमन के बावजूद, एक जीन-दर-जीन आधार पर, 3 ' दौड़ अभी भी सबसे आसान और सर्वाधिक किफायती तरीका के लिए क़दम और पाली (ए) पूंछ से सटे न्यूक्लियोटाइड की पहचान बनी हुई है । अनुकूलन यहां वर्णित दोनों बढ़ाना और नक्शा दृश्यों कि ओआरएफ, stop codon के एक हिस्से को शामिल करने के लिए 3 ' दौड़ का उपयोग कर फैलता है, और पूरे 3 ' के UTR ANKHD1 mRNA प्रतिलिपि । 3 दौड़ का एक प्रमुख लाभ यह है कि कुछ मामूली रूपांतरों के साथ, 3 ' दौड़ से उत्पादों को अंय वैक्टर में क्लोन किया जा सकता है miRNA लक्ष्यीकरण, स्थिरता परख के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अंय यंत्रवत परख सहित 3 ' UTR समारोह के बहाव पूछताछ की सुविधा । इस नेस्टेड प्राइमर अनुक्रम⁹^,¹⁰के भीतर प्रतिबंध एंजाइम साइटों सहित द्वारा किया जा सकता है । समायोजन के लिए 3 ' UTR कार्यात्मक परख⁵के लिए क्लोनिंग के लिए ओआरएफ से किसी भी दृश्यों के बिना केवल 3 ' UTR शामिल किया जा सकता है ।

' 3 दौड़ की सफलता का एक प्रमुख निर्धारक नेस्टेड प्राइमरों का विकास है कि ब्याज की जीन लक्ष्य है । Ensembl जीनोम ब्राउज़र से सीडीएनए दृश्यों के लिए सबसे अच्छा बहुरूपताओं के बिना क्षेत्रों की पहचान के क्रम में इष्टतम प्राइमरों के विकास के लिए सिफारिश कर रहे हैं । आदर्श रूप में, कई नेस्टेड आगे प्राइमरों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ब्याज की जीन के भीतर कम से दो रिवर्स प्राइमरों मानक पीसीआर का उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा दो नेस्टेड जीन विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग करने की पहचान दिखलाई जा सकता है । इस अध्ययन में पहली जीन विशिष्ट आगे प्राइमर 3 ' दौड़ के लिए चयनित शुरू में मानक पीसीआर नियमित रूप से प्रयोगशाला में इस्तेमाल के साथ दो बैंड दिया । दुर्भाग्य से, प्राइमर डिजाइन ब्याज की प्रतिलिपि में SNPs की महत्वपूर्ण संख्या से सीमित था । SNPs लक्ष्य प्रतिलिपि नेतृत्व में प्राइमरों और लक्ष्य है, जो असक्षम एनीलिंग और प्रवर्धन में परिणाम कर सकते है के बीच बेमेल है, और एक ंयूनतम¹⁹के लिए कम किया जाना चाहिए । एक प्राइमरी में कम से कम चार SNPs की मौजूदगी, या पांच बेमेल का एक संयोजन की घटना (तीन एक प्राइमरी में और अंय में दो) पीसीआर प्रतिक्रिया के पूर्ण निषेध में परिणाम हो सकता है, और इसलिए एकमात्र विकल्प के लिए और अधिक प्राइमरों²⁰डिजाइन है । इसके बजाय अधिक प्राइमर डिजाइनिंग के लिए मानक पीसीआर प्रयोगों में प्राइमर खोज के लिए इस्तेमाल के लिए एक एकल बैंड मिल यहां की सूचना दी, पीसीआर साइकिल चालन की स्थिति और डीएनए polymerases बाद में 3 ' दौड़ में इस्तेमाल के क्रम में बदल रहे थे की संभावना का अनुकूलन करने के लिए एक विशिष्ट बैंड हो रही है । डीएनए polymerases (प्राइमरी खोज में प्रयुक्त 95 डिग्री सेल्सियस से वृद्धि) में से एक के लिए विकार तापमान 98 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ गया था । दोनों के लिए डीएनए polymerases 3 ' दौड़ पीसीआर में इस्तेमाल किया, प्रारंभिक विकार अवधि की सिफारिश की 30 एस के बजाय 3 मिनट के लिए बढ़ा दिया गया था 2 मिनट के लिए पूरी तरह से सीडीएनए टेंपलेट स्वभाव । T7 oligo डीटी₂₅ प्राइमर उदाहरण के लिए संभावित रूप से कमजोर माध्यमिक संरचनाओं, जो²¹प्राइमरों की उपलब्धता को कम कर सकते है फार्म की भविष्यवाणी की है । प्रारंभिक विकार लंबाई और तापमान में वृद्धि किसी भी माध्यमिक संरचनाओं टूटता है और 3 ' दौड़ के अंतिम चक्र के बाद एकल विशिष्ट बैंड उपज में मदद करता है । इसके अलावा, गैर विशिष्ट बैंड उम्मीद बैंड की तुलना में हल्का था, सुझाव है कि यह उच्च पीसीआर चक्र पर दिखाई दिया (अप करने के लिए 35 चक्र); केवल 20 के लिए पीसीआर चक्र सीमित गैर विशिष्ट बैंड के प्रवर्धन कम कर देता है ।

अन्य पीसीआर आधारित प्रतिक्रियाओं की तरह 3 दौड़, की एक और क्षमता, लक्ष्य क्षेत्र के²²की अपूर्ण प्रवर्धन है । इसलिए, दोनों thermophilic एंजाइमों के लिए प्रारंभिक एनीलिंग तापमान 50 डिग्री सेल्सियस पर निर्धारित किया गया था 5 मिनट के लिए लक्ष्य को प्राइमरी के एनीलिंग का अनुकूलन और यह 72 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रारंभिक विस्तार तापमान के बाद 10 मिनट के लिए किया गया था । प्रत्येक एंजाइम के लिए अंतिम पीसीआर चक्र 72 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के एक अंतिम विस्तार समय था । ये विस्तार कदम डीएनए polymerases के निर्माताओं द्वारा सिफारिश की तुलना में अधिक थे । लंबे विस्तार (बढ़ाव) कदम अधूरा amplicons के पूर्ण संश्लेषण की अनुमति देता है, प्रारंभिक और अंतिम प्रवर्धन उत्पादों की पूर्ण विस्तार को सक्षम करने¹⁶.

पीसीआर कदम है कि 3 ' दौड़ में होते है अत्यधिक संवेदनशील हैं, तो वे जीनोमिक डीएनए (या अंय डीएनए संदूषण) के बजाय लक्ष्य mRNA प्रतिलिपि का पता लगा सकते हैं, जेल²²पर कई अप्रत्याशित बैंड में जिसके परिणामस्वरूप । एक तरह से संक्रमण को रोकने के लिए एक समर्पित पीसीआर हुड में पीसीआर काम करने के लिए, दस्ताने पहनते हैं, और स्वच्छ रिएजेंट और autoclaved बाँझ ट्यूबों और पिपेट सुझावों का उपयोग करें । नियमित रूप से पीसीआर में, फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमरों डिजाइन किया जा सकता है ताकि वे अलग exons पर स्थित है (intron प्राइमरों के पार); इस तरह, एक असामांय रूप से बड़ी पीसीआर उत्पाद दर्शाता है कि एक क्षेत्र एक intron युक्त है परिलक्षित किया गया है । हालांकि, इस घटना में हमेशा संभव नहीं हो सकता है कि केवल 3 ' UTR अनुक्रम, एक ही टर्मिनल एक्सॉन के भीतर स्थित, 3 ' दौड़ प्रवर्धन के लिए लक्ष्य है । वैकल्पिक रूप से, आरएनए सीडीएनए संश्लेषण से पहले DNAse एंजाइम के साथ पूर्व इलाज किया जा सकता है । T7 oligo डीटी₂₅ प्राइमर का उपयोग करने के लिए प्रधानमंत्री रिवर्स transcriptase रिएक्शन के बजाय पहली किनारा सीडीएनए संश्लेषण के लिए एक यादृच्छिक hexanucleotide के स्थान पर भी जीनोमिक उत्पादों के प्रवर्धन घट जाती है । अंतिम लेकिन कम नहीं, एक नकारात्मक नियंत्रण की स्थापना ("-" चित्रा 2में गलियों), जहां सीडीएनए संश्लेषण रिवर्स transcriptase के अभाव में स्थापित किया गया है अत्यधिक की सिफारिश की है. नियंत्रण अनुवर्ती 3 ' दौड़ प्रक्रियाओं में अंय नमूनों के लिए समान कदम से गुजरती है । इस नियंत्रण में एक बैंड की उपस्थिति संभावित जीनोमिक डीएनए संदूषण का प्रतीक है ।

aforementioned चुनौतियों के बावजूद, 3 ' रेस मानचित्रण में एक शक्तिशाली उपकरण है 3 ' एक व्यक्तिगत जीन के आधार पर समाप्त होता है । अगली पीढ़ी के प्रौद्योगिकी के आगमन टेप है कि वैकल्पिक polyadenylation है, जो या वैकल्पिक ब्याह शामिल नहीं हो सकता है के परिणामस्वरूप से समाप्त होता है की प्रदर्शनों की व्यवस्थाओं में वृद्धि करने के लिए नेतृत्व किया है । जटिलता को जोड़ने के लिए, कैंसर की कोशिकाओं में, गुणसूत्र पुनर्व्यवस्थाओं लगातार कर रहे हैं और oncogenic जीन संलयन उत्पादों में परिणाम कर सकते हैं²³. दो जीन के बीच फ्यूजन ओआरएफ शामिल हो सकते है या, कुछ मामलों में, 3 ' UTR⁹^,¹⁰के भीतर केवल दृश्यों को शामिल । इसके अलावा, वहां भी शामिल है/सह लिखित जीन है, जो एक साथ टाइप कर रहे है लेकिन अलग प्रोटीन में अनुवाद किया जा सकता है¹¹। 3 ' दौड़ इन सभी अद्वितीय, असामांय टेप के रूप में अच्छी तरह के रूप में सामांय टेप नक्शा सिलवाया जा सकता है । यह महत्वपूर्ण है क्योंकि इन असामांय टेप अंत रोग विशिष्ट मार्क्स या विशिष्ट दवा लक्ष्य के रूप में सेवारत हो सकता है, जैसे, दवा Imatinib लक्ष्य BCR-ABL1 फ्यूजन जीन कैंसर में ।

इसलिए, 3 ' दौड़ एक उच्च बहुमुखी तकनीक है जो सामांय टेप बढ़ाना, 3 ' UTR⁵के भीतर उपंयास 3 ' UTRs, और उपंयास जीन संलयन की पहचान की जा सकती है^,⁹। इस रिपोर्ट में, 3 ' दौड़ को बढ़ाना और नक्शा रोक codon, क़दम का इस्तेमाल किया गया था, और पूरे 3 ' UTR के ANKHD1 प्रतिलिपि अलग डीएनए polymerases का उपयोग कर । वर्णित दृष्टिकोण को किसी भी polyadenylated प्रतिलिपि के 3 ' अंत नक्शा इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम उसे तकनीकी मदद के लिए Bettine गिब्स को स्वीकार करना चाहते हैं ।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HeLa cells	ATCC	CCL-2	Cervical cancer cell line.
Jeko-1 cells	ATCC	CRL-3006	Mantle cell lymphoma cell line.
Granta-519 cells	DSMZ	ACC-342	Mantle cell lymphoma cell line.
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	F6178	Fetal bovine serum for cell culture.
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisherScientific	15140122	Antibiotic and antimycotic.
GlycoBlue	Ambion	AM9545	Coprecipitant.
DMEM	ThermoFisherScientific	10569044	Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.
Nuclease Free-Water	ThermoFisherScientific	AM9938	Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution	Corning	21-030	1X PBS.
Chloroform	Sigma Aldrich	C7559-5VL
2-propanol	Sigma Aldrich	I9516
Reagent Alcohol	Sigma Aldrich	793175	Ethanol
Ethidium Bromide solution	Sigma Aldrich	E1510
TRIzol Reagent	ThermoFisherScientific	15596026	Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.
2X Extender PCR-to-Gel Master Mix	Amresco	N867	2X PCR-to-Gel Master Mix containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.
10mM dNTP	Amresco	N557
RQ1 RNase-Free DNase	Promega	M6101	Dnase treatment kit.
Gel Loading Dye Orange (6X)	New England BioLabs	B7022S
2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer	ThermoFisherScientific	F531S	2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.
PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase	Agilent Technologies	600670	Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).
RevertAid RT Reverse Transcription Kit	Thermo Fischer	K1691	Used for reverse transcription of mRNA into cDNA synthesis. Kit includes Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.
Pefect size 1Kb ladder	5 Prime	2500360	Molecular weight DNA ladder.
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III	Alpha Innotech		Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel.
Low Molecular Weight Ladder	New England BioLabs	N3233L	Molecular weight DNA ladder.
Vortex Mixer	MidSci	VM-3200
Mini Centrifuge	MidSci	C1008-R
Dry Bath	MidSci	DB-D1
NanoDrop 2000C	ThermoFisherScientific	ND-2000C	Spectrophotometer.
Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System	BioRad	1704469	Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel
PowerPac Basic Power Supply	BioRad	1645050	Power supply for gel electrophoresis.
Agarose	Dot Scientific	AGLE-500
Mastercycler Gradient	Eppendorf	950000015	PCR thermocycler.
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Centrifuge	Eppendorf	5430R
Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System	Promega	A9281
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli cells	ThermoFisherScientific	K280020
MyPCR Preparation Station Mystaire	MidSci	MY-PCR24	Hood dedicated to PCR work.
Hamilton SafeAire II fume hood	ThermoFisherScientific		Fume hood.
Beckman Coulter Z1 Particle Counter	Beckman Coulter	6605698	Particle counter. For counting cells before plating for RNA extraction.
Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0	Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific)		Software to analyze Sanger sequencing data.

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References

Mandel, C., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing. Cell Mol Life Sci. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
Danckwardt, S., Hentze, M., Kulozik, A. 3' end mRNA processing: Molecular mechanisms and implications for health and disease. EMBO J. 27 (3), 482-498 (2008).
Derti, A., et al. A quantitative atlas of polyadenylation in five mammals. Genome Res. 22 (6), 1173-1183 (2012).
Sambrook, J., Russell, D. W. Rapid amplification of 3′ cDNA ends (3′-RACE). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
Masamha, C. P., et al. CFIm25 regulates glutaminase alternative terminal exon definition to modulate miR-23 function. RNA. 22 (6), 830-838 (2016).
Rodu, B. Molecular Biology in Medicine: The polymerase chain reaction: the revolution within. Am J Med Sci. 299 (3), 210-216 (1990).
Bertioli, D. Rapid amplification of cDNA ends. PCR Cloning Protocols: Methods in Molecular Biology. White, B. A. 67, Humana Press. 233-238 (1997).
Freeman, L. A. Cloning full-length transcripts and transcript variants using 5' and 3' RACE. Lipoproteins and Cardiovascular Disease: Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Freeman, L. 1027, Humana Press. 3-17 (2013).
Masamha, C. P., Albrecht, T. R., Wagner, E. J. Discovery and characterization of a novel CCND1/MRCK gene fusion in mantle cell lymphoma. J Hematol Oncol. 9 (1), 1-5 (2016).
Parker, B. C., et al. The tumorigenic FGFR3-TACC3 gene fusion escapes miR-99a regulation in glioblastoma. J Clin Investig. 123 (2), 855-865 (2013).
Prakash, T., et al. Expression of conjoined genes: Another mechanism for gene regulation in eukaryotes. PLOS ONE. 5 (10), e13284 (2010).
Mertens, F., Johansson, B., Fioretos, T., Mitelman, F. The emerging complexity of gene fusions in cancer. Nat Rev Cancer. 15 (6), 371-381 (2015).
Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs. Trends Cell Biol. 26 (3), 227-237 (2016).
International Committee For Standardization In, H., et al. Protocol for evaluation of automated blood cell counters. Clin Lab Haematol. 6 (1), 69-84 (1984).
Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), e2565 (2010).
Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
Curtis, P. C., Thomas, J. L., Phillips, N. R., Roby, R. K. Optimization of primer specific filter metrics for the assessment of mitochondrial DNA sequence data. Mitochondrial DNA. 21 (6), 191-197 (2010).
Letowski, J., Brousseau, R., Masson, L. Designing better probes: Effect of probe size, mismatch position and number on hybridization in DNA oligonucleotide microarrays. J Microbiol Methods. 57 (2), 269-278 (2004).
Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays. Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).
Singh, V. K., Govindarajan, R., Naik, S., Kumar, A. The effect of hairpin structure on PCR amplification efficiency. Mol Biol Today. 1, 67-69 (2000).
Kalle, E., Kubista, M., Rensing, C. Multi-template polymerase chain reaction. Biomol Detect Quant. 2, 11-29 (2014).
Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. The landscape of kinase fusions in cancer. Nat Commun. 5, 4846 (2014).

3 ' अनुकूलन सीडीएनए के तेजी से प्रवर्धन के लिए कैंसर में टेप नक्शा समाप्त होता है

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Masamha, C. P., Todd, Z. Adapting 3' … More

Masamha, C. P., Todd, Z. Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer. J. Vis. Exp. (133), e57318, doi:10.3791/57318 (2018).

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