Summary
Vi har udviklet en ny metode til at co udtrykke flere kimære fluorescerende fusion proteiner i planter til at overvinde vanskelighederne af konventionelle metoder. Det tager fordel ved at bruge en enkelt udtryk plasmid som indeholder flere funktionelt uafhængige protein udtrykker kassetter for at opnå protein Co udtryk.
Abstract
Oplysninger om den spatiotemporelle subcellulært localization(s) af en protein er afgørende for at forstå dens fysiologiske funktioner i celler. Fluorescerende proteiner og generation af fluorescerende fusion proteiner har været vildt bruges som et effektivt redskab til direkte visualisere protein lokalisering og dynamik i celler. Det er især nyttigt at sammenligne dem med velkendte organelle markører efter Co interessetilkendegivelse med protein. Ikke desto mindre, klassiske tilgange for protein Co udtryk i planter som regel involverer flere uafhængige udtryk plasmider, og derfor har ulemper, der omfatter lav Co udtryk effektivitet, udtryk-niveau variation og høj tid udgifter i genetiske krydser og screening. I denne undersøgelse beskriver vi en robust og roman metode for Co udtryk for flere kimære fluorescerende proteiner i planter. Det overvinder begrænsningerne af konventionelle metoder ved hjælp af et enkelt udtryk vektor, der er sammensat af flere semi-uafhængig udtrykker kassetter. Hver protein udtryk kassette indeholder sin egen funktionelle protein udtrykselementer, og derfor det kan fleksibelt tilpasses for at imødekomme forskellige udtryk efterspørgsel. Også, det er nemt og bekvemt at udføre forsamlingen og manipulation af DNA fragmenter i udtryk plasmid ved hjælp af en optimeret one-step reaktion uden yderligere fordøjelse og ligatur trin. Derudover er det fuldt ud kompatible med aktuelle fluorescerende protein afledt bio-imaging teknologier og applikationer, såsom FRET og BiFC. Som en validering af metoden ansat vi dette nye system til co express fluorescently sammenvokset vakuolære sortering receptor og sekretoriske carrier Membranproteiner. Resultaterne viser, at deres perspektiv subcellulært lokaliseringer er den samme som i tidligere undersøgelser af både forbigående udtryk og genetiske transformation i planter.
Introduction
Kimære fluorescerende fusion proteiner har været betragtet som nyttige redskaber til at studere intracellulære dynamics og subcellulært lokalisering og yderligere at forstå deres fysiologiske funktioner og arbejder mekanismer1,2, 3 , 4. det er især gavnligt for Co express velkendte organelle reporter proteiner med protein til bedre illustrere sine spatiotemporelle rationale, distribution og funktioner inden for endomembrane systemet i celler4 , 5 , 6 , 7 , 8.
En kimære fluorescerende fusion protein kan udtrykkes i planter via forbigående udtryk og stabil genetiske transformation, som har deres respektive fordele og begrænsninger9,10,11. Forbigående udtryk for et protein er en praktisk tilgang, der omfatter biolistic bombardement-, polyethylenglycol (PEG)-, eller elektroporation-medieret DNA forbigående udtryk i protoplasts og Agrobacterium-medieret blad infiltration i intakt planteceller, som vist i figur 1A, B12,13,14,15,16. Co udtryk for flere kimære fluorescerende fusion proteiner i en enkelt plante celle kræver imidlertid en blanding af flere uafhængige udtryk plasmider. Ulemperne ved beskæftiger flere plasmider for protein Co udtryk i planter er således lavere Co udtryk niveauer på grund af den dramatisk reduceret chance for flere plasmider samtidigt ind i de samme celler i forhold til en enkelt plasmid, og den variationer af udtryk Proteinniveau forårsaget af ukontrolleret tilfældige mængden af hver slags plasmid overføres til den celle17,18. Det er endvidere teknisk udfordrende at indføre flere uafhængige udtryk plasmider i en enkelt Agrobacterium for protein Co udtryk9,10,11. Derfor Agrobacterium-medieret protein forbigående udtryk af infiltration af tobak efterlader er kun i stand til at udtrykke et plasmid ad gangen, som vist i figur 1B. Derimod er generation af transgene planter at udtrykke fluorescerende fusion proteiner normalt opnås ved Agrobacterium , der bærer en binær transformation vektor. Den binære vektor, der medierer genoverførsel og indsættelse i anlægget genomer er imidlertid kun i stand til at udtrykke en enkelt fluorescerende fusion protein (figur 1B)9,10,12. Generering af en genetisk modificeret plante, som udtrykker flere kimære fluorescerende proteiner samtidig kræver flere runder af genetiske passage og screening, som kan tage fra måneder til år afhængigt af antallet af generne at være co udtrykt.
Den beskæftigelse, et enkelt udtryk vektor for Co udtryk for flere proteiner i planter er blevet rapporteret af flere tidligere undersøgelser19,20,21. Dog er flere runder af enzymatisk fordøjelse og DNA ligatur af DNA-molekyler og rygraden vektorer normalt kræves til generering af den endelige plasmid for protein Co udtryk eller overdrevne udtryk. Her, har vi udviklet en ny og solid metode til co udtrykker flere kimære fluorescerende proteiner i planter. Det er en meget effektiv og praktisk metode, der opnår flere protein Co udtryk i planter til både forbigående udtryk og stabil transformation i en hævdvundne mode. Det beskæftiger en enkelt vektor, der indeholder flere funktionelt uafhængige protein udtryk kassetter til protein Co udtryk og dermed overvinder ulemperne ved de konventionelle metoder. Derudover er det et meget alsidigt system i hvilke DNA manipulationer og montage er opnået ved en simpel et-trins optimeret reaktion uden ekstra trin af DNA fordøjelse og ligatur. Funktionsprincip er illustreret i figur 2. Derudover er det fuldt ud kompatible med aktuelle cellulære, molekylære og biokemiske metoder, der er baseret på kimære fluorescerende fusion proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. primer Design strategi og DNA amplifikation
- Design primere for Molekylær kloning af DNA-fragmenter. Primere omfatter 20 bp gen specifikke bindende sekvenser og 20 til 25 bp 5'-enden overhæng sekvenser, som er den komplementære overlappende sekvens af tilstødende DNA molekyler (Se tabel 1 for eksempel).
Bemærk: Den efterfølgende samling af hver DNA fragmenter, sammenkobling af forskellige protein udtryk kassetter, og integration med den endelige udtryk vektor alle afhænge af anerkendelsen af de tilstødende overlappende sekvenser. - Forstærke DNA fragmenter, herunder initiativtageren, fluorescerende reporter, target gen og terminator, der er nødvendige for opførelsen af semi-uafhængig protein udtryk kassetter af standard PCR reaktioner med deres tilsvarende primere og høje troskab polymerase.
Bemærk: Skabeloner anvendes i denne undersøgelse til DNA amplifikation er afledt fra tidligere undersøgelser15,22,23. Udglødning temperatur og udvidelse tid af PCR-reaktionerne er primer og gen afhængige.
2. DNA Fragment forsamling og opbygningen af Protein udtryk kassetter
- Undersøge kvaliteten af første runde PCR produkter af DNA elektroforese og kvantificering af Spektrofotometer. Kontrollere, om DNA nedbrydning og forurening har fundet sted af 1% Agarosen gelelektroforese. OD260/OD280 af PCR-produkter bør være mellem 1,6 og 1,8.
- Bland forskellige DNA-fragmenter (0,05 - 0,1 pmol for hvert fragment) ind i en ny PCR rør til en endelige mængden af 5 µL.
Bemærk: Mix DNA molekyler designet til samme protein udtryk kassette sammen i én PCR rør. Undgå at blande DNAs fra forskellige udtryk kassette sammen, da det vil reducere effektiviteten af DNA forsamling på grund af det stigende antal DNA-molekyler, der skal sammenkædes.
Bemærk: Protokollen kan pause her. - Forberede 5 x ISO stock buffer: 500 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM MgCl2; 1 mM deoxynucleotide (dNTP); 50 mM dithiothreitol; 25% polyethylenglycol (PEG) 8000; og 5 mM nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD).
- Gøre 1 mL 2 x master blanding fra 400 µL 5 x ISO lager buffer, 7,5 enheder af T5 exonuclease, 62,5 enheder af high-fidelity DNA polymerase, 5.000 enheder af Taq-polymerase (Se Tabel af materialer), og steriliseret dobbelt destilleret H2O.
Bemærk: Dette er tilpasset fra tidligere undersøgelser24,25,26; disse mængder skal optimeres. - Alikvot 100 µL af 2 x master blanding pr tube og opbevares ved-20 ° C.
Forsigtig: Hyppige nedfrysning og optøning af 2 x master blanding kan forårsage lav DNA forsamling effektivitet. - Tilføj 15 µL af 2 x master blanding til 5 µL DNA blandingen og inkuberes ved 50 ° C til 60 min.
3. konstruktion af vektor for Co udtryk for flere kimære fluorescerende Fusion proteiner i planter
- Forstærke hele semi-uafhængig protein udtryk kassette af en anden runde PCR ved hjælp af produktet (0,5 - 1,0 µL) fra første runde isotermisk forsamling reaktion som skabelonen og de yderste primere (f.eks., 1 FP35S og 1-RNOS til udtryk kassette 1).
- Brug 1 enhed af high fidelity polymerase i en 50 µL reaktion volumen efterfulgt af 30 cykler (94 ° C til 30 s, 55 ° C til 30 s og 68 ° C i 2 min.), efterfulgt af en sidste udvidelse på 68 ° C i 5 min.
- Linearize endelige protein udtryk rygraden vektorer pUC18 og pCAMBIA1300, som er designet til protein forbigående udtryk og genetiske transformation, henholdsvis, ved at tilføje 4 enheder Sma jeg ind i en afsluttende 10 µL reaktion volumen og kvægbruget for 1 - 2 timer ved 25 ° C. Deaktiver begrænsning enzym ved at inkubere ved 65 ° C i 20 min.
- Bland equimolar DNA molekyler af protein udtryk kassetter og lineariseret endelige vektor i en endelig reaktion volumen af 5 µL. Derefter, udføre anden runde DNA rekombination ved at blande med 15 µL 2 x master buffer og inkubere ved 50 ° C til 60 min.
- Brug de færdige produkter af anden runde isotermisk rekombination reaktion til at omdanne kompetente E. coli celler (f.eks. DH5α) Ifølge standardprocedurer27. Dobbelttjek positive kolonier af kolonien PCR og DNA sekvens. Uddrag de positive plasmider fra E. coli ved hjælp af en mini plasmid udvinding kit og opbevares ved-80 ° C.
Forsigtig: Til langtidsopbevaring, plasmider opløst i TE buffer eller dobbelt destilleret H2O er mere stabile end at holde dem i E. coli stammer.
4. Biolistic-bombardement medieret forbigående Co udtryk for flere kimære fluorescerende Fusion proteiner i planter
- Forberede tobak BY-2 suspension celler og Arabidopsis unge planter til bombardement.
- Kultur BY-2 celler i Murashige og Skoog (MS) medium af subculturing to gange om ugen ved 25 ° C i en shaker indstillet på 130 rpm. Filter indsamle 30 mL 3 d kulturperler BY-2 celler på et stykke af 70-mm autoklaveres filtrerpapir via en vakuumpumpe ved at indstille vakuum trykket til 40 mbar.
- For at forhindre cellerne mod udtørring i løbet af de følgende trin, tilsættes nogle dråber af BY-2 celle flydende kulturelle medium i en petriskål før du placerer filtrerpapir (næste trin).
- Overføre filtrerpapir med BY-2-celler på det til en ny petriskål (85 mm x 15 mm).
- Overfladen sterilisere Arabidopsis thaliana (Col-0) frø af vortexing en blanding med 70% (v/v) ethanol indeholdende 0,05% Tween 20 til 10 min.
- Spin ned frøene ved hjælp af en bænk top centrifuge med max hastighed for 2 s, Fjern supernatanten og vask frøene med 100% ethanol engang for 30 s. Pipette ud af frøene ind på en ny steril filterpapir i en steril hætte. Derefter lufttørre frø og sprede dem over på ½ MS agar plader.
- Gemme plader ved 4 ° C for 48 timer før overføre dem til en plante vækst kammer med følgende indstillinger: 16 h lys 8 h mørke med 120-150 µm m-2 s-1 intensitet, 22 ° C.
- Overføre 7 - døgn gammel prøve planter ind i en 30 mm diameter cirkel i midten af en ny ½ MS medium plade til at øge effektiviteten af bombardementet.
Forsigtig: Undgå overlappende planter når overførsel og placere dem på den nye ½ MS tallerken. - Tilsættes nogle dråber af ½ MS flydende medium på overfladen af planter eller væv til at bevare fugt og forhindre udtørring planter ud i løbet af de følgende trin.
- Coat guld partikler med plasmid DNA.
- Vortex guld microcarrier løsning grundigt, for 3 min. forberede en ny 1,5 mL tube.
- Sekventielt tilføje følgende løsninger ind i røret og vortex: 25 µL (1,5 mg) guld partikler, vortex 10 s; 10 µL af 25.46 mg/L spermidine, vortex 10 s; 5 µL af 1µg/µL plasmid DNA, vortex 3 min; 25 µL 277.5 mg/l CaCl2 løsning, vortex 1 min.
Advarsel: Hold vortexing under dette trin. - Spin ned den guld microcarriers ved hjælp af en bænk top centrifuge med max hastighed for 5 s og omhyggeligt pipette ud supernatanten uden at forstyrre pelleten. Vask med 200 µL absolut ethanol og re suspendere pellet af vortex for 5-10 s. Spin ned med max hastighed for 5 s og fjern ethanol.
- Genopslæmmes i guld partikler i 18 µL absolut ethanol og alikvot 6 µL partikler suspension på midten af tre macrocarriers. Lad dem lufttørre.
- Overføre DNA til planter via partikel bombardement.
- Angiv levering partikelsystem som følgende: 1100 psi, 28 mm Hg vakuum, 1 cm hul afstand og 9 cm partikel flyvningen afstand.
- Bombardere celler/planter på agar medium plade for tre gange på tre forskellige positioner og derefter holde celler/planter i mørke straks efter bombardementet.
Forsigtig: Bære sikkerhedsbriller, når opererer partikel leveringssystem på grund af sammenslutningen af højtryks gas og high-speed partikler med systemet.
- Holde bombarderede celler/planter i mørke i plant vækst kammer for 6 til 72 timer før observation af fluorescerende signaler. Indstille anlægget vækst kammer til mørke 24 og 22 ° C.
Forsigtig: Udtryk effektivitet og fluorescerende signal intensitet er promotor-, gen- og anlæg/væv-afhængige.
5. generation af stabil gensplejsede Arabidopsis Co udtrykker flere kimære fluorescerende proteiner af Agrobacterium-medieret Transformation.
- Tø Agrobacterium kompetente celler (PMP90) på is og vente på 30 min., hvorefter der tilsættes 2 µL binære vektor (100-200 ng) (forberedt ovenfor) til de kompetente celler. Sidde blandingen i isbad i 10 min.
- Overfør blandingen til en pre kølet 0,1 cm elektroporation kuvette. Indsæt kuvette i elektroporation system og udføre elektroporation med følgende indstillinger: 1,6 kV, 600 ohm, 25 µF.
- Tilsættes 1 mL af SOC flydende medium i kuvette umiddelbart efter elektroporation, afpipetteres cellerne i en ny 1,5 mL tube, og inkuberes ved 28 ° C i en vandret orbitalryster på 200 rpm i 120 min.
- Centrifugeres celler på 2.348 x g ved stuetemperatur i 5 min, kassere størstedelen af supernatanten, forsigtigt genopslæmmes pelleted cellerne med en pipette tip, sprede dem på en LB plade indeholdende 50 mg/L Hygromycin B og inkuberes ved 28 ° C i 2-3 dage.
- Omdanne Arabidopsis thaliana Col-0 planter med det Agrobacterium, som indeholder binære vektor pCAMBIA1300 integreret med flere protein udtryk kassetter, floral dukkert28 metode som tidligere beskrevet til generere stabile transgene planter.
- Sterilisere overfladen af gensplejsede Arabidopsis frø ved at blande dem med 70% (v/v) ethanol indeholdende 0,05% Tween 20. Vortex for 10 min. Spin ned frøene ved hjælp af en bænk top centrifuge med max hastighed for 2 s, Fjern supernatanten, og vask frøene med 100% ethanol engang for 30 s.
- Der afpipetteres ud af frøene til en steril filterpapir i en steril hætte. Derefter lufttørre og sprede dem over på ½ MS agar plader der indeholder Hygromycin B for screening positive descendenter.
- Inkuber plader ved 4 ° C i 2 dage. Derefter, overføre dem til plante vækst kammer og kultur i 7 dage.
- Vælg 7 - døgn gammel overlevelse unge planter ved at kontrollere for fluorescerende signaler under fluorescerende mikroskop, derefter overføre planter i jorden for yderligere screening af homozygot planter.
6. farmaceutiske behandlinger
- Farmaceutiske behandlinger, fortyndes hvert stof i MS Lage til dens passende arbejde koncentrationer før inkubering med celler eller planter.
- Wortmannin behandling: forberede 1 mM stamopløsninger af wortmannin ved at opløse wortmannin pulver i DMSO og gemme lagre ved-20 ° C. Overføre planteceller eller unge planter i den flydende MS medium indeholdende 16,5 µM wortmammin og inkuberes i 30-45 min før billeddannelse.
- Brefeldin Andersen (BFA) behandling: forberede 1 mM stamopløsninger af BFA ved at opløse BFA pulver i DMSO og gemme lagre ved-20 ° C. Overføre planteceller eller unge planter i den flydende MS medium indeholdende 10 µg/mL BFA i 30-45 min før billeddannelse.
7. Konfokal mikroskop Imaging og Protein subcellulært Co lokalisering analyse
- Overføre de unge planter eller suspension celler på en konventionel glas dias og forsigtigt sætte et cover dias oven for billeddannelse af standard Konfokal laser scanning mikroskopi. Brug følgende indstillinger: 63 X vand mål (Nielsen 1,4), 0 baggrund, 700 gevinst, 0,168 mm pixelstørrelse og photomultiplier tube detector. Excite normal god landbrugspraksis-tagged proteiner på 485 nm og opdage fluorescens på 525 nm. For RFP-tagged proteiner, ophidse på 514 nm og opdage på 575 nm.
- Beregne Co lokalisering forholdet mellem fluorescerende signaler ved hjælp af billede Jørgensen software (https://imagej.nih.gov/ij/) med den Pearson-Spearman korrelation (PSC) Co lokalisering plug-in som tidligere beskrevet8. Pearson korrelationskoefficienter eller Spearmans rang korrelationskoefficienterne er vist i resultaterne (figur 4). Producerede r-værdierne vil være fra -1 til 1. 0 viser ingen påviselige sammenhæng af to signaler, + 1 og -1 viser fuld positiv og negativ korrelation, henholdsvis, af to signaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har udviklet en robust og yderst effektiv metode til fælles udtryk for flere kimære fluorescerende fusion proteiner i planter. Det bryder gennem barriererne af de konventionelle metoder bruger flere adskilte plasmider for protein Co udtryk, som vist i figur 1A, B, via enten forbigående udtryk eller stabil genetiske transformation. I denne nye metode genererer vi en enkelt udtryk vektor, der er sammensat af flere protein udtryk kassetter at opnå protein Co udtryk ad gangen (figur 1 cD). De protein udtryk kassette funktioner semi-independently med sine egne nødvendige DNA elementer til protein udtryk. Derfor, hvert protein udtryk kassette kunne tilpasses uafhængigt ifølge forskellige krav til protein udtryk. Med hensyn til den endelige protein Co udtryk vektor fungere protein udtryk kassetter i det som grundlæggende "Lego" elementer, der kan redigeres, re konstrueret. og igen placeret bekvemt. Endvidere er en alternativ strategi for DNA molekyle forsamling, sammenkædning af flere protein udtryk kassetter og integration af DNA-fragmenter med den endelige bestemmelsessted vektor for Co udtryk for kimære fluorescerende fusion proteiner simpelthen opnåede via en optimeret isotermisk i vitro rekombination reaktion uden yderligere ekstra trin af DNA fordøjelse og samspillet. Funktionsprincip af isotermisk i vitro rekombination reaktion er illustreret i figur 2. Sammenkoblingen af flere DNA molekyler (f.eks. tre repræsentant DNA fragmenter 1-3 vist i figur 2) og deres integration med den endelige udtryk vektor er ganske enkelt og effektivt opnået ved et-trins reaktion (Se figur 2 ). Det er tilpasset fra tidligere undersøgelser af overlappende rekombination af DNA molekyler medieret med overlappende korte sekvenser at opnå fusion af DNA-fragmenter og opførelse af plasmider25,26.
Som en test af metoden valgte vi den vakuolære sortering receptor (VSR) og sekretoriske carrier membran protein (VAKS), som er to reporter proteiner deltager i protein sekretoriske og endocytose veje, henholdsvis6,22 ,23,29,30. VSRs er type-jeg integreret Membranproteiner, der mægle biosyntetiske protein trafik i sekretoriske pathway til vacuole og hovedsagelig lokaliserer i prevacuolar rum (PVC'er) i planter6,22,23. Derimod er sekretoriske carrier Membranproteiner (SCAMPs) type-IV Membranproteiner, der deltager i den plante endocytic pathway. Det lokaliserer plasma membran (PM) og trans-Golgi netværk (TGNs), der tjener som tidlig endosomes22,29,30. Vi bygget to protein udtryk kassetter, der fungerer som værter de kimære fusioner af Arabidopsis VSR2 (AtVSR2) med RFP og Arabidopsis SCAMP4 (AtSCAMP4) med normal god landbrugspraksis, som vist i figur 3. For at sikre RFP-AtVSR2 kan oversættes til Skadestuen, er et signal peptid (SP) tilføjet før RFP, som tidligere rapporteret6,31. De to individuelle protein udtryk kassetter hænger yderligere og ligate med den endelige protein udtryk vektor pUC18 eller pCAMBIA1300 for protein Co udtryk enten via protein forbigående eller plante stabil transformation, som vist i Figur 3. AtVSR2 og AtSCAMP4 var med held Co udtrykt i tobak BY-2 celler via partikel bombardement og viste korrekte lokaliseringer (figur 4A). RFP-AtVSR2 viste en punktformet mønster, som var adskilt fra plasma membran lokalisering af AtSCAMP4-normal god landbrugspraksis med nogle cytosole punktformet prikker. Derudover Arabidopsis transgene planter, der samtidig udtrykker AtSCAMP4-normal god landbrugspraksis og RFP-AtVSR2 blev genereret via Agrobacterium-medieret transformation. De subcellulært lokaliseringer Co at udtrykke RFP-AtVSR2 og AtSCAMP4-normal god landbrugspraksis i roden og rod hår celler blev vist i figur 4B og 4E. Co udtryk resultaterne af RFP-AtVSR2 og AtSCAMP4-NGL fremstillet af gensplejsede Arabidopsis var enig med dem fra BY-2 celler. Derudover de gensplejsede Arabidopsis blev behandlet med wortmannin og BFA i 30 min. Wortmmanin forårsaget RFP-AtVSR2 mærket PVC'er danner en lille ring-lignende struktur, og BFA induceret AtSCAMP-NGL mærket TGN sammenlægning, som vist i figur 4 c , D, F, G. Derudover kan lidt autofluorescent signal påvises tobak BY-2 celler og Arabidopsis rod og rod hår celler ved at anvende de samme indstillinger for billede samlingen som for figur 4 (supplerende figur 1).
Figur 1: et robust system for fælles udtryk for flere kimære fluorescerende fusion proteiner i planter. (A) konventionelle tilgange af forbigående Co udtryk for flere fluorescerende reporter proteiner i planter opnået via elektroporation, partikel bombardement og PLØK-medieret transformation ved at blande flere uafhængige udtryk vektorer. (B) den konventionelle metode til plante genetisk transformation af Agrobacterium med en enkelt fluorescerende fusion protein udtryk vektor. Co udtrykke flere kimære fluorescerende fusion proteiner i en genetisk modificeret plante, yderligere er genetiske passage og flere runder af screening nødvendig for at opnå homozygot descendenter. (C) og (D) den alternative nye protein Co udtryk metode. Det tager fordel af et enkelt udtryk vektor, som er sammensat af flere protein udtryk kassetter og er købedygtig Co express flere kimære fluorescerende reporter proteiner i planter via både forbigående udtryk og genetiske transformation. Detaljer af dette tal blev først offentliggjort i Zhong et al. 201736 (genoptrykt med tilladelse; copyright grænser i plantevidenskab). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Demonstration af Funktionsprincip af one-step DNA forsamling metode af isotermisk rekombination reaktion. DNA fragmenter og lineariseret plasmid med overlappende sekvenser (OSs) er fastgjort ved base parring mellem 5'-overhæng overlappende områder, udvidelse af DNA polymerase og sammenkædning af ligase. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: strategi for at bygge en enkelt plasmid for sammen at udtrykke flere kimære fluorescerende fusion proteiner. Diagrammet viser strategien til at konstruere et enkelt udtryk plasmid for fælles udtryk for flere kimære fluorescerende fusion proteiner enten for forbigående udtryk eller stabil transformation i planter. Udtrykket vektor er sammensat af to protein udtryk kassetter, hvoraf hver indeholder sin egen nødvendige elementer til protein udtryk og funktioner i at udtrykke sit individuelle kimære fluorescerende fusion protein semi-independently. Forsamling og samspillet af alle DNA-molekyler er bekvemt opnået ved en optimeret isotermisk i vitro rekombination metode medieret med overlappende DNA fragmenter. Detaljer af dette tal blev først offentliggjort i Zhong et al. 201736 (genoptrykt med tilladelse; copyright grænser i plantevidenskab). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentative billeder af fælles udtryk for kimære fluorescerende fusion af VSR og VAKS i plantecellerne.
(A) co udtryk af RFP-AtVSR2 og AtSCAMP4-NGL via partikel bombardement i tobak BY-2 suspension celler. (B) et repræsentativt billede af gensplejsede Arabidopsis rod celle Co udtrykker RFP-AtVSR2 og AtSCAMP4-normal god landbrugspraksis. (C) og (D) gensplejsede Arabidopsis rødder Co udtrykker RFP-AtVSR2 og AtSCAMP4-NGL blev behandlet med wortmannin og BFA i 30 min henholdsvis. (E) et repræsentativt billede af en gensplejsede Arabidopsis rod hår Co udtrykker RFP-AtVSR2 og AtSCAMP4-normal god landbrugspraksis. (F) og (G) gensplejsede Arabidopsis rodtråde Co udtrykker RFP-AtVSR2 og AtSCAMP4-NGL blev behandlet med wortmannin og BFA i 30 min. pile i (D) og (G) angive BFA-induceret protein sammenlægning. rp = Pearson korrelationskoefficienten; rs = Spearmans rang korrelation. Skalalinjen i (A)-(D) er 50 µm, (E)-(G) er 30 µm. detaljer af denne figur blev først offentliggjort i Zhong et al. 201736 (genoptrykt med tilladelse; copyright grænser i plantevidenskab). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Udtrykket kassette 1 | ||
| 1-FP35S | GAATTCGAGCTCGGTACCC ACATGGTGGAGCACGACACA | |
| 1-RP35S | AGGACGCGGGCGTGGGCCAT TATCACATCAATCCACTTGC | |
| 1-FRFP | GCAAGTGGATTGATGTGATA ATGGCCCACGCCCGCGTCCT | |
| 1-RRFP | ATTATCCATATCACTCCCCA GGCGCCGGTGGAGTGGCGGC | |
| 1-FAtVSR2 | GCCGCCACTCCACCGGCGCC TGGGGAGTGATATGGATAAT | |
| 1-RAtVSR2 | AAATGTTTGAACGATCGGGA TTACAACTCTAGTTGAGAAG | |
| 1-FNOS | CTTCTCAACTAGAGTTGTAA TCCCGATCGTTCAAACATTT | |
| 1-RNOS | GAGAATGGATGCGAGTAATG TCTAGTAACATAGATGACAC | |
| Udtrykket kassette 2 | ||
| 2-FP35S | CATTACTCGCATCCATTCTC ACATGGTGGAGCACGACACA | |
| 2-RP35S | TTAGGATCGTGTCGTGCCAT TATCACATCAATCCACTTGC | |
| 2-FAtSCAMP4 | GCAAGTGGATTGATGTGATA ATGGCACGACACGATCCTAA | |
| 2-RAtSCAMP4 | TCCTCGCCCTTGCTCACCAT TAGTGCACGCATCAAGGTCG | |
| 2-FGFP | CGACCTTGATGCGTGCACTA ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA | |
| 2-RGFP | TAAAACCAAAATCCAGTGAC TTACTTGTACAGCTCGTCCA | |
| 2-FT35S | TGGACGAGCTGTACAAGTAA GTCACTGGATTTTGGTTTTA | |
| 2-RT35S | GTCGACTCTAGAGGATCCCC GTCCGCAAAAATCACCAGTC | |
Tabel 1: Primer design strategi og sekvenser anvendes i denne undersøgelse. Navnet på hver primer er givet på panelet til venstre. De supplerende overlappende sekvenser af primere er understreget. Detaljerne i denne tabel blev først offentliggjort i Zhong et al. 201736 (genoptrykt med tilladelse; copyright grænser i plantevidenskab).
Supplerende figur 1: repræsentative billeder af autofluorescence i BY-2-celler og Arabidopsis rødder og rodtråde. (A) autofluorescence af vildtype BY-2 celler blev registreret under de samme imaging betingelser med de transformerede celler. (B) og (C) Arabidopsis rod hår og root celler blev opdaget på samme betingelser billedbehandling med de transformerede Arabidopsis celler. Skalalinjen i (A)-(C) er 20 µm. DIC, differential interferens kontrast. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi vist en roman metode håndfast Co udtrykke kimære fluorescerende fusion proteiner i planter. Det kan bruges til både forbigående udtryk og genetiske transformation og er kompatible med aktuelle fluorescerende proteiner-baseret bio-imaging, molekylære og biokemiske applikationer og teknologier9,10,13 . Derudover overvinder det vanskelighederne af de konventionelle metoder, der bruger flere individuelle udtryk plasmider for protein Co udtryk. I modsætning, beskæftiger den en enkelt udtryk vektor, der indeholder flere protein udtryk kassetter med deres egne individuelle initiativtagere, fluorescerende tags, target proteiner og terminators. Desuden kan protein udtryk kassette forvaltes uafhængigt skal opfylde forskellige udtryk krav, som brugen af en bestemt promotor og N - eller C-terminale kimære fusion af en fluorescerende proteiner med target proteinet. Derfor, protein udtryk kassette fungerer som en "Lego"-grundelement, der virker semi-uafhængigt i plasmidet. Derudover er det også et meget alsidigt system i hvilke gen redigering, udskiftning, og forsamlingen alle nemt kan opnås ved en et-trins isotermisk rekombination reaktion uden ekstra processer af enzymet fordøjelse og ligatur. Vi har optimeret effektiviteten af isotermisk rekombination reaktion fra tidligere undersøgelser, som beskrevet i trin 2.4, ved at teste forskellige koncentrationer af T5 exonuclease, Phusion DNA polymerase og Taq-polymerase. Derudover fragmenter koncentrationen af hver DNA for one-step isotermisk rekombination reaktion er foreslået til at være mellem 0,05 og 0,1 pmol opnå maksimal ligatur effektivitet.
Overdrevne udtryk for en transgenet ved at erstatte sin endogene promotor med en stærk og sammenhængende promotor, såsom ubiquitin-10 promoter (UBQ10), og at indføre yderligere kopier af genet er et vildt anvendte tilgang til at studere dets cellulære funktioner og underliggende arbejder mekanisme i celler15,32. Dog blev uventet ned-regulering og stærk hæmning af genekspression undertiden fundet samt33,34. Procentdelen af uforudsigelige genhæmning varierer fra 2 til 100% under disse situationer33,35. Derudover genhæmning har en højere chance for at ske i udtryk for flere gener samtidig, transformation af høj kopier af DNA, og betydelige stigninger i gen transcriptional niveau9,33,24 ,35. For at minimere forekomsten af genhæmning i den robuste flere fusion protein Co ekspressionssystem, valgte vi forskellige aktive initiativtagere til at drive forskellige protein udtryk kassetter, når Co udtrykker flere fusion proteiner. Derudover undgås vi hele tiden bruger de samme promotor for forskellige udtryk kassetter. En anden potentiel begrænsning af denne protokol er derudover one-step DNA isotermisk rekombination forårsaget af det stigende antal protein udtryk kassette for Co udtryk nedsat effektivitet. Desuden bygger antallet af udtryk kassetter, der kan være vært i den endelige udtryk plasmid primært på replikon rygraden plasmid24,25,35.
Tilsammen har vi udviklet et kraftfuldt system for sammen at udtrykke flere kimære fluorescerende fusion proteiner bekvemt i planter36. Det overvinder begrænsningerne i de klassiske metoder og udnytter en optimeret one-step DNA forsamling reaktion for DNA samspillet og plasmid konstruktion i en hævdvundne mode. Dette tekniske fremskridt er blevet valideret af AtVSR2 og AtSCAMP4 Co udtryk i anlægget celler via både forbigående udtryk og genetiske transformation. Derfor, det viser en overbevisende og roman metode til forskellige aspekter af videnskabelige opdagelser af co udtryk for kimære fluorescerende fusion proteiner i planter. Derudover koncept og princippet om fælles udtryk for flere kimære fluorescerende fusion proteiner via et enkelt udtryk vektor er fuldt kompatible med CRISPR-Cas9, RNAi og protein overdrevne udtryk teknologier til at studere funktionerne og samspillet mellem flere gener i planter37,38,39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takke medlemmerne af Wang laboratorium for nyttige diskussioner og kommentarer. Dette arbejde er støttet af National Natural Science Foundation of China (NSFC, bevilling nr. 31570001) og Natural Science Foundation i Guangdong provinsen og Guangzhou City (Giv nr. 2016A030313401 og 201707010024) til H.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD-FX Polymerase | TOYOBO | KFX-101 | |
| Sma I | NEB | R0141L/S/V | |
| Tris-HCl | BBI | A600194-0500 | |
| MgCl2 | BBI | A601336-0500 | |
| dNTP | NEB | #N0447V | |
| DTT | BBI | C4H10O2S2 | |
| PEG 8000 | BBI | A100159-0500 | |
| NAD | BBI | A600641-0001 | |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | NEB | M0530S | |
| Taq DNA polymerase | NEB | B9022S | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture(MS) | Sigma | M5524 | |
| Ethanol | BBI | A500737-0500 | |
| Tween 20 | BBI | A600560-0500 | |
| Agar | BBI | A505255-0250 | |
| Spermidine | BBI | A614270-0001 | |
| Gold microcarrier particles | Bio-Rad | 165-2263 | 1.0 µm |
| CaCl2 | BBI | CD0050-500 | |
| Macrocarriers | Bio-Rad | 165-2335 | |
| Rupture disk | Bio-Rad | 165-2329 | |
| Stopping screen | Bio-Rad | 165-2336 | |
| Tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Yeast Extract | OXOID | LP0021 | |
| NaCl | BBI | A610476-0001 | |
| KCl | BBI | A610440-0500 | |
| Glucose | BBI | A600219-0001 | |
| Hygromycin B | Genview | AH169-1G | |
| Wortmannin | Sigma | F9128 | |
| Brefeldin A | Sigma | SML0975-5MG | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | BBI | A600163-0500 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Growth chamber | Panasonic | MLR-352H-PC | |
| PSD-1000/He particle delivery system | Bio-Rad | 165-2257 | |
| Gene Pulser | Bio-Rad | 1652660 | |
| Cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5427000097 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 7 DUO (780&7Live) | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| EPS-300 Power Supply | Tanon | EPS 300 | |
| Fluorescent microscope | Mshot | MF30 | |
| Agrose | BBI | A600234 | |
| Ampicillin | BBI | A100339 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetie Acid | BBI | B300599 |
References
- Tsien, R. Y.
- Tsien, R. Y., Miyawaki, A.
- Wang, H. Visualizing Plant Cells in a Brand New Way. Mol Plant. 9 (5), 633-635 (2016).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
- Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A.
- Tse, Y. C., et al. Identification of multivesicular bodies as prevacuolar compartments in Nicotiana tabacum BY-2 cells. Plant Cell. 16 (3), 672-693 (2004).
- Wang, H., Zhuang, X., Cai, Y., Cheung, A. Y., Jiang, L. Apical F-actin-regulated exocytic targeting of NtPPME1 is essential for construction and rigidity of the pollen tube cell wall. Plant J. 76 (3), 367-379 (2013).
- Wang, H., et al. A Distinct Pathway for Polar Exocytosis in Plant Cell Wall Formation. Plant Physiol. 172 (2), 1003-1018 (2016).
- Canto, T. Transient Expression Systems in Plants: Potentialities and Constraints. Adv Exp Med Biol. 896, 287-301 (2016).
- Ishida, Y., Hiei, Y., Komari, T.
- Li, S., et al.
- Manavella, P. A., Chan, R. L. Transient transformation of sunflower leaf discs via an Agrobacterium-mediated method: applications for gene expression and silencing studies. Nat Protoc. 4 (11), 1699-1707 (2009).
- Martin, K., et al. Transient expression in Nicotiana benthamiana fluorescent marker lines provides enhanced definition of protein localization, movement and interactions in planta. Plant J. 59 (1), 150-162 (2009).
- Miao, Y., Jiang, L. Transient expression of fluorescent fusion proteins in protoplasts of suspension cultured cells. Nat Protoc. 2 (10), 2348-2353 (2007).
- Wang, H., Jiang, L. Transient expression and analysis of fluorescent reporter proteins in plant pollen tubes. Nat Protoc. 6 (4), 419-426 (2011).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
- Candat, A., et al. Experimental determination of organelle targeting-peptide cleavage sites using transient expression of green fluorescent protein translational fusions. Anal Biochem. 434 (1), 44-51 (2013).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Binder, A., et al. A modular plasmid assembly kit for multigene expression, gene silencing and silencing rescue in plants. PLoS One. 9 (2), e88218 (2014).
- Engler, C., et al. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synth Biol. 3 (11), 839-843 (2014).
- Forner, J., Binder, S. The red fluorescent protein eqFP611: Application in subcellular localization studies in higher plants. BMC Plant Biol. 7, 28 (2007).
- Wang, H., et al. Vacuolar sorting receptors (VSRs) and secretory carrier membrane proteins (SCAMPs) are essential for pollen tube growth. Plant J. 61 (5), 826-838 (2010).
- Wang, H., Zhuang, X. H., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. W. Vacuolar sorting receptor (VSR) proteins reach the plasma membrane in germinating pollen tubes. Mol Plant. 4 (5), 845-853 (2011).
- Chen, W. X., et al. Rapid in vitro splicing of coding sequences from genomic DNA by isothermal recombination reaction-based PCR. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 30 (5), 864-868 (2016).
- Zhu, Q. L., Yang, Z. F., Zhang, Q. Y., Chen, L. T., Liu, Y. G. Robust multi-type plasmid modifications based on isothermal in vitro recombination. Gene. 548 (1), 39-42 (2014).
- Torella, J. P., et al. Rapid construction of insulated genetic circuits via synthetic sequence-guided isothermal assembly. Nucleic Acids Res. 42 (1), 681-689 (2014).
- Siguret, V., Ribba, A. S., Cherel, G., Meyer, D., Pietu, G. Effect of plasmid size on transformation efficiency by electroporation of Escherichia coli DH5 alpha. Biotechniques. 16 (3), 422-426 (1994).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nat Protoc. 1 (2), 641-646 (2006).
- Lam, S. K., Cai, Y., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. SCAMPs highlight the developing cell plate during cytokinesis in tobacco BY-2 cells. Plant Physiol. 147 (4), 1637-1645 (2008).
- Lam, S. K., et al. Rice SCAMP1 defines clathrin-coated, trans-golgi-located tubular-vesicular structures as an early endosome in tobacco BY-2 cells. Plant Cell. 19 (1), 296-319 (2007).
- Jiang, L., Rogers, J. C. Integral membrane protein sorting to vacuoles in plant cells: evidence for two pathways. J Cell Biol. 143 (5), 1183-1199 (1998).
- Fernandez-Abalos, J. M., Fox, H., Pitt, C., Wells, B., Doonan, J. H. Plant-adapted green fluorescent protein is a versatile vital reporter for gene expression, protein localization and mitosis in the filamentous fungus, Aspergillus nidulans. Mol Microbiol. 27 (1), 121-130 (1998).
- Bruening, G.
- Wassenegger, M., Pelissier, T. A model for RNA-mediated gene silencing in higher plants. Plant Mol Biol. 37 (2), 349-362 (1998).
- Dehio, C., Schell, J. Identification of plant genetic loci involved in a posttranscriptional mechanism for meiotically reversible transgene silencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (12), 5538-5542 (1994).
- Zhong, G., Zhu, Q., Li, Y., Liu, Y., Wang, H. Once for all: A novel robust system for co-expression of multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants. Front Plant Sci. 8, 1071 (2017).
- Li, X. T., Xie, Y. Y., Zhu, Q. L., Liu, Y. G. Targeted genome editing in genes and cis-regulatory regions improves qualitative and quantitative traits in crops. Molecular Plant. 10 (11), 1368-1370 (2017).
- Zhu, Q. L., et al. Development of "purple endosperm rice'' by engineering anthocyanin biosynthesis in the endosperm with a high-efficiency transgene stacking system. Molecular Plant. 10 (7), 918-929 (2017).
- Tang, H. W., et al. Multi-step formation, evolution, and functionalization of new cytoplasmic male sterility genes in the plant mitochondrial genomes. Cell Research. 27 (1), 130-146 (2017).
