Summary
Vi har utvecklat en ny metod för samtidig uttrycker flera chimära fluorescerande fusionsproteiner i växter att övervinna svårigheterna med konventionella metoder. Det tar fördel av att använda en enda uttryck plasmid som innehåller flera funktionellt oberoende proteinet uttrycker kassetter för att uppnå samtidig proteinuttryck.
Abstract
Information om det spatiotemporal subcellulär localization(s) av ett protein som är viktigt att förstå dess fysiologiska funktioner i cellerna. Fluorescerande proteiner och generering av fluorescerande fusionsproteinerna använts vilt som ett effektivt verktyg att direkt visualisera den protein lokalisering och dynamiken i celler. Det är särskilt användbara för att jämföra dem med välkända organell markörer efter samtidig intresseanmälan med protein. Ändå klassiskt tillvägagångssätt för samtidig proteinuttryck i växter innebära brukar flera oberoende uttryck plasmider och därför har nackdelar som inkluderar låga Co uttryck effektivitet, uttryck-nivå variation och hög tid utgifter i genetiska crossing och screening. I denna studie beskriver vi en robust och ny metod för samtidig uttryck av flera chimära fluorescerande proteiner i växter. Det övervinner begränsningarna av konventionella metoder med hjälp av en enda uttryck vektor som består av flera semi-oberoende uttrycker kassetter. Varje protein uttryck kassett innehåller sin egen funktionellt protein uttryckselement, och det därför flexibelt kan justeras för att möta efterfrågan på olika uttryck. Också, det är enkelt och bekvämt att utföra montering och manipulation av DNA fragment i uttrycket plasmiden med hjälp av en optimerad one-step reaktion utan ytterligare matsmältningen och ligatur steg. Dessutom är det fullt kompatibelt med fluorescerande protein härrör bio-imaging tekniker och tillämpningar som bandet och BiFC. Som en validering av metoden anställd vi detta nya system till samtidig express fluorescently smält vakuolär sortering receptor och sekretoriska membran bärarproteiner. Resultaten visar att deras perspektiv subcellulär lokaliseringar är densamma som i tidigare studier av både övergående uttryck och genetisk förändring i växter.
Introduction
Chimära fluorescerande fusionsproteinerna har betraktats som användbara verktyg för att studera intracellulära dynamics och subcellulär lokalisering och ytterligare förstå deras fysiologiska funktioner och fungerande mekanismer1,2, 3 , 4. det är särskilt fördelaktigt att samtidig express välkända organell reporter proteiner med proteinet i fråga att bättre illustrera dess spatiotemporal logiken, distribution och funktionerna inom det endomembrane systemet i celler4 , 5 , 6 , 7 , 8.
En chimär fluorescerande fusionsprotein kan uttryckas i växter via övergående uttryck och stabil genetiska förändring, som har sina respektive fördelar och begränsningar9,10,11. Övergående uttryck av ett protein är en bekväm metod som inkluderar biolistic bombardemang-, polyetylenglykol (PEG)-, eller elektroporation-medierad DNA övergående uttryck i protoplasts och Agrobacterium-medierad leaf infiltration i intakt växtceller, som visas i figur 1A, B12,13,14,15,16. Men kräver samtidig uttryck av flera chimära fluorescerande fusionsproteinerna i en enda anläggning cell en blandning av flera oberoende uttryck plasmider. Nackdelarna med sysselsätter flera plasmider för samtidig proteinuttryck i växter är således lägre Co uttryck nivåer på grund av dramatiskt reducerade risken för flera plasmider samtidigt in samma celler jämfört med en enda plasmid, och den varianter av protein uttryck nivåer orsakas av okontrollerat slumpmässiga mängden varje typer av plasmid överförs till den cell17,18. Det är dessutom tekniskt utmanande att införa flera oberoende uttryck plasmider i en enda Agrobacterium för protein samtidig uttryck9,10,11. Därför Agrobacterium-medierad protein övergående uttryck genom infiltration av tobak lämnar är endast kan uttrycka en plasmid i taget, som visas i figur 1B. Däremot uppnås generation av transgena växter uttrycker fluorescerande fusionsproteinerna vanligen genom Agrobacterium som bär en binär omvandling vektor. Binärt vektorn som förmedlar den genöverföring och införande i växten genomen är dock endast kan uttrycka en enda fluorescerande fusion protein (figur 1B)9,10,12. Generera en transgen växt som uttrycker flera chimära fluorescerande proteiner samtidigt kräver flera rundor av genetiska korsning och screening, vilket kan ta från månader till år beroende på antalet gener att uttryckas tillsammans.
Den sysselsättning som en enda uttryck vektor samtidig uttryck av flera proteiner i växten har rapporterats av flera tidigare studier19,20,21. Dock är flera rundor av enzymatisk nedbrytning och DNA-ligering av DNA-molekyler och ryggraden vektorer vanligtvis krävs för generering av slutliga plasmiden för samtidig proteinuttryck eller över uttryck. Här har vi en ny och robust metod för samtidig uttrycker flera chimära fluorescerande proteiner i växter. Det är en mycket effektiv och bekväm metod som uppnår flera samtidig proteinuttryck i växter för både övergående uttryck och stabil omvandling i en häfdvunna mode. Det sysselsätter en enda vektor som innehåller flera funktionellt oberoende proteinet uttryck kassetter för samtidig proteinuttryck och därmed övervinner nackdelarna med konventionella metoder. Dessutom är det ett mycket mångsidiga system i vilka DNA manipulationer och montering uppnås genom en enkel one-step optimerade reaktion utan extra steg DNA matsmältningen och ligatur. Arbetsgruppen principen illustreras i figur 2. Dessutom är det helt kompatibel med nuvarande cellulära, molekylära och biokemiska metoder som är baserade på chimära fluorescerande fusionsproteinerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. primer designstrategi och DNA förstärkning
- Design primers för molekylär kloning av DNA-fragment. Primers består av 20 bp gen specifik bindning sekvenser och 20 till 25 bp 5'-änden överhäng sekvenser, som kompletterande överlappande sekvensen av intilliggande DNA-molekyler (se tabell 1 till exempel).
Obs: Efterföljande montering av varje DNA fragment, sammanlänkningen av olika protein uttryck kassetter, och integration med den slutliga uttrycket vektorn alla beror på erkännande av de intilliggande överlappande sekvenserna. - Förstärka DNA fragment, inklusive promotorn, fluorescerande reporter, målgenen och terminator, som är nödvändiga för byggandet av semi-oberoende proteinet uttryck kassetter av standard PCR reaktioner med deras motsvarande primers och hög Fidelity polymeras.
Obs: De mallar som används i denna studie för DNA amplifiering härrör från tidigare studier15,22,23. Den glödgning temperatur- och förlängning av PCR-reaktioner är primer och gen beroende.
2. DNA Fragment montering och uppförande av Protein uttryck kassetter
- Granska kvaliteten i de första omgången PCR-produkterna av DNA elektrofores och kvantifiera av spektrofotometer. Kontrollera om DNA nedbrytning och kontaminering skett av 1% agaros gelelektrofores. Den OD260/OD280 av PCR produkter bör vara mellan 1,6 och 1,8.
- Blanda olika DNA-fragment (0,05 - 0,1 pmol för varje fragment) i en ny PCR-röret till en slutlig volym av 5 µL.
Obs: Mix DNA-molekyler konstruerad för samma protein uttryck kassett tillsammans i en PCR-röret. Undvik att blanda DNAs från olika uttryck kassett tillsammans, eftersom det kommer att minska effektiviteten i DNA-församling på grund av det ökande antalet DNA-molekyler som behöver vara kopplad.
Obs: Protokollet kan pausas här. - Förbereda 5 x ISO lager buffert: 500 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM MgCl2; 1 mM deoxynucleotide (dNTP); 50 mM Ditiotreitol; 25% polyetylenglykol (PEG) 8000; och 5 mM nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD).
- Späd 1 mL 2 x master blandning från 400 µL 5 x ISO lager buffert, 7,5 enheter av T5 exonuclease, 62,5 enheter av HiFi-DNA-polymeras, 5.000 enheter Taq-polymeras (se Tabell för material), och steriliserad dubbel destillerat H2O.
Obs: Detta är anpassad från tidigare studier24,25,26. dessa volymer bör optimeras. - Alikvotens 100 µL av 2 x master blandningen per tub och förvaras vid-20 ° C.
Varning: Frekvent frysning och upptining av 2 x master blandning kan orsaka låg DNA montageverkstadseffektivitet. - Tillsätt 15 µL 2 x master blandningen i 5 µL DNA blandningen och inkubera vid 50 ° C i 60 min.
3. konstruktion av vektorn för samtidig uttryck av flera chimära fluorescerande fusionsproteiner i växter
- Förstärka hela delvis oberoende proteinet uttryck kassett med en andra omgången PCR använder produkten (0,5 - 1,0 µL) från den första omgång isotermiska församlingen reaktionen som mallen och yttersta primers (t.ex. 1-FP35S och 1-RNOS för uttryck kassett 1).
- Använd 1 enhet HiFi-polymeras i en 50 µL reaktionsvolym följt av 30 cykler (94 ° C i 30 s, 55 ° C för 30 s och 68 ° C i 2 min), följt av en sista förlängning vid 68 ° C i 5 min.
- Linjär det slutliga protein uttryck ryggraden vektorer pUC18 och pCAMBIA1300, som är utformade för övergående proteinuttryck och genetisk transformation, respektive genom att lägga till 4 enheter Sma jag in en sista 10 µL reaktionsvolym och ruvande för 1 - 2 timmar vid 25 ° C. Inaktivera restriktionsenzym genom inkubation vid 65 ° C i 20 min.
- Blanda equimolar DNA-molekyler av protein uttryck kassetter och linearized final vektorgrafik i en slutlig reaktionsvolym 5 µL. Utför sedan den andra omgången DNA-rekombination genom att blanda med 15 µL 2 x master buffert och inkubation vid 50 ° C i 60 min.
- Använda färdiga produkter av andra omgången isotermiska rekombination reaktionen för att omvandla behöriga E. coli celler (t.ex. DH5α) enligt standardförfaranden27. Dubbelkolla positiva kolonier av kolonin PCR och DNA-sekvensering. Extrahera de positiva plasmidsna från den E. coli med hjälp av en mini plasmid utvinning kit och lagra vid-80 ° C.
Försiktighet: För långsiktig lagring, plasmider upplöst i TE buffert eller dubbel destillerat H2O är mer stabila än att hålla dem i E. coli -stammar.
4. Biolistic-beskjutning medierad övergående samtidig uttryck av flera chimära fluorescerande fusionsproteiner i växter
- Förbereda tobak BY-2 suspension celler och Arabidopsis juvenil växter för beskjutning.
- Kultur BY-2-celler i Murashige och Skoog (MS) medium genom subculturing två gånger per vecka vid 25 ° C i en skakapparat 130 rpm. Filtrera samla 30 mL 3 d odlade BY-2-celler på en bit 70-mm lättbetong och autoklaverad filterpapper via en vakuumpump av inställning vakuum trycket 40 mbar.
- För att förhindra celler från att torka ut under följande steg, tillsätt flera droppar av BY-2 cell flytande kulturella medium i en petriskål innan du placerar filterpappret (nästa steg).
- Överföra filterpappret med BY-2 celler på det till en ny petriskål (85 x 15 mm).
- Yta sterilisera Arabidopsis thaliana (Col-0) frön av vortexa en blandning med 70% (v/v) etanol som innehåller 0,05% Tween-20 i 10 min.
- Snurra ner fröna med en bänk topp centrifug på max hastighet för 2 s, avlägsna supernatanten och tvätta fröna med 100% etanol en gång under 30 s. pipetten ur fröna på en nya sterila filter papper i en steril huva. Sedan lufttorka frön och sprida dem på ½ MS agarplattor.
- Lagra plattorna vid 4 ° C för 48 timmar före överföra dem till en växt tillväxt kammare med följande inställningar: 16 h ljus 8 h mörk med 120-150 µm m-2 s-1 intensitet, 22 ° C.
- Överföra 7 - dagar gamla prov växter in i en 30 mm diameter cirkel i mitten av en ny ½ MS mellan skylt att öka effektiviteten i bombardemanget.
Undvik överlappande växterna när överföring och placera dem på den nya ½ MS-plattan. - Tillsätt flera droppar ½ MS flytande medium på ytan av de växter eller vävnader att bevara fukt och förhindra uttorkning växterna ut under följande steg.
- Coat guldpartiklar med plasmid DNA.
- Vortex guld microcarrier lösning grundligt, för 3 min. förbereda en ny 1,5 mL tub.
- Sekventiellt tillsätt följande lösningar i röret och vortex: 25 µL (1,5 mg) guld partiklar, vortex 10 s; 10 µL 25.46 mg/L spermidine, vortex 10 s; 5 µL av 1µg/µL plasmid DNA, vortex 3 min; 25 µL 277.5 mg/l CaCl2 lösning, vortex 1 min.
Varning: Förvaras vortexa under detta steg. - Snurra ner den guld microcarriers med en bänk topp centrifug på max hastighet för 5 s och noggrant pipett ut supernatanten utan att störa pelleten. Tvätta med 200 µL absolut etanol och åter centrifugerade av virvel för 5-10 s. spinn ner på max hastighet för 5 s och ta bort etanol.
- Återsuspendering guld partiklarna i 18 µL av absolut etanol och alikvotens 6 µL partiklar fjädring på mitten av tre macrocarriers. Låt dem lufttorka.
- Överföra DNA i växter via partikel beskjutning.
- Ställa in partikel leveranssystemet enligt följande: 1100 psi, 28-mm Hg vakuum, 1 cm gapet avstånd och 9-cm partikel flygningen.
- Bombardera celler/växter på de medelstora agarplattan för tre gånger på tre olika positioner och sedan hålla celler/växterna mörkt omedelbart efter beskjutningen.
Försiktighet: Bära skyddsglasögon när löpande partikel leveranssystemet på grund av associering av högtrycks gas och höghastighetståg partiklar med systemet.
- Hålla bombarderade celler/växter i mörker i växt tillväxt kammaren för 6 till 72 timmar före observation av fluorescerande signaler. Ställ in växt tillväxt kammaren till 24 h mörka och 22 ° C.
Varning: Uttryck effektivitet och fluorescerande signalintensitet är arrangören-, gen- och växt/vävnad-beroende.
5. generering av stabil transgena Arabidopsis tillsammans uttrycker flera chimära fluorescerande proteiner av Agrobacterium-medierad omvandling.
- Tina de Agrobacterium behöriga cellerna (PMP90) på is och vänta i 30 min, Lägg sedan 2 µL binära vektor (100-200 ng) (beredd enligt ovan) i behöriga celler. Sitta blandningen på is i 10 min.
- Över blandningen till en pre kylda 0,1 cm elektroporation kyvetten. Infoga kyvetten i elektroporation systemet och utföra elektroporation med följande inställningar: 1.6 kV, 600 ohm, 25 µF.
- Tillsätt 1 mL av SOC flytande medium i kyvetten omedelbart efter elektroporation, pipett cellerna i en ny 1,5 mL tub och inkubera vid 28 ° C i en horisontell orbital shaker på 200 rpm för 120 min.
- Centrifugera cellerna vid 2,348 x g i rumstemperatur i 5 min, kasta majoriteten av supernatanten, försiktigt återsuspendering pelleterat cellerna med en pipettspetsen, Sprid ut dem på en LB skylt som innehåller 50 mg/L Hygromycin B och inkubera vid 28 ° C i 2-3 dagar.
- Omvandla Arabidopsis thaliana Col-0 växter med den Agrobacterium, som innehåller den binära vektor pCAMBIA1300 integrerad med flera protein uttryck kassetter, med blommiga dopp28 metoden enligt beskrivningen ovan att generera stabil transgena växter.
- Sterilisera transgena Arabidopsis frön yta genom att blanda dem med 70% (v/v) etanol som innehåller 0,05% Tween-20. Virvel för 10 min. snurra ner fröna med en bänk topp centrifug på max hastighet för 2 s, avlägsna supernatanten och tvätta fröna med 100% etanol en gång för 30 s.
- Överför med pipett ur fröna på ett sterilt filter papper i en steril huva. Därefter lufttorka och sprida dem på ½ MS agarplattor som innehåller Hygromycin B för screening positiva avkommor.
- Inkubera plattorna vid 4 ° C i 2 dagar. Sedan överföra dem till den växt tillväxt kammaren och kultur i 7 dagar.
- Välj 7 - dag-gammal överlevnad juvenil växter genom att kryssa för fluorescerande signaler under fluorescerande mikroskopet och sedan överföra växterna in smutsa för ytterligare screening av homozygot växter.
6. farmaceutiska behandlingar
- För farmaceutiska behandlingar, späd varje läkemedel i flytande MS medium till dess lämpliga arbetande koncentrationer innan inkubation med celler eller växter.
- Wortmannin behandling: Förbered 1 mM stamlösningar av wortmannin genom upplösning wortmannin pulvret i DMSO och lagra bestånd vid-20 ° C. Överföra växtceller eller juvenil växter i den flytande MS-medium som innehåller 16,5 µM wortmammin och inkubera i 30-45 min innan imaging.
- Brefeldin A (BFA) behandling: Förbered 1 mM stamlösningar av BFA genom upplösning BFA pulvret i DMSO och lagra bestånd vid-20 ° C. Överföra växtceller eller juvenil växter i den flytande MS-medium som innehåller 10 µg/mL BFA för 30-45 min innan imaging.
7. confocal Mikroskop Imaging och Protein subcellulär samtidig lokalisering analys
- Överför den juvenila plantor eller suspension celler på en konventionell glasskiva och försiktigt sätta en cover bild på toppen för avbildning av standard confocal microscopy laserscanning. Använd följande inställningar: 63 X vatten mål (N.A 1,4), 0 bakgrund, 700 vinst, 0.168 mm pixelstorlek och fotomultiplikatorn röret detektor. Excitera GFP-märkta proteiner på 485 nm och upptäcka fluorescens på 525 nm. För RFP-märkta proteiner, excitera på 514 nm och upptäcka på 575 nm.
- Beräkna förhållandet samtidig lokalisering av fluorescerande signaler med bild J programvara (https://imagej.nih.gov/ij/) med Pearson-Spearman korrelation (PSC) samtidig lokaliseringen plug-in som tidigare beskrivits8. Pearson korrelationskoefficienter eller Spearman's rank korrelationskoefficienterna redovisas resultaten (figur 4). De producerade r värdena kommer att vara från -1 till 1. 0 visar inget påvisbart samband av två signaler, medan + 1 och -1 visar fullständig positiv och negativ korrelation, respektive av två signaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har utvecklat en robust och högeffektiv metod för samtidig uttrycket av flera chimära fluorescerande fusionsproteiner i växter. Det bryter igenom hinder den konventionella metoder använder flera avskilda plasmider för samtidig proteinuttryck, som visas i figur 1A, B, via antingen övergående uttryck eller stabil genetisk transformation. I denna nya metod genererar vi en enda uttryck vektor som består av flera protein uttryck kassetter att uppnå samtidig proteinuttryck i taget (figur 1 cD). Protein uttryck kassett funktioner semi independently med egna nödvändiga DNA-element för proteinuttryck. Varje protein uttryck kassett kan därför anpassas självständigt enligt olika krav för proteinuttryck. När det gäller den slutliga protein samtidig uttryck vektorn fungerar protein uttryck kassetter i det som grundläggande ”Lego” element som kan modifieras, åter konstruerade. och åter placerad bekvämt. Dessutom uppnås en alternativ strategi för DNA molekyl montering, sammanlänkningen av flera protein uttryck kassetter och integrering av DNA-fragment med slutdestination vektorn för samtidig uttryck för chimära fluorescerande fusionsproteinerna helt enkelt via en optimerad isotermiska i vitro rekombination reaktion utan ytterligare extra steg av DNA matsmältningen och sambanden. Den arbetande principen av rekombination isotermiska in vitro- reaktionen illustreras i figur 2. Sammanlänkningen av flera DNA-molekyler (t.ex. tre företrädare DNA fragment 1-3 visas i figur 2) och deras integrering med den slutliga uttrycket vektorn uppnås enkelt och effektivt genom one-step reaktionerna (se figur 2 ). Den är anpassad från tidigare studier av överlappande rekombination av DNA-molekyler som medierad med överlappande korta sekvenser att uppnå fusion av DNA-fragment och byggandet av plasmider25,26.
Som ett test av metoden valde vi vakuolär sortering receptorn (VSR) och sekretoriska carrier membranprotein (Ludde), som är två reporter proteiner deltar i protein sekretoriska och endocytos vägar, respektive6,22 ,23,29,30. VSRs är typ-jag integrerad membranproteiner som förmedlar biosyntetiska protein trafik i Utsöndringsvägarna till vakuol och främst lokaliserar i prevacuolar fack (PVC) i växter6,22,23. Däremot är sekretoriska membran bärarproteiner (SCAMPs) typ-IV membranproteiner som deltar i anläggningen endocytic väg. Det lokaliserar till plasmamembranet (PM) och trans-Golgi nätverk (TGN), som tjänar som tidig endosomes22,29,30. Vi konstruerade två protein uttryck kassetter som värd de chimära fusioner av Arabidopsis VSR2 (AtVSR2) med RFP och Arabidopsis SCAMP4 (AtSCAMP4) med GFP, som visas i figur 3. För att säkerställa RFP-AtVSR2 kan översättas till ER, läggas en signal peptid (SP) före RFP, som tidigare rapporterats6,31. De två enskilda protein uttryck kassetterna är ytterligare sammanlänkade och ligera med slutliga protein uttryck vektor pUC18 eller pCAMBIA1300 för samtidig proteinuttryck antingen via protein övergående eller plantera stabil omvandling, som visas i Figur 3. AtVSR2 och AtSCAMP4 var framgångsrikt samarbete uttryckt i tobak BY-2 celler via partikel beskjutning och visade rätt lokaliseringar (figur 4A). RFP-AtVSR2 visade en punktuell mönster, som var åtskild från plasmamembranet localizationen av AtSCAMP4-GFP med några cytosoliska punktuell prickar. Dessutom Arabidopsis transgena växter som tillsammans uttrycker AtSCAMP4-GFP och RFP-AtVSR2 var genereras via Agrobacterium-medierad omvandling. De subcellulär lokaliseringar av samtidig uttrycker RFP-AtVSR2 och AtSCAMP4-GFP i rot och rotahåret celler visades i figur 4B och 4E. Samtidig uttryck resultaten av RFP-AtVSR2 och AtSCAMP4-GFP erhållits från transgena Arabidopsis var överens med de från BY-2-celler. Dessutom den transgena Arabidopsis behandlades med wortmannin BFA för 30 min. Wortmmanin orsakade RFP-AtVSR2 märkt PVC bildar en liten ringliknande struktur och BFA inducerad AtSCAMP-GFP märkt TGN aggregering, som visas i figur 4 c , D, F, G. Dessutom kan lite autofluorescent signal upptäckas i tobak BY-2 och Arabidopsis rot och rotahåret celler genom att tillämpa samma inställningar av bildsamling när det gäller figur 4 (kompletterande Figur1).
Figur 1: ett robust system för samtidig uttryck av flera chimära fluorescerande fusionsproteiner i växter. (A) konventionella metoder av övergående samtidig uttryck av flera fluorescerande reporter proteiner i växter uppnåtts via elektroporation, partikel beskjutning och PEG-medierad omvandling genom att blanda flera oberoende uttryck vektorer. (B) den konventionella metoden för växt genetisk transformation av Agrobacterium med en enda fluorescerande fusion protein uttryck vektor. Att samtidigt uttrycka flera chimära fluorescerande fusionsproteinerna i en transgen växt, ytterligare genetiska korsning och flera rundor av screening krävs för att erhålla homozygot avkommor. (C) och (D) den alternativa nya protein samtidig uttryck metoden. Det tar fördel av en enda uttryck vektor, som består av flera protein uttryck kassetter och kunna tillsammans uttrycka flera chimära fluorescerande reporter proteiner i växter via både övergående uttryck och genetisk transformation. Detaljer för denna siffra publicerades först i Zhong o.a. 201736 (omtryckt med tillåtelse; copyright gränser i växtbiologi). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Demonstration av den arbetande principen av one-step DNA montering metod av isotermiska rekombination reaktion. De DNA-fragment och linearized plasmid med överlappande sekvenser (OSs) är fäst vid basen paring mellan 5'-överhänget överlappande regioner, förlängning av DNA-polymeras och länkning av ligase. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: strategi att bygga en enda plasmid för samtidig uttrycker flera chimära fluorescerande fusionsproteinerna. Diagrammet visar strategin för att bygga en enda uttryck plasmid av samtidig uttryck för flera chimära fluorescerande fusionsproteinerna antingen för övergående uttryck eller stabil omvandling i växter. Uttrycket vektorn består av två protein uttryck kassetter, som alla innehåller sina egna nödvändiga element för proteinuttryck och funktioner att uttrycka sin individuella chimära fluorescerande fusionsprotein semi independently. Montering och sambanden alla de DNA-molekyler har bekvämt uppnåtts genom en optimerad isotermiska i vitro rekombination metod medierad med överlappande DNA fragmenten. Detaljer för denna siffra publicerades först i Zhong o.a. 201736 (omtryckt med tillåtelse; copyright gränser i växtbiologi). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Representativa bilder av samtidig uttryck av chimära fluorescerande sammansmältning av VSR och Ludde i växtceller.
(A) samtidig uttryck av RFP-AtVSR2 och AtSCAMP4-GFP via partikel beskjutning i tobak BY-2 suspension celler. (B) en representativ bild av en transgen Arabidopsis rot cell tillsammans uttrycker RFP-AtVSR2 och AtSCAMP4-GFP. (C) och (D) transgena Arabidopsis rötter tillsammans uttrycker RFP-AtVSR2 och AtSCAMP4-GFP behandlades med wortmannin och BFA för 30 min respektive. (E) en representativ bild av en transgen Arabidopsis rot hår tillsammans uttrycker RFP-AtVSR2 och AtSCAMP4-GFP. (F) och (G) transgena Arabidopsis rothår tillsammans uttrycker RFP-AtVSR2 och AtSCAMP4-GFP behandlades med wortmannin och BFA för 30 min. pilarna i (D) och (G) ange BFA-inducerad protein aggregation. rp = Pearsons korrelationskoefficient; rs = Spearman's rank korrelation. Skalstapeln i (A)-(D) är 50 µm, (E)-(G) är 30 µm. Detaljer för denna siffra publicerades först i Zhong o.a. 201736 (omtryckt med tillåtelse; copyright gränser i växtbiologi). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Uttryck kassett 1 | ||
| 1-FP35S | GAATTCGAGCTCGGTACCC ACATGGTGGAGCACGACACA | |
| 1-RP35S | AGGACGCGGGCGTGGGCCAT TATCACATCAATCCACTTGC | |
| 1-FRFP | GCAAGTGGATTGATGTGATA ATGGCCCACGCCCGCGTCCT | |
| 1-RRFP | ATTATCCATATCACTCCCCA GGCGCCGGTGGAGTGGCGGC | |
| 1-FAtVSR2 | GCCGCCACTCCACCGGCGCC TGGGGAGTGATATGGATAAT | |
| 1-RAtVSR2 | AAATGTTTGAACGATCGGGA TTACAACTCTAGTTGAGAAG | |
| 1-FNOS | CTTCTCAACTAGAGTTGTAA TCCCGATCGTTCAAACATTT | |
| 1-RNOS | GAGAATGGATGCGAGTAATG TCTAGTAACATAGATGACAC | |
| Uttryck kassett 2 | ||
| 2-FP35S | CATTACTCGCATCCATTCTC ACATGGTGGAGCACGACACA | |
| 2-RP35S | TTAGGATCGTGTCGTGCCAT TATCACATCAATCCACTTGC | |
| 2-FAtSCAMP4 | GCAAGTGGATTGATGTGATA ATGGCACGACACGATCCTAA | |
| 2-RAtSCAMP4 | TCCTCGCCCTTGCTCACCAT TAGTGCACGCATCAAGGTCG | |
| 2-FGFP | CGACCTTGATGCGTGCACTA ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA | |
| 2-RGFP | TAAAACCAAAATCCAGTGAC TTACTTGTACAGCTCGTCCA | |
| 2-FT35S | TGGACGAGCTGTACAAGTAA GTCACTGGATTTTGGTTTTA | |
| 2-RT35S | GTCGACTCTAGAGGATCCCC GTCCGCAAAAATCACCAGTC | |
Tabell 1: Primer designstrategi och sekvenser som används i denna studie. Namnet på varje primer ges i den vänstra panelen. De kompletterande överlappande sekvenserna av primers är understrukna. Detaljer för den här tabellen publicerades först i Zhong o.a. 201736 (omtryckt med tillåtelse; copyright gränser i växtbiologi).
Kompletterande Figur1: representativa bilder av autofluorescens i BY-2-celler och Arabidopsis rötter och rothår. (A) autofluorescens av vildtyp BY-2 celler upptäcktes på samma avbildning villkor med transformerade celler. (B) och (C) Arabidopsis rot hår och rota celler upptäcktes på samma avbildning villkor med transformerade Arabidopsis celler. Skalstapeln i (A)-(C) är 20 µm. DIC, differentiell störningar kontrast. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här har vi visat en ny metod för att kraftfullt samarbete express chimära fluorescerande fusionsproteiner i växter. Det kan användas för både övergående uttryck och genetisk transformation och är kompatibel med nuvarande fluorescerande protein-baserade bio-imaging, molekylära och biokemiska tillämpningar och tekniker9,10,13 . Dessutom övervinner det svårigheterna med konventionella metoder som använder flera individuella uttryck plasmider för protein samtidig uttrycket. Däremot sysselsätter den en enda uttryck vektor som innehåller flera protein uttryck kassetter med sina egna enskilda förslagsställare, fluorescerande taggar, målproteiner och terminators. Dessutom kan protein uttryck kassetten hanteras oberoende att möta skiftande uttryck krav, såsom användning av en specifik promotor och N - eller C-terminal chimära fusion av ett fluorescerande protein med målproteinet. Därför som de protein uttryck kassett fungerar en ”Lego” grundelementet som fungerar delvis självständigt i Plasmiden. Dessutom är det också ett mycket mångsidiga system i vilken gen som redigering, ersättare, och församlingen alla enkelt kan uppnås genom en one-step isotermiska rekombination reaktion utan extra processer av enzymet matsmältningen och ligatur. Vi har optimerat effektiviteten i isotermiska rekombination reaktion från tidigare studier, som beskrivs i steg 2,4, genom att testa olika koncentrationer av T5 exonuclease, Phusion DNA-polymeras och Taq polymeras. Koncentrationen av varje DNA fragment dessutom för one-step isotermiska rekombination reaktionen föreslås vara mellan 0,05 och 0,1 pmol för att uppnå maximal ligering effektivitet.
Över uttryck av en transgen genom att ersätta dess endogena arrangören med en stark och kontinuerlig promotorn, såsom ubiquitin-10 arrangören (UBQ10), och att införa ytterligare kopior av genen är en vilt används metod att studera dess cellulära funktioner och underliggande arbetsmekanism i celler15,32. Dock hittades oväntade down-förordning och stark hämning av genuttrycket ibland samt33,34. Procentandelen av oförutsägbara nedtystning varierar från 2 till 100% under dessa situationer33,35. Dessutom nedtystning har en högre chans att hända i uttryck av flera gener samtidigt, omvandling av hög kopior av DNA och betydande ökningar av genen transkriptionell nivå9,33,24 ,35. För att minimera förekomsten av nedtystning i den robusta flera fusion protein samtidig uttryck systemet, valde vi olika aktiva initiativtagare att köra olika protein uttryck kassetterna när Co uttrycker flera fusionsproteinerna. Vi undvek dessutom ständigt med samma arrangören för olika uttryck kassetter. En annan potentiell begränsning av detta protokoll är dessutom minskad effektivitet isotermiska one-step DNA-rekombination som orsakas av det ökande antalet protein uttryck kassett för samtidig uttryck. Dessutom åberopat antalet uttryck kassetter som kan vara värd i den slutliga uttrycket plasmiden främst att replicon av ryggraden plasmid24,25,35.
Tillsammans har vi utvecklat ett kraftfullt system för samtidig uttrycker flera chimära fluorescerande fusionsproteinerna bekvämt i växter36. Det övervinner begränsningarna i de klassiska metoderna och utnyttjar en optimerad one-step DNA församlingen reaktion för DNA sambanden och plasmid konstruktion i en häfdvunna mode. Detta tekniska framsteg har validerats av AtVSR2 och AtSCAMP4 samtidig uttryck i växten celler via både övergående uttryck och genetisk transformation. Därför, det visar en övertygande och ny metod för olika aspekter av vetenskapliga upptäckter av samtidig uttryck av chimära fluorescerande fusionsproteiner i växter. Dessutom begreppet och principen om samtidig uttryck av flera chimära fluorescerande fusionsproteinerna via en enda uttryck vektor är fullt kompatibla med CRISPR-Cas9, RNAi och protein över uttryck teknik att studera funktionerna och interaktioner av flera gener i växter37,38,39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar medlemmarna av Wang laboratoriet för bra diskussioner och kommentarer. Detta arbete stöds av den National Natural Science Foundation Kina (NSFC, grant nr 31570001) och naturvetenskap Foundation i provinsen Guangdong och Guangzhou City (bevilja nr 2016A030313401 och 201707010024) att H.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD-FX Polymerase | TOYOBO | KFX-101 | |
| Sma I | NEB | R0141L/S/V | |
| Tris-HCl | BBI | A600194-0500 | |
| MgCl2 | BBI | A601336-0500 | |
| dNTP | NEB | #N0447V | |
| DTT | BBI | C4H10O2S2 | |
| PEG 8000 | BBI | A100159-0500 | |
| NAD | BBI | A600641-0001 | |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | NEB | M0530S | |
| Taq DNA polymerase | NEB | B9022S | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture(MS) | Sigma | M5524 | |
| Ethanol | BBI | A500737-0500 | |
| Tween 20 | BBI | A600560-0500 | |
| Agar | BBI | A505255-0250 | |
| Spermidine | BBI | A614270-0001 | |
| Gold microcarrier particles | Bio-Rad | 165-2263 | 1.0 µm |
| CaCl2 | BBI | CD0050-500 | |
| Macrocarriers | Bio-Rad | 165-2335 | |
| Rupture disk | Bio-Rad | 165-2329 | |
| Stopping screen | Bio-Rad | 165-2336 | |
| Tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Yeast Extract | OXOID | LP0021 | |
| NaCl | BBI | A610476-0001 | |
| KCl | BBI | A610440-0500 | |
| Glucose | BBI | A600219-0001 | |
| Hygromycin B | Genview | AH169-1G | |
| Wortmannin | Sigma | F9128 | |
| Brefeldin A | Sigma | SML0975-5MG | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | BBI | A600163-0500 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Growth chamber | Panasonic | MLR-352H-PC | |
| PSD-1000/He particle delivery system | Bio-Rad | 165-2257 | |
| Gene Pulser | Bio-Rad | 1652660 | |
| Cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5427000097 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 7 DUO (780&7Live) | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| EPS-300 Power Supply | Tanon | EPS 300 | |
| Fluorescent microscope | Mshot | MF30 | |
| Agrose | BBI | A600234 | |
| Ampicillin | BBI | A100339 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetie Acid | BBI | B300599 |
References
- Tsien, R. Y.
- Tsien, R. Y., Miyawaki, A.
- Wang, H. Visualizing Plant Cells in a Brand New Way. Mol Plant. 9 (5), 633-635 (2016).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
- Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A.
- Tse, Y. C., et al. Identification of multivesicular bodies as prevacuolar compartments in Nicotiana tabacum BY-2 cells. Plant Cell. 16 (3), 672-693 (2004).
- Wang, H., Zhuang, X., Cai, Y., Cheung, A. Y., Jiang, L. Apical F-actin-regulated exocytic targeting of NtPPME1 is essential for construction and rigidity of the pollen tube cell wall. Plant J. 76 (3), 367-379 (2013).
- Wang, H., et al. A Distinct Pathway for Polar Exocytosis in Plant Cell Wall Formation. Plant Physiol. 172 (2), 1003-1018 (2016).
- Canto, T. Transient Expression Systems in Plants: Potentialities and Constraints. Adv Exp Med Biol. 896, 287-301 (2016).
- Ishida, Y., Hiei, Y., Komari, T.
- Li, S., et al.
- Manavella, P. A., Chan, R. L. Transient transformation of sunflower leaf discs via an Agrobacterium-mediated method: applications for gene expression and silencing studies. Nat Protoc. 4 (11), 1699-1707 (2009).
- Martin, K., et al. Transient expression in Nicotiana benthamiana fluorescent marker lines provides enhanced definition of protein localization, movement and interactions in planta. Plant J. 59 (1), 150-162 (2009).
- Miao, Y., Jiang, L. Transient expression of fluorescent fusion proteins in protoplasts of suspension cultured cells. Nat Protoc. 2 (10), 2348-2353 (2007).
- Wang, H., Jiang, L. Transient expression and analysis of fluorescent reporter proteins in plant pollen tubes. Nat Protoc. 6 (4), 419-426 (2011).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
- Candat, A., et al. Experimental determination of organelle targeting-peptide cleavage sites using transient expression of green fluorescent protein translational fusions. Anal Biochem. 434 (1), 44-51 (2013).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Binder, A., et al. A modular plasmid assembly kit for multigene expression, gene silencing and silencing rescue in plants. PLoS One. 9 (2), e88218 (2014).
- Engler, C., et al. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synth Biol. 3 (11), 839-843 (2014).
- Forner, J., Binder, S. The red fluorescent protein eqFP611: Application in subcellular localization studies in higher plants. BMC Plant Biol. 7, 28 (2007).
- Wang, H., et al. Vacuolar sorting receptors (VSRs) and secretory carrier membrane proteins (SCAMPs) are essential for pollen tube growth. Plant J. 61 (5), 826-838 (2010).
- Wang, H., Zhuang, X. H., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. W. Vacuolar sorting receptor (VSR) proteins reach the plasma membrane in germinating pollen tubes. Mol Plant. 4 (5), 845-853 (2011).
- Chen, W. X., et al. Rapid in vitro splicing of coding sequences from genomic DNA by isothermal recombination reaction-based PCR. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 30 (5), 864-868 (2016).
- Zhu, Q. L., Yang, Z. F., Zhang, Q. Y., Chen, L. T., Liu, Y. G. Robust multi-type plasmid modifications based on isothermal in vitro recombination. Gene. 548 (1), 39-42 (2014).
- Torella, J. P., et al. Rapid construction of insulated genetic circuits via synthetic sequence-guided isothermal assembly. Nucleic Acids Res. 42 (1), 681-689 (2014).
- Siguret, V., Ribba, A. S., Cherel, G., Meyer, D., Pietu, G. Effect of plasmid size on transformation efficiency by electroporation of Escherichia coli DH5 alpha. Biotechniques. 16 (3), 422-426 (1994).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nat Protoc. 1 (2), 641-646 (2006).
- Lam, S. K., Cai, Y., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. SCAMPs highlight the developing cell plate during cytokinesis in tobacco BY-2 cells. Plant Physiol. 147 (4), 1637-1645 (2008).
- Lam, S. K., et al. Rice SCAMP1 defines clathrin-coated, trans-golgi-located tubular-vesicular structures as an early endosome in tobacco BY-2 cells. Plant Cell. 19 (1), 296-319 (2007).
- Jiang, L., Rogers, J. C. Integral membrane protein sorting to vacuoles in plant cells: evidence for two pathways. J Cell Biol. 143 (5), 1183-1199 (1998).
- Fernandez-Abalos, J. M., Fox, H., Pitt, C., Wells, B., Doonan, J. H. Plant-adapted green fluorescent protein is a versatile vital reporter for gene expression, protein localization and mitosis in the filamentous fungus, Aspergillus nidulans. Mol Microbiol. 27 (1), 121-130 (1998).
- Bruening, G.
- Wassenegger, M., Pelissier, T. A model for RNA-mediated gene silencing in higher plants. Plant Mol Biol. 37 (2), 349-362 (1998).
- Dehio, C., Schell, J. Identification of plant genetic loci involved in a posttranscriptional mechanism for meiotically reversible transgene silencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (12), 5538-5542 (1994).
- Zhong, G., Zhu, Q., Li, Y., Liu, Y., Wang, H. Once for all: A novel robust system for co-expression of multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants. Front Plant Sci. 8, 1071 (2017).
- Li, X. T., Xie, Y. Y., Zhu, Q. L., Liu, Y. G. Targeted genome editing in genes and cis-regulatory regions improves qualitative and quantitative traits in crops. Molecular Plant. 10 (11), 1368-1370 (2017).
- Zhu, Q. L., et al. Development of "purple endosperm rice'' by engineering anthocyanin biosynthesis in the endosperm with a high-efficiency transgene stacking system. Molecular Plant. 10 (7), 918-929 (2017).
- Tang, H. W., et al. Multi-step formation, evolution, and functionalization of new cytoplasmic male sterility genes in the plant mitochondrial genomes. Cell Research. 27 (1), 130-146 (2017).
