Summary

استخدام الماوس بويضات لتقييم وظيفة الجينات البشرية أثناء الانقسام الاختزالي أنا

Published: April 10, 2018
doi:

Summary

المتغيرات الجينية المرتبطة بأمراض الإنسان تبدأ لتصبح كشف، تزداد أهمية وضع نظم لتقييم سرعة الأهمية البيولوجية لتلك المتغيرات التي تم تحديدها. ويصف هذا البروتوكول الأساليب لتقييم وظيفة الجينات البشرية أثناء الانقسام الاختزالي الإناث الأول باستخدام بويضات الماوس.

Abstract

هو انيوبلويدي الجنينية الوراثية السبب الرئيسي للعقم لدى البشر. تنشأ معظم هذه الأحداث أثناء الانقسام الاختزالي الإناث، وأن كان ارتباطاً إيجابيا بسن الأمهات، العمر وحدها ليست دائماً التنبؤية لخطر توليد جنين أنيوبلويد. ولذلك، قد حساب المتغيرات الجينات للعزل الصبغي غير صحيحة أثناء تكون البويضات. نظراً لأن الحصول على بويضات بشرية محدودة لأغراض البحوث، وضعت سلسلة من الاختبارات لدراسة الجينات البشرية الدالة أثناء الانقسام الاختزالي الأول باستخدام الماوس بويضات. أولاً، يتم ميكروينجيكتيد رسول الحمض النووي الريبي (مرناً) الجينات والجينات البديل من الفائدة في الطور الأول-اعتقلت الماوس بويضات. بعد السماح بوقت للتعبير، تطلق بويضات شكل متزامن في نضوج هو استكمال الانقسام الاختزالي أنا. يمكن تقييم تعريب البروتين البشري بعلامات مرناً مع تسلسل مراسل الفلورية، مثل البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل)، بالإضافة إلى التعديلات المظهرية. على سبيل المثال، اكتساب أو فقدان وظيفة يمكن أن يحقق بتهيئة الظروف التجريبية التي تشكل تحديا للمنتج الجيني لإصلاح الأخطاء هو. على الرغم من أن هذا النظام مفيد في التحقيق وظيفة البروتين البشري أثناء تكون البويضات، ينبغي الاضطلاع بالتفسير الملائم للنتائج نظراً لأن تعبير البروتين ليس على المستويات المحلية، وإذا لم تسيطر على (أي طرقت بها أو لأسفل)، homologs موريني موجودة أيضا في النظام.

Introduction

العقم هو حالة تؤثر على 10-15% السكان في سن الإنجاب 1، منها قرابة نصف التماس العلاج الطبي 2. على الرغم من أن مسببات العقم متنوعة وفي كثير من الحالات المتعددة العوامل، التشوهات الوراثية الأكثر شيوعاً في البشر هو انيوبلويدي الجنينية 3. انيوبلويدي يعرف بأنه الانحراف (الربح أو الخسارة) للعدد الصحيح من الكروموسومات في خلية. ظاهرة انيوبلويدي في الأجنة البشرية أمر شائع، ويزداد مع تقدم السن الأمهات 4،5. وقد أبرزت أربع تجارب معشاة الاستفادة من اختيار الأجنة (يوبلويد) فقط تشروموسومالي العادية لنقل الرحم لأن هذه الاستراتيجية أدت إلى غرس زيادة معدلات ومعدلات الإجهاض أقل ووقت أقصر تحقيق الحمل 6،7،،من89. ولذلك، فهم مسببات انيوبلويدي البشرية يمكن لها آثار هامة في المساعدة على الإنجاب.

وبالرغم من أن زرع قبل الاختبارات الجينية أنيوبلويديس مفيد في علاج العقم، تزال مفتقدة فهم دقيق للطريقة التي تنشأ بها أنيوبلويديس. من المقبول على نطاق واسع أن هناك علاقة متبادلة إيجابية هو أنيوبلويديس (نشأت أثناء إنتاج مشيج) وسن الأمهات، غير أن بعض النساء معدلات انيوبلويدي الجنينية الحالية التي تحيد عن معدل متوسط ل سن معين على 4. هذه الحالات تشير إلى أن السن وحدها ليست دائماً التنبؤية لخطر توليد جنين أنيوبلويد. عوامل أخرى قد تلعب دوراً في زيادة خطر انيوبلويدي الجنينية، مثل المتغيرات الجينات.

أحد جوانب رئيسية للتحقيق في إمكانية مساهمة متغير الجيني إلى انيوبلويدي أثناء الانقسام الاختزالي البويضيه تصميم نظام لتقييم سرعة وظيفة الجينات هو. بسبب القيود الأخلاقية ووصول محدود، ومن غير العملي لإجراء هذه التجارب باستخدام البويضات البشرية. هذه المسائل يمكن التحايل عليها باستخدام الماوس بويضات، وهنا سلسلة من الاختبارات لتقييم وظيفة الجينات البشرية أثناء الانقسام الاختزالي الأول وصف. قبل ميكروينجيكتينج الحمض النووي الريبي الرسول (مرناً) الترميز للبديل الجينات للفائدة، يمكن تصور تعريب البروتين البشري في البيض الماوس وتستخدم لتحديد إذا كان التعبير حمل خارج الرحم من البروتين البشري البرية من نوع وتحور ينتج أي التعديلات المظهرية التي يمكن أن تؤدي إلى انيوبلويدي. تعمل هذه تشمل زيادة في microtubules التي تعلقها على غير لائق للأخت كينيتوتشوري وعدم القدرة على دعم المحاذاة كروموسوم في الطورية للانقسام الاختزالي أولاً الأهم من ذلك، يمكن استخدام هذا البروتوكول للتحقيق في اكتساب وفقدان وظيفة المتغيرات الجينية بتهيئة ظروف تجريبية محددة لتحدي الأحداث الرئيسية في الانقسام الاختزالي البويضيه مثل مغزل محاذاة المبنى وكروموسوم 10.

Protocol

1. الاستنساخ الجزيئي الحصول على كامل طول التسلسل ترميز الجينات للفائدة وناقلات بلازميد النسخ في المختبر (بيفت)11.ملاحظة: استنساخ كامل طول كدنا المتوفرة تجارياً من مختلف البائعين أو يمكن أن تتولد عن طريق النسخ العكسي تفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-PCR). المركز الوطني ل…

Representative Results

بعد في المختبر سيكون النسخ عالية الجودة الجيش الملكي النيبالي نسبة A260/A280 (1.8-2-2) و ≥1.7 نسبة A260/A230 عندما تقاس باستخدام جهاز المطياف الضوئي. وتظهر الصورة في الشكل 1 الهجرة في المختبر-إنتاج الحمض النووي الريبي على [اغروس] هلام يشوه بعد التفريد. يمكن أن …

Discussion

بسبب تحديد المتغيرات الجينية البشرية المرتبطة بالمرض السريع والمتزايد، من الضروري أن يتم إنشاء نظم لتقييم أهميتها البيولوجية. فهم وظيفة البروتين في الانقسام الاختزالي البشرية يطرح تحديات خاصة نظراً لأن بويضات بشرية ثمينة والحيوانات المنوية نادرة والبشرية ليست قابلة للتلاعب بالجينات. ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

بتأييد هذا العمل “منحة بحثية” من “الجمعية الأمريكية” “الطب الإنجابي” وتشارلز وجوانا بوسكه الصندوق التذكاري في روتجرز، “جامعة الدولة في نيوجيرسي” “يماثل كانساس” تدعمها منحة من N.I.H. (F31 HD0989597).

Materials

0.2 mL Seal-Rite PCR tube USA Scientific 1602-4300
1 kb DNA Ladder Thermo Scientific SM0313
100 bp DNA Ladder Thermo Scientific SM0243
6X DNA loading Dye Thermo Scientific R0611
9-well glass spot plate Thomas Scientific 7812G17
Agarose Sigma Aldrich A9539
Albumin from bovine serum  Sigma-Aldrich A3294 
Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG Thermo Scientific A21050 1:200 dilution
Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG Thermo Scientific A21091 1:200 dilution
Ampicillin VWR AA0356
Anti-vibration table Technical Manufacturing Corp any standard model
Anti-Acetylated Tubulin antibody Sigma Aldrich T7451 1:100 diution
Anti-centromeric (CREST) antibody Antibodies Incorportated 15-234 1:30 dilution 
Barrier (Filter) Pipette tips Thermo Scientific AM12635 Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors. 
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani) Fisher Scientific DF0445-07-6
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani) Fisher Scientific DF0446-07-5
Capillary tubing Sutter B100-75-10
Center Well organ culture dish VWR 25381-141
CO2 tank For incubator
Confocal microscope Zeiss any standard model
Centrifuge (With cooling ability) Thomas Scientific any standard model 
Cover Glass 11 x 22 mm Thomas Scientific 6663F10
Coverslips Thomas Scientific 6663-F10 thickness will vary for particular microscopes
DAPI Sigma Aldrich D9542
DEPC H20 Life Technologies AM9922
Digital Dry Bath Thermo Scientific 888700001
Easy A high fidelity cloning enzyme Agilent 600400 For DNA cloning 
Enzymes for linearizing pIVT New England Biolabs NdeI or KasI can be used
Ethidium Bromide Thermo Scientific 155585011
Fluorescent Microscope  Any Fluorescent microscope may be used
Formaldehyde (37%) Thermo Fisher Scientifc 9311
Formaldehyde RNA loading dye Ambion 8552
Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm Fisher Scientific 12-544-3
Full Length cDNA Clones Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones
Gel electrophoresis apparatus Bio-Rad any standard model
Glass Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-200
Globin Forward Primer for pIVT Construct 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'.  Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides
Globin Reverse Primer for pIVT Construct 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides
Holding pipettes Eppendorf 930001015 Vacutip
Humidified Chamber Tupperware can be used
Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads GE Life Sciences 27925901
Incubator any standard model with CO2 and water jacketed technology
Inverted Microscope Nikon instruments Any Standard model
Image J (NIH) Software NIH Image Analysis software
Lid of 96 well plate Nalgene Nunc International 263339
Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube USA Scientific 1405-2600
MacVector  MacVector Sequence analysis software
MG132 Selleckchem S2619
Microscope slides Fisher Scientific 12-544-3 
Millenium RNA Markers-Formaldehyde  Ambion AM7151
Milrinone Sigma-Aldrich M4659 Resuspend in DMSO at 2.5mM
Mineral Oil Sigma-Aldrich M5310 Only used embryo-tested, sterile-filtered
Monastrol Sigma-Aldrich M8515 Resuspend in DMSO at 100 mM
Mouthpiece Biodiseno MP-001-Y
N2 tank for antivibration table
Nail Polish; Clear Any clear nailpolish can be used
NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific any standard model
NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer Life Technologies AM8676
NorthernMax 10X Running buffer Life Technologies AM8671
NuPAGE MOPS SDS Running buffer Thermo Scnentific NP0001
Organ Culture Dish 60x15mm Life Technologies 08-772-12
Paraformaldehyde Polysciences, Inc.  577773
PCR Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific 4484075
Petri Dish 139 mm Thermo Fisher Scientifc 501V
Petri dish 35 mm Thermo Fisher Scientifc 121V
Petri Dish 60 mm Falcon BD 351007
Picoinjector XenoWorks Digital Microinjector any standard model
Pipette puller Flaming-Brown Micropipette puller Model P-1000
pIVT plasmid AddGene 32374 Empty vector suitable for oocyte expression.
Pregnant Mare Serum Gonadotropin Lee BioSolutions 493-10
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104 purification of up to 20 uL of plasmid DNA
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104
Quikchange II site directed mutagenesis kit Agilent  200523 mutagenesis kit for insertions and deletions
Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit Agilent  210512 mutagenesis kit for single site changes
Scissors (Fine point) Fine science tools 14393
Scissors (Medium point) Fine science tools WP114225
Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube USA Scientific 1615-5500
Slide Warmer any standard model
Spectrophotometer (Nanodrop) Thermo Fisher Scientific ND-ONE-W
Stereomicroscope any standard model
Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells Thermo Fisher Scientifc 18265017
Syringe BD Bioscienes 309623 1 ml, 27G(1/2)
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202L
T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit Life Technologies AM1340
TritonX-100 Sigma-Aldrich x-100
Tween-20 Sigma-Aldrich 274348
Tweezer (Fine point- Size 5) Fine science tools SN.743.12.1
UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water Thermo Fisher Scientifc 10977015
UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL Thermo Fisher Scientifc 15585011
UVP UV/White lite transilluminator Fisher Scientific UV95041501
Vectashield Mounting Medium Vector Laboratories H-1000

References

  1. Thoma, M. E., et al. Prevalence of infertility in the United States as estimated by the current duration approach and a traditional constructed approach. Fertil Steril. 99 (5), 1324-1331 (2013).
  2. Boivin, J., Bunting, L., Collins, J. A., Nygren, K. G. International estimates of infertility prevalence and treatment-seeking: potential need and demand for infertility medical care. Human Reproduction. 22 (6), 1506-1512 (2007).
  3. Treff, N. R., Zimmerman, R. S. Advances in Preimplantation Genetic Testing for Monogenic Disease and Aneuploidy. Annu Rev Genomics Hum Genet. , (2017).
  4. Franasiak, J. M., et al. The nature of aneuploidy with increasing age of the female partner: a review of 15,169 consecutive trophectoderm biopsies evaluated with comprehensive chromosomal screening. Fertil Steril. 101 (3), 656-663 (2014).
  5. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
  6. Scott, R. T. Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertil Steril. 100 (3), 697-703 (2013).
  7. Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertil Steril. 100 (3), 624-630 (2013).
  8. Yang, Z., et al. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Mol Cytogenet. 5 (1), 24 (2012).
  9. Rubio, C., et al. In vitro fertilization with preimplantation genetic diagnosis for aneuploidies in advanced maternal age: a randomized, controlled study. Fertil Steril. 107 (5), 1122-1129 (2017).
  10. Nguyen, A. L., et al. Identification and characterization of Aurora Kinase B and C variants associated with maternal aneuploidy. Mol Hum Reprod. , (2017).
  11. Igarashi, H., Knott, J. G., Schultz, R. M., Williams, C. J. Alterations of PLCbeta1 in mouse eggs change calcium oscillatory behavior following fertilization. Dev Biol. 312 (1), 321-330 (2007).
  12. Database, J. S. E. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE. , (2017).
  13. Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 738-742 (2013).
  14. Armstrong, J. A., Schulz, J. R. . Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , (2008).
  15. Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).
  16. Watanabe, Y. Geometry and force behind kinetochore orientation: lessons from meiosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (6), 370-382 (2012).
  17. Shuda, K., Schindler, K., Ma, J., Schultz, R. M., Donovan, P. J. Aurora kinase B modulates chromosome alignment in mouse oocytes. Mol Reprod Dev. 76 (11), 1094-1105 (2009).
  18. Lane, S. I., Yun, Y., Jones, K. T. Timing of anaphase-promoting complex activation in mouse oocytes is predicted by microtubule-kinetochore attachment but not by bivalent alignment or tension. Development. 139 (11), 1947-1955 (2012).
  19. Nguyen, A. L., et al. Phosphorylation of threonine 3 on histone H3 by haspin kinase is required for meiosis I in mouse oocytes. J Cell Sci. 127 (Pt 23), 5066-5078 (2014).
  20. Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: studies using selective phosphodiesterase inhibitors. Dev Biol. 178 (2), 393-402 (1996).
  21. Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin, Eg5. Eg5. J Cell Biol. 150 (5), 975-988 (2000).
  22. Jones, K. T., Lane, S. I. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
  23. Fellmeth, J. E., et al. Expression and characterization of three Aurora kinase C splice variants found in human oocytes. Mol Hum Reprod. 21 (8), 633-644 (2015).
  24. Rieder, C. L. The structure of the cold-stable kinetochore fiber in metaphase PtK1 cells. Chromosoma. 84 (1), 145-158 (1981).
  25. Brunet, S., et al. Kinetochore fibers are not involved in the formation of the first meiotic spindle in mouse oocytes, but control the exit from the first meiotic M phase. J Cell Biol. 146 (1), 1-12 (1999).
  26. Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).
  27. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).

Play Video

Cite This Article
Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, Jr., R. T., Schindler, K. Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I. J. Vis. Exp. (134), e57442, doi:10.3791/57442 (2018).

View Video