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Immunology and Infection

विधानसभा और प्रोटोटाइप फोम वायरस Intasomes का शुद्धिकरण

Published: March 19, 2018 doi: 10.3791/57453
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cancer Biology and Genetics, The Ohio State University College of Medicine

Summary

रिकॉमबिनेंट retroviral integrase और डीएनए oligomers नकल उतार वायरल डीएनए समाप्त होता है एक enzymatically सक्रिय एक intasome के रूप में जाना जाता जटिल फार्म कर सकते हैं । Intasomes जैव रासायनिक, संरचनात्मक, और काइनेटिक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल का ब्यौरा कैसे इकट्ठा करने के लिए और प्रोटोटाइप फोम वायरस intasomes शुद्ध ।

Abstract

एक परिभाषित सुविधा और retrovirus जीवन चक्र के आवश्यक कदम मेजबान जीनोम में वायरल जीनोम के एकीकरण है । सभी retroviruses सांकेतिक शब्दों में बदलना एक integrase (में) एंजाइम कि वायरल की मेजबानी डीएनए, जो कतरा स्थानांतरण के रूप में जाना जाता है आबंध में शामिल होने catalyzes । एकीकरण में रिकॉमबिनेंट retroviral और डीएनए oligomers वायरल जीनोम के सिरों नकल उतार के साथ इन विट्रो में मॉडलिंग की जा सकती है । आदेश में और अधिक निकटता दोहराऊंगा एकीकरण प्रतिक्रिया है कि vivo मेंहोता है के लिए, एकीकरण परिसरों में रिकॉमबिनेंट से इकट्ठा कर रहे है और सिंथेटिक oligomers में डायलिसिस द्वारा एक कम नमक एकाग्रता बफर । एकीकरण परिसर, एक intasome कहा जाता है, आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध किया जा सकता है । प्रोटोटाइप फोम वायरस (PFV) के मामले में, intasome में और दो डीएनए oligomers के एक tetramer है और आसानी से monomeric में और मुक्त oligomer डीएनए से अलग है । PFV intasomes के एकीकरण दक्षता बेहतर गतिशीलता और retroviral एकीकरण के यांत्रिकी को समझने के लिए प्रयोगात्मक शर्तों की एक किस्म के तहत परख की जा सकती है ।

Introduction

मेजबान जीनोम में वायरल जीनोम के एकीकरण सभी retroviruses1के जीवन चक्र में एक अनिवार्य कदम है । वायरल एंजाइम integrase (में) catalyzes की मेजबानी डीएनए को वायरल डीएनए जीनोम के प्रत्येक छोर के आबंध में शामिल होने । एक सेलुलर संक्रमण के दौरान, में एक पूर्व एकीकरण जटिल है कि मध्यस्थता एकीकरण का हिस्सा है. रिकॉमबिनेंट में डबल फंसे डीएनए oligomers नकल उतार वायरल डीएनए समाप्त होता है के साथ जटिल भी इन विट्रो2में एक लक्ष्य डीएनए में एकीकरण प्रदर्शन कर सकते हैं । इन विट्रो में एक आम एकीकरण परख लक्ष्य डीएनए के रूप में एक supercoiled प्लाज्मिड का इस्तेमाल करता है । दोनों वायरल डीएनए oligomers के एकीकरण (vDNA) एक रैखिक उत्पाद में प्लाज्मिड परिणामों के लिए और संगठित एकीकरण (चित्रा 2a) का कार्यकाल है । इन विट्रो में एकीकरण परख भी केवल एक vDNA covalently लक्ष्य प्लाज्मिड में शामिल हो गए एक आराम चक्र में जिसके परिणामस्वरूप के साथ उत्पादों उपज सकता है । इस आधे साइट एकीकरण उत्पाद के लिए इन विट्रो मेंपरख की एक मूर्ति प्रतीत होता है ।

रिकॉमबिनेंट और vDNA इन विट्रो मेंएकीकरण कर सकते हैं, लेकिन जब monomeric प्रासंगिक दृश्य में अस्पष्ट होता है, तो वे एकीकरण परिसरों की गतिशीलता या संरचना के अध्ययन के लिए आदर्श रिएजेंट नहीं होते हैं । शुद्ध एकीकरण परिसरों, या "intasomes," गतिशील एकल अणु विश्लेषण या संरचनात्मक अध्ययन के लिए आवश्यक हैं । PFV और vDNAs में एक अपेक्षाकृत उच्च नमक एकाग्रता बफर से डायलिसिस द्वारा इकट्ठा किया जा सकता है एक कम नमक एकाग्रता3,4। डायलिसिस के दौरान, एक हाला रूपों । इस हाला को डायलिसिस से निकाला जाता है और नमक की एकाग्रता बढ़ाई जाती है । उच्च लवण एकाग्रता solubilizes PFV intasomes युक्त हाला । intasomes तो आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) द्वारा शुद्ध कर रहे हैं । रिकॉमबिनेंट प्रोटोटाइप फोम वायरस (PFV) में है को सांद्रता पर समाधान में एक मोनोमर के रूप में मौजूद 225 µ m5को दिखाया गया है । एसईसी आंशिक प्रभावी रूप से अलग PFV intasomes (२२५.५ केडीए), जिसमें PFV के एक tetramer और दो vDNAs में, monomeric PFV से (४४.४ केडीए) और मुक्त vDNA (२४.० केडीए) शामिल हैं । PFV intasomes जमे हुए हो सकता है और भंडारण के ंयूनतम छह महीने के लिए एकीकरण गतिविधि बनाए रखने में-80 ˚ सी ।

रिकॉमबिनेंट PFV intasomes भी अमीनो एसिड प्रतिस्थापन या जनचेतना उत्परिवर्तनों या fluorophores या बायोटिन4,6के साथ लेबल vDNAs में शामिल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है । शुद्ध PFV intasomes आसानी से इन विट्रो मेंएक supercoiled प्लाज्मिड लक्ष्य डीएनए में एकीकरण प्रदर्शन करते हैं । intasomes के साथ थोक जैव रासायनिक एकीकरण परख उत्परिवर्तनों में, अवरोधकों, या अंय रासायनिक additives में के प्रभाव का परीक्षण कर सकते हैं । Biotinylated intasomes न्यूक्लिक एसिड या प्रोटीन के साथ संबंध जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । PFV intasomes चुंबकीय चिमटी द्वारा एकल अणु माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए दो vDNA समाप्त होता है या कुल आंतरिक प्रतिबिंब के शामिल होने के बीच समय को मापने के लिए अनुमति परिवेश के तापमान पर कार्यात्मक है प्रतिदीप्ति लक्ष्य पर खोज intasome कल्पना करने के लिए DNA6. इसके अलावा, PFV intasomes पहले से संरचनात्मक रूप से काफी retroviral एकीकरण3के क्षेत्र को प्रभावित विशेषता हो रहे थे ।

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Protocol

1. एनीलिंग of vDNA

  1. 1x दस बफर का मिश्रण (10x दस स्टॉक: 100 mM Tris-HCl, पीएच 8.0, 1 एम NaCl, 10 एमएम EDTA), 10 µ एम Oligo 1 (5 ' ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG 3 ', 100 µ मी स्टॉक), और 10 µ एम Oligo 2 (5 ' CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAATTCCATGACA 3 ', 100 µ मीटर स्टॉक) में 1.5 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा . Aliquot 25 µ एल में ६० 0.2-एमएल पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) ट्यूबों ।
    नोट: आवेदन पर निर्भर करता है, oligomers fluorophores या टैग के साथ संशोधित किया जा सकता है 5 '-अंत में Oligo 2 या के रूप में एक आंतरिक एमिनो-टी पर आधार 13 से 5 '-Oligo 1 के अंत । संशोधित oligomers एनीलिंग से पहले उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) द्वारा शुद्ध किया जाना चाहिए । हमने पाया है कि 5 '-end Cy3 या Oligo 2 के Cy5 fluorophore लेबलिंग intasome असेंबली क्षमता 10-गुना कम कर देता है । आंतरिक fluorophore लेबलिंग असेंबली दक्षता को कम नहीं करता है ।
  2. ऐनी निंनलिखित समय और तापमान के साथ एक thermocycler का उपयोग कर: 1 चक्र में ९४.० ˚ सी 3 मिनट, 99 चक्र पर (९४.० ˚ सी 1 मिनट, ९३.६ ˚ सी 1 मिनट) प्रति चक्र 0.8 ˚ c द्वारा दोनों तापमान कम (पिछले चक्र १४.८ ˚ c 1 मिनट, 14.4 ˚ c 1 मिनट है) , और 4.0 ˚ सी पर स्टोर
  3. सभी ६० ट्यूबों से एनीलिंग प्रतिक्रियाओं का मिश्रण । लोड 500 µ एल टू 0.5-एमएल 3 केडीए आणविक वेट कटऑफ (MWCO) ultracentrifugal फिल्टर एकाग्रता यूनिट्स. annealed vDNA को एक microcentrifuge में 14,000 x g पर 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान (RT) पर ध्यान दें ।
    नोट: retentate मात्रा प्रत्येक एकाग्रता इकाई में ~ 50 µ एल होना चाहिए ।
  4. के माध्यम से प्रवाह त्यागें । प्रत् येक फ़िल् टर इकाई में शेष annealed vDNA के 250 µ l को जोड़ें । स्पिन दोहराएं और प्रवाह के माध्यम से त्यागें । बफर एक्सचेंज में ते बफर (10 एमएम Tris-एचसीएल, पीएच 8.0, 1 एमएम EDTA) के साथ तीन बार धुलाई करके 450 µ l ते.
  5. फ़िल्टर इकाई पलटना और RT पर 2 मिनट के लिए 1,000 x g पर स्पिन प्रत्येक फिल्टर इकाई के लिए अंतिम retentate मात्रा ~ 50 µ एल एक 1.5 मिलीलीटर पेंच कैप ट्यूब के लिए retentates और हस्तांतरण का मिश्रण होना चाहिए ।
  6. vDNA के 260-एनएम पराबैंगनी (यूवी) अवशोषक उपाय । अंतिम दाढ़ डीएनए एकाग्रता की गणना करने के लिए इस मान का उपयोग करें । इस vDNA का विलुप्त गुणांक (ε260) ६२२,८०३ सेमी-1 एम-1 है और इसका आणविक भार २३,९७२ डा. स्टोर पर-20 ˚ सी.

2. Intasome विधानसभा

  1. यदि संभव हो, एक चर थर्मोस्टेट के साथ एक छोटे से कमरे में intasome विधानसभा प्रदर्शन करते हैं । लगभग 18-22 ˚ सी थर्मोस्टेट को समायोजित करें
    नोट: हमारे अनुभव में, 4 ˚ सी पर intasome विधानसभा अक्षम है ।
  2. डायलिसिस बफर के 1 एल तैयार (20 मिमी बीआईएस-tris प्रोपेन, पीएच 7.5, 200 मिमी NaCl, 2 मिमी dithiothreitol (डीटीटी), 25 µ एम ZnCl2) एक हलचल थाली पर एक हलचल पट्टी के साथ एक 2 एल चोंच में । Equilibrate में बफर 18-22 ˚ ग रूम के लिए कम से 6 ज.
  3. intasomes को असेंबल करने के लिए 50 एमएम बीआईएस-tris प्रोपेन, पीएच 7.5, 500 एमएम NaCl, 120 µ मीटर PFV में, और 50 µ मीटर vDNA की कुल मात्रा में 150 µ एल का मिश्रण है ।
    नोट: में PFV nuclease गतिविधि7,8दूषित से मुक्त होना चाहिए । यदि में PFV की एकाग्रता भी कमजोर है 120 µ एम में समायोजित करने के लिए 150 µ l मात्रा में, तो यह संभव है करने के लिए अंतिम मात्रा में वृद्धि करने के लिए 200 µ l इस कदम के महत्वपूर्ण कारकों में दाढ़ अनुपात को बनाए रखने के लिए कर रहे है vDNA करने के लिए (2.4:1) और क्रोमैटोग्राफी के दौरान कल्पना करने के लिए पर्याप्त जटिल है ।
  4. क्लीन a ~ 10-cm 10-mm 6-8 का लंबा टुकड़ा केडीए MWCO डायलिसिस टयूबिंग और क्लिप के साथ डबल आसुत जल (ddH2O), या उपलब्ध उच्चतम शुद्धता पानी । ट्यूबिंग के एक छोर क्लिप ।
    नोट: डायलिसिस टयूबिंग देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए प्रयोगशाला अंतरिक्ष से किसी भी संभव संक्रमण को रोकने के लिए ।
  5. डायलिसिस टयूबिंग कुल्ला बफर (50 मिमी बीआईएस-tris प्रोपेन, पीएच 7.5, 500 मिमी NaCl) के 15 मिलीलीटर बनाओ । डायलिसिस टयूबिंग के अंदर कुल्ला 1-2 मिलीलीटर कुल्ला बफर के साथ तीन बार । एक पिपेट और पतली जेल लोड टिप के साथ संभव के रूप में कुल्ला बफर के रूप में ज्यादा निकालें ।
  6. यदि आवश्यक हो, एक साफ उस्तरा ब्लेड या स्केलपेल का उपयोग करने के लिए डायलिसिस टयूबिंग कटौती इतना है कि एक पतली जेल लोड हो रहा है टिप टयूबिंग के अंत तक पहुंच सकता है ।
  7. एक पिपेट और एक पतली जेल लोड टिप के साथ डायलिसिस टयूबिंग के लिए कदम 2.3 से intasome विधानसभा स्थानांतरण । डायलिसिस टयूबिंग के खुले अंत क्लिप, हवा की राशि टयूबिंग के भीतर शुरू की ंयूनतम । डायलिसिस बफर में टयूबिंग प्लेस ।
  8. Dialyze रात भर (16-20 ज) कोमल सरगर्मी के साथ इतना है कि टयूबिंग घूमता है लेकिन एक भंवर में नहीं है । यह सुनिश्चित करें कि डायलिसिस टयूबिंग जलमग्न और मोबाइल है । लगभग एक घंटे के बाद, एक दृश्य टयूबिंग के अंदर वेग से निरीक्षण ।
    नोट: Cy3 या Cy5 फ्लोरोसेंट लेबल vDNA के साथ, हाला और अधिक स्पष्ट है । यह दोनों अंत लेबल और आंतरिक फ्लोरोसेंट vDNA लेबल के लिए सच है ।

3. Intasome Solubilization

  1. एक साफ सतह पर एक नया उस्तरा या स्केलपेल ब्लेड के साथ एक 200 µ एल टिप के अंत से 2-4 मिमी निकालकर दो विस्तृत बोर पिपेट युक्तियाँ तैयार करें.
    नोट: युक्तियां 3.3 और 3.5 कदम में इस्तेमाल किया जाएगा ।
  2. डायलिसिस बफर से डायलिसिस टयूबिंग निकालें । आदेश में डायलिसिस बफर कि क्लिप के पास टयूबिंग के अंत में रह सकता है के साथ intasome नमूना के कमजोर पड़ने को रोकने के लिए, एक छोटे से पिपेट टिप के साथ एक micropipette का उपयोग करने के लिए किसी भी अतिरिक्त डायलिसिस बफर हटा दें । डायलिसिस टयूबिंग के एक छोर से क्लिप निकालें ।
  3. एक चौड़े बोर पिपेट टिप से कदम 3.1 का उपयोग करने के लिए डायलिसिस टयूबिंग के अंदर एक 1.5-मिलीलीटर ट्यूब बर्फ पर वेग सहित नमूना हस्तांतरण । बरामद सामग्री की कुल मात्रा पर ध्यान दें; कुल मात्रा आम तौर पर ~ 140 µ एल है ।
  4. नमूना के साथ हाला 200 mM NaCl पर है; एक शेयर 5 एम NaCl समाधान की उचित मात्रा को जोड़ने के द्वारा 320 mM NaCl के अंतिम एकाग्रता के लिए नमक बढ़ाएं । उदाहरण के लिए, 150 µ एल के एक नमूने के लिए, एक 4 ddH सी ठंडे कमरे में नमूना के साथ 155 µ एल हस्तांतरण बर्फ बाल्टी के एक अंतिम मात्रा के लिए 3.9 µ एल 5 एम NaCl और 1.1 µ l ˚2O जोड़ें ।
  5. चरण 3.1 से एक विस्तृत बोर पिपेट टिप का प्रयोग करें reसस्पैंड और solubilize pipetting द्वारा हाला । दोहराएं हर 20 मिनट के लिए ंयूनतम 1 h. निरीक्षण है कि हाला के अधिकांश समाधान में जाना चाहिए ।
    नोट: Pipetting को पुनर्स्थगित करने के लिए जब यह स्पष्ट है कि हाला अब समय बिंदुओं के बीच कम नहीं है ध्यान दिया जाता है रोका जा सकता है । जब vDNA लेबल नहीं है या आंतरिक रूप से लेबल किया गया है, वेग ~ 90% द्वारा दृश्य निरीक्षण के आधार पर कम है । Cy5 अंत के मामले में vDNA लेबल, हाला केवल ~ 20% से कम है; fluorophore अंत के साथ हाला की अधिकांश लेबल vDNA solubilize नहीं होगा । प्रभावी रूप से solubilized है कि हाला की मात्रा चर है और empirically निर्धारित किया जाना चाहिए ।

4. Intasome शुद्धिकरण

  1. आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) चल बफर (20 मिमी बीआईएस-tris प्रोपेन, पीएच 7.5, 320 मिमी NaCl, 10% ग्लिसरॉल) के 250 मिलीलीटर तैयार करें । एक 0.2-µm फ़िल्टर इकाई और 4 ˚ सी पर स्टोर के साथ बफर फ़िल्टर
    नोट: सभी शुद्धिकरण कदम एक 4 ˚ सी ठंडे कमरे में प्रदर्शन कर रहे हैं ।
  2. Equilibrate एक क्रॉस-लिंक्ड agarose सेकंड स्तंभ (व्यास = 10 मिमी; लंबाई 300 मिमी; बिस्तर मात्रा = 24 मिलीलीटर; नमूना मात्रा = 25-500 µ l; अधिकतम दबाव = 1.5 MPa; बहिष्करण सीमा = 4 x10 7 दा; आणविक भार को 5 और 5,000 के बीच अलग करता है केडीए , चटाई की टेबल देखें erials) 0.4 मिलीलीटर की एक प्रवाह दर पर सेकंड चल बफर के साथ/
    नोट: यदि वे प्रभावी रूप से 44 केडीए, जैसे Superose 12 10/300 GL या Superose 6 वृद्धि से 300 केडीए अलग करने में सक्षम हैं यह शुद्धिकरण अलग आकार बहिष्करण स्तंभों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । Superose 12 10/300 GL कम रिज़ॉल्यूशन है, चोटियों के अधिक ओवरलैप करने के लिए अग्रणी है । इसके विपरीत, Superose 6 वृद्धि उच्च संकल्प है और बेहतर जुदाई प्रदान करता है ।
  3. intasome नमूना एक microfuge में 14,000 एक्स जी पर 10 मिनट के लिए 4 ˚ सी में किसी भी शेष हाला गोली करने के लिए । supernatant को सावधानीपूर्वक निकालें । एक 200 µ एल इंजेक्शन पाश (टयूबिंग कि ~ 200 μL पकड़ कर सकते हैं) करने के लिए supernatant लोड । नमूना सेकंड स्तंभ के लिए लागू होते हैं ।
    नोट: छोटे लोड खंड सेकंड से अधिक रिज़ॉल्यूशन की अनुमति दें ।
  4. Elute के साथ 25 मिलीलीटर सेकंड चल बफर और 270 µ एल निरीक्षण के 95 भागों को इकट्ठा कि सेकंड वर्णलेख प्रदर्शित करता है तीन एक280/260 चोटियों (चित्रा 1) ।
    नोट: पहले एक समग्र होना चाहिए (~ 9.0-11.5 एमएल रेफरेंस), इसके बाद PFV tetramer intasome पीक (~ १२.०-१४.७५ एमएल रेफरेंस) और PFV मोनोमर में फ्री vDNA पीक (~ १५.०-१८.० एमएल) के साथ ।

5. एकीकरण किनारा स्थानांतरण परख, अंश चयन, और भंडारण

  1. प्रत्येक intasome पीक अंश के 2 µ l का मिश्रण और 50 एनजी 3 केबी supercoiled प्लाज्मिड डीएनए (शेयर एकाग्रता है 50 एनजी/µ एल) प्रतिक्रिया बफर में (10 मिमी बीआईएस-tris प्रोपेन, पीएच 7.5, 110 एमएम NaCl, 5 एमएम MgSO4, 4 µ एम ZnCl2, 10 एमएम डीटीटी) 15 µ की एक अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा में एल. 5 मिनट के लिए 37 ˚ सी पर मशीन ।
  2. कोई जोड़ा PFV intasome के साथ एक नकारात्मक नियंत्रण शामिल हैं । 0.75 µ एल proteinase कश्मीर (20 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक समाधान) और 0.75 µ l एसडीएस (10% शेयर समाधान) के साथ प्रतिक्रिया बंद करो । पर मशीन 55 ˚ c के लिए 1 h. Store नमूनों के रूप में की जरूरत-20 ˚ c बाद में विश्लेषण के लिए ।
    नोट: यह परख एकीकरण गतिविधि का एक गुणात्मक मूल्यांकन है । प्रत्येक अंश की intasome दाढ़ एकाग्रता इस परख से पूर्व निर्धारित नहीं है. एकीकरण किनारा हस्तांतरण परख में शामिल भागों बर्फ पर संग्रहीत किया जा सकता है (रात भर भंडारण सहित) जब तक एकीकरण गतिविधि की पुष्टि की है और चयनित अंशों aliquoted हैं । यहां हम pMP2, एक pUC19 व्युत्पंन9का उपयोग करें । हम भी सफलतापूर्वक 5.4 kb प्लाज्मिड pcDNA 3.1 का उपयोग किया है । किसी भी प्लाज्मिड है कि आराम चक्र, रैखिक, और supercoiled रूपों के लिए हल किया जा सकता है एकीकरण के लिए एक लक्ष्य के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  3. खंड (डब्ल्यू/वी) agarose जेल 1x ताे बफर (40 मिमी Tris-एसीटेट, 1 मिमी EDTA) के साथ 0.1 μg/एमएल ethidium ब्रोमाइड (EtBr, 10 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक समाधान)10के अनुसार एक 120 मिलीलीटर 1% वजन तैयार करें । agarose समाधान पिघला और यह एक 15 सेमी x 10 सेमी जेल कास्टिंग ट्रे में डालना । 5 मिमी चौड़ा, 0.75 मिमी मोटे कुओं के साथ एक 15-अच्छी तरह से कंघी डालें ।
    नोट: संकरा कुओं 1.5 मिमी मोटी कुओं की तुलना में बेहतर बैंड संकल्प उपज ।
  4. परिवेश के तापमान पर जमना के लिए जेल की अनुमति दें । 1x ताे में जेल को विसर्जित करे 0.1 μg/एमएल EtBr के साथ ।
  5. चरण 5.2 से प्रत्येक एकीकरण प्रतिक्रिया करने के लिए 3 µ l 50% ग्लिसरॉल जोड़ें । पूरी प्रतिक्रिया वॉल्यूम को जेल में लोड करें । 10 केबी डीएनए आकार मार्कर के 1 µ l लोड (150 एनजी/µ एल स्टॉक एकाग्रता) नमूनों के दोनों ओर गलियों को; दूसरे शब्दों में, डीएनए आकार मार्कर नमूना गलियों पार्श्व चाहिए ।
  6. एक बाहरी लेन में लोड 6 µ एल ऑरेंज जी डाई (0.25% नारंगी जी, 30% ग्लिसरॉल) । 1 घंटे के लिए परिवेश के तापमान पर लगातार वोल्टेज, 10 वी/सेमी (100 वी) पर जेल भागो, या नारंगी जी डाई सामने जेल के अंत तक पहुंचता है जब तक ।
  7. तुरंत एक फ्लोरोसेंट स्कैनर EtBr का पता लगाने के लिए सेट के साथ agarose जेल छवि (532 एनएम उत्तेजना, 610 एनएम उत्सर्जन फ़िल्टर) । यदि fluorophore लेबल vDNAs इस्तेमाल किया गया, भी उचित fluorophore सेटिंग्स के साथ छवि ।
    नोट: उदाहरण के लिए, डीएनए लेबल Cy5 का पता लगाने के लिए, 633 एनएम उत्तेजना और 670 एनएम उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग छवि । संगठित एकीकरण उत्पादों (CI, रैखिक डीएनए) ~ 3 केबी पर आकार करने के लिए सच चलाना चाहिए, unsupercoiled प्लाज्मिड (अनुसूचित जाति) तेजी से चलाने चाहिए (~ 2 केबी), और आधे साइट एकीकरण उत्पादों (HSI, आराम सर्कल डीएनए) धीमी गति से चलाने चाहिए (~ 3.5 kb) । unvDNA के लिए सही आकार ~ 40 बीपी पर चलने चाहिए ।
  8. इमेजिंग सॉफ्टवेयर7के साथ प्रत्येक लेन में बैंड यों तो । प्रत्येक लेन कि CI, HSI, या अनुसूचित जाति में डीएनए के अंश की गणना; vDNA इस परिकलन में शामिल नहीं है ।
    नोट: एकीकरण दक्षता, या एक रैखिक उत्पाद में परिवर्तित अनुसूचित जाति के अंश, तीन बैंड (HSI + ci + SC) की कुल पिक्सेल मात्रा द्वारा संगीत के एकीकरण उत्पादों (ci) की पिक्सेल मात्रा विभाजित करके गणना की गई थी. यदि intasomes fluorophore लेबल हैं, तो HSI और CI उत्पादों को भी प्रतिदीप्ति द्वारा quantitated किया जा सकता है ।
  9. उन अंशों का चयन करें जिनमें सबसे अधिक संसंगठित एकीकरण गतिविधि है ।
    नोट: हमारे अनुभव में, शिखर ठोस एकीकरण गतिविधि tetrameric PFV intasomes के रूप में की पहचान की प्रोटीन चोटी के साथ मेल खाता है । इन अंशों में से प्रत्येक का280 को मापने और अंतिम intasome एकाग्रता की गणना करें । यहां वर्णित दो vDNAs के साथ में वाइल्ड टाइप PFV के एक tetramer के लिए ε280 ९०८,३३९ सेमी-1एम-1 है और आणविक भार २२५.५ केडीए के पास है । सांद्रता सेकंड वर्णलेख पीक के रूप में और किनारा हस्तांतरण परख में एक ही पैटर्न का पालन करना चाहिए ।
  10. प्रत्येक अंश को 5 µ l aliquots और स्नैप फ्रीज में लिक्विड नाइट्रोजन में वितरित करें । स्टोर aliquots-80 ˚ सी. भंडारण के लिए चयनित भागों में आम तौर पर 200-600 एनएम के बीच कर रहे हैं ।

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Representative Results

PFV intasomes में रिकॉमबिनेंट और vDNA से इकट्ठे होते हैं. विधानसभा के बाद, intasomes सेकंड (चित्रा 1) द्वारा शुद्ध कर रहे हैं । प्रत्येक अंश के एकीकरण गतिविधि एक supercoiled डीएनए लक्ष्य और agarose जेल ट्रो (चित्रा 2) के साथ परख की है । इस जेल EtBr (और fluorophore, अगर fluorophore-लेबल vDNA प्रयोग किया जाता है) का पता लगाने के लिए सेट एक फ्लोरोसेंट स्कैनर के साथ imaged है । छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके, बैंड पिक्सेल वॉल्यूम का उपयोग एकीकरण कुशलता (आरेख 3) की गणना करने के लिए किया जा सकता है । उच्चतम एकीकरण दक्षता के साथ अंशों स्नैप जमे हुए बाद में उपयोग के लिए कर रहे हैं । जमे हुए भागों एकीकरण गतिविधि बनाए रखने (चित्रा 4), इकट्ठे intasomes के दीर्घकालिक भंडारण के लिए अनुमति देता है । किसी भी लेबल अणु और vDNA के भीतर अपनी स्थिति intasome विधानसभा दक्षता (चित्रा 5) को प्रभावित कर सकते हैं ।

Figure 1
आरेख 1: आकार बहिष्करण वर्णलेख. एक PFV intasome असेंबली एक agarose सेकंड कॉलम के साथ अलग किया गया था । इस कॉलम में कुल (1), PFV intasome के एक tetramer से मिलकर और दो vDNA (2), और monomeric PFV में और vDNA (3) के विभाजन के लिए अनुमति देता है । इस उदाहरण के एक आंतरिक Cy5 fluorophore लेबल 650 एनएम उत्तेजना द्वारा पता चला के साथ vDNA शामिल थे । y-अक्ष मिल्ली-अवशोषक इकाइयों (मऊ) में ऑप्टिकल घनत्व (आयुध डिपो) का अर्थ है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: एसईसी अंशों के एकीकरण परख । (A) एकीकरण किनारा हस्तांतरण प्रतिक्रिया की योजनाबद्ध । बाएं, एक PFV intasome के कार्टून में एक tetramer सहित (नीले घेरे) और दो vDNA (मोटी काली लाइनें), और एक लक्ष्य प्लाज्मिड (पतली काली लाइनें) । लक्ष्य प्लाज्मिड के supercoils (SC) तैयार नहीं हैं । केंद्र, एक आधा साइट एकीकरण (HSI) उत्पाद के कार्टून जब एक vDNA covalently लक्ष्य प्लाज्मिड में शामिल किया गया है । शामिल होने की प्रतिक्रिया एक निक परिचय और supercoils आराम । ठीक है, एक ठोस एकीकरण (CI) उत्पाद के कार्टून जहां दो vDNAs लक्ष्य डीएनए में शामिल किया गया है । इस एकीकरण उत्पाद के सिरों पर vDNAs के साथ एक रैखिक डीएनए में परिणाम है । (ख) Supercoiled प्लाज्मिड डीएनए #49-55 प्रत्येक सेकंड अंश में जोड़ा गया था । निंनलिखित मशीन, एकीकरण प्रतिक्रियाओं deproteinated थे और 1% agarose जेल ट्रो युक्त EtBr द्वारा अलग । नकारात्मक नियंत्रण कोई प्रोटीन (टी) के साथ प्लाज्मिड डीएनए था । डीएनए आकार मार्करों kb में दिखाए जाते हैं । Supercoiled प्लाज्मिड (SC), संगठित एकीकरण उत्पादों (CI), आधा साइट एकीकरण उत्पादों (HSI), और vDNA संकेत कर रहे हैं । (ग) Cy5 की उपस्थिति के लिए agarose जेल का स्कैन किया गया । केवल vDNA, CI और HSI उत्पाद दिखाई देते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: एकीकरण परख के Quantitation । चित्रा 2 से agarose जेल स्कैन किया गया था और दोनों (एक) EtBr और (बी) Cy5 की उपस्थिति के लिए quantified । (A) EtBr परिकलन, HSI, CI और SC बैंड पिक्सेल वॉल्यूंस के लिए जेल विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके प्राप्त किए गए । एकीकरण दक्षता सभी तीन बैंड (HSI + ci + SC) की कुल पिक्सेल मात्रा द्वारा संगीत के एकीकरण उत्पादों (ci) के पिक्सेल मात्रा विभाजित करके गणना की गई थी । उदाहरण के लिए, भिन्न #49 के बैंड के लिए EtBr चैनल में पिक्सेल मान हैं: ११०५६५.२ SC, २५१५२.५६ CI और ६३१३.०४ HSI. #49 अंश के लिए कुल डीएनए पिक्सेल मान इन मानों, १४२०३०.८ का योग है । एकीकरण दक्षता २५१५२.५६ के CI पिक्सेल मात्रा कुल डीएनए मूल्य १४२०३०.८ 0.18 के बराबर द्वारा विभाजित है । (ख) Cy5 CI बैंड पिक्सेल मात्रा मनमाना इकाइयों के रूप में ग्राफी कर रहे हैं । पीक एकीकरण गतिविधि के साथ भिंन व्यक्तिगत रूप से aliquoted और जमे हुए हैं । इस उदाहरण में, अंशों #50-53 चयनित किए गए थे । Aliquots तरल नाइट्रोजन के साथ जमे हुए स्नैप कर रहे है और भविष्य के उपयोग के लिए 80 ˚ सी पर संग्रहीत ।

Figure 4
चित्रा 4: intasome गतिविधि पर ठंड का प्रभाव. एक सेकंड के अंश का आधा तरल नाइट्रोजन के साथ जमी फ़्लैश था, पर संग्रहित-1 घंटे के लिए 80 ˚ सी, और फिर धीरे बर्फ पर गल । सेकंड अंश के शेष आधा एक ठंडे कमरे में बर्फ पर रखा गया था, जबकि पहले आधे जमे हुए और गल गया था । Intasomes बिना गतिविधि के लिए परीक्षण किया गया (-) और के साथ (+) फ्रीज/ एकीकरण दक्षता ऊपर वर्णित के रूप में मापा गया था । (क) एकीकरण प्रतिक्रिया उत्पादों के EtBr दाग agarose जेल । Supercoiled प्लाज्मिड (SC), संगठित एकीकरण उत्पादों (CI), आधे साइट एकीकरण उत्पादों (HSI), और प्रतिक्रिया vDNA संकेत दिया जाता है । डीएनए आकार मार्करों kb में दिखाए जाते हैं । (B) EtBr छवि से एकीकरण कुशलता का Quantitation । परिकलन आरेख 3 लेजेंड में वर्णित हैं । वहां एकीकरण गतिविधि के बाद ठंड और गल का कोई नुकसान नहीं है । औसत एकीकरण दक्षता 2 intasome तैयारी के साथ 5 स्वतंत्र प्रयोगों के लिए दिखाया गया है । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का संकेत देती हैं । युग्मित t-परीक्षण विश्लेषण एक दो-पुच्छ P = ०.०११, कि फ्रीज़/गल थोड़ा संवर्धित एकीकरण गतिविधि हो सकता है का सुझाव दे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: लेबल अणु और स्थिति प्रभावों intasome विधानसभा । PFV intasome विधानसभाओं vDNAs (लाल), Cy5 के साथ Oligo 2 पर लेबल (नीला), आंतरिक Oligo के साथ 1 Cy5 पर लेबल (काला), या अंत (नारंगी) बायोटिन के साथ 2 Oligo पर लेबल अंत थे शामिल थे । सभी असेंबली एक agarose सेकंड स्तंभ के साथ अलग किया गया था । मऊ में y-अक्ष अर्थ ओडी । Chromatograms प्रत्येक intasome प्रकार के कम से 2 स्वतंत्र विधानसभाओं के प्रतिनिधि हैं । अंत लेबलिंग Cy5 10 गुना और बायोटिन 1.8 गुना के साथ PFV intasomes की उपज कम कर देता है । अंत Cy5 और बायोटिन विधानसभाओं उच्च नमक resolubilization (कदम 3.5), आकार अपवर्जन कॉलम पर सामग्री की स्पष्ट नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप के बाद अधिक तेज़ी से शेष है । Cy5 fluorophore के साथ vDNA के आंतरिक लेबल unलेबल्ड vDNA के रूप में intasomes की एक समान उपज की ओर जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

Retroviral INs वायरल जीनोमिक डीएनए के साथ एक multimeric परिसर के रूप में एकीकरण प्रदर्शन और वायरल जीवन चक्र जारी है । मोनोमर प्रति intasome में की संख्या tetramers, octamers, या संभवत: उच्च क्रम multimers11,12,13,14हो सकती है । PFV intasomes में रिकॉमबिनेंट की एक tetramer हैं जिसमें डबल-कतरा डीएनए oligomers है जो वायरल जीनोमिक डीएनए को नकल करते3है। इन intasomes का उपयोग संरचनात्मक एवं गतिशील अध्ययन3,5,13,14में किया गया है ।

PFV intasomes के विधानसभा डायलिसिस के दौरान एक अपेक्षाकृत उच्च नमक एकाग्रता बफर से एक कम नमक एकाग्रता के लिए होता है । यह एक हाला जो PFV intasomes शामिल है के गठन में परिणाम है । intasomes नमक एकाग्रता बढ़ाने से solubilized हैं । PFV में 225 µ m5तक सांद्रता पर monomeric होना दिखाया गया है । परिसरों में तो monomeric से अलग कर रहे है और सेकंड से मुक्त vDNA । हमने PFV intasomes के शुद्धिकरण को सेकंड बफर6में ग्लिसरॉल शामिल करने के लिए संशोधित किया है । ग्लिसरॉल के अलावा PFV intasomes गतिविधि की हानि के बिना भविष्य के उपयोग के लिए जम सकता है (चित्रा 4) की अनुमति देता है ।

इस प्रोटोकॉल की कई प्रमुख विशेषताएं हैं । हालांकि प्रोटीन शुद्धि अक्सर कम तापमान पर प्रदर्शन किया है, हम empirically पाया है कि PFV intasome विधानसभा में अक्षम है 4 ˚ सी । इसके बजाय, विधानसभा डायलिसिस 18-22 ˚ सी की सीमा में होने चाहिए । यह भी है कि दूषित बैक्टीरियल nuclease7,8से मुक्त है में रिकॉमबिनेंट PFV का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है । अंत में, vDNA के अनुपात में विधानसभा का एक महत्वपूर्ण कारक है । यदि प्रोटीन एकाग्रता में शुरू से कम है यहां की सिफारिश की, vDNA एकाग्रता आनुपातिक कम होना चाहिए । हालांकि यह कम सांद्रता पर PFV intasomes इकट्ठा करने के लिए संभव है, परिसरों सेकंड जुदाई के दौरान पता लगाने के लिए एक उच्च पर्याप्त एकाग्रता पर होना चाहिए ।

इस विधि का उपयोग PFV intasomes के लिए अनलेबल्ड या लेबल किए गए vDNA के लिए किया जा सकता है । हमने पाया है कि vDNA कुशलतापूर्वक एक fluorophore या6बायोटिन के साथ लेबल किया जा सकता है । अन्य छोटे अणु लेबल भी संभव हो सकते हैं. Cy5 fluorophore के मामले में, हम पाते है कि अंत vDNA लेबल चोटी एकाग्रता के साथ इकट्ठे intasomes की उपज कम कर देता है 10 गुना कम । हालांकि, आंतरिक रूप से Cy5 लेबल्ड vDNA के पास unvDNAd के बराबर उपज है । इस विधानसभा विधि भी बिंदु उत्परिवर्तनों या PFV के जनचेतना उत्परिवर्तनों के साथ4में इस्तेमाल किया जा सकता है । के बाद से PFV में चिकित्सीय रूप से प्रासंगिक कतरा स्थानांतरण अवरोधक (INSTI) एचआईवी को लक्षित दवाओं में से बाधित है, यह इन PFV intasomes का उपयोग करने के लिए INSTIs के तंत्र का अध्ययन करने के लिए संभव है3. इसके अलावा, कुछ INSTI में एचआईवी के प्रतिरोधी उत्परिवर्तनों-1 में PFV में अवशेषों के संरक्षण में होते हैं, इंजीनियर PFV intasomes के साथ दवा प्रतिरोध के अध्ययन की अनुमति ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम NIH AI099854 और AI126742 कुंजी को समर्थन किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DNA Oligomers IDT N/A Custom DNA Oligos
Tris Ultra Pure Gojira Fine Chemicals UTS1003
NaCl P212121 RP-S23020
UltraPure EDTA Invitrogen/Gibco 15575
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters Sigma-Aldrich Z677094-24EA 3 kDa MWCO
DTT P212121 SV-DTT
BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) Sigma-Aldrich B6755-500G
ZnCl2 Sigma-Aldrich 208086
MgSO4 Amresco 0662
Glycerol Thermo Fisher Scientific G37-20
Gel-loading tips, 1 - 200 μL Corning CLS4853-400EA
Razor blade; Single-edged; 100/Pk.; Pack of 100 Fisher Scientific 12-640
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL Thermo Fisher Scientific 568-0020
Dialysis tubing clips Spectrum Labs 132734
6-8 kDa 10 mm Dialysis Tubing Spectrum Medical 132645
Superose 6 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences 17517201
Hi-Res Standard Agarose AGTC Bioproducts AG500D1
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific BP1302
Orange G Fisher Scientific 0-267
Hyladder 10kb, 500 lanes Denville Scientific CB4225-4

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 133 Retrovirus प्रोटोटाइप फोम वायरस Intasome Integrase प्रोटीन कॉंप्लेक्स विधानसभा प्रोटीन जटिल शुद्धि
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Mackler, R. M., Lopez Jr., M. A., Yoder, K. E. Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes. J. Vis. Exp. (133), e57453, doi:10.3791/57453 (2018).

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