Asamblea y purificación del prototipo Virus espumoso de los Intasomes

Resumen

Integrasa de retrovirus recombinante y oligómeros de ADN mímico extremos de DNA virales pueden formar un complejo enzimático activo conocido como un intasome. Intasomes puede ser usada para estudios bioquímicos, estructurales y cinéticos. Este protocolo detalla cómo montar y purificar el prototipo virus espumoso de los intasomes.

Resumen

A definición de función y paso necesario del ciclo de vida de retrovirus es la integración del genoma viral en el genoma del anfitrión. Los retrovirus codifican enzima integrasa (IN) que cataliza la unión covalente de viral a anfitrión DNA, que se conoce como transferencia de cadena. Integración puede ser modelada en vitro con IN retrovirus recombinante y oligómeros de ADN mímico los extremos del genoma viral. Con el fin de recapitular más de cerca la reacción de integración que se presenta en vivo, integración complejos son ensamblados de oligómeros sintéticos y recombinante IN por diálisis en un tampón de menor concentración de sal. La integración compleja, llamada un intasome, puede ser purificada por cromatografía por exclusión de tamaño. En el caso de virus espumoso de los prototipos (PFV), el intasome es un tetrámero de IN y oligómeros de ADN dos y se separa fácilmente en monomérica y oligómero gratuito ADN. La eficacia de la integración de intasomes PFV puede ensayarse bajo una variedad de condiciones experimentales para comprender mejor la dinámica y la mecánica de integración retroviral.

Introducción

Integración del genoma viral en el genoma del anfitrión es un paso obligatorio en el ciclo de vida de todos los retrovirus¹. La enzima viral integrasa (IN) cataliza la unión covalente de los extremos del genoma viral de la DNA al anfitrión DNA. Durante una infección celular, en forma parte de un complejo de pre-integración que media integración. Recombinante en complexed con oligómeros de ADN de doble trenzados mímico los extremos del ADN virales también puede realizar la integración en un ADN en vitrode objetivo². Un común integración análisis en vitro utiliza un plásmido superenrollado como el ADN dia....

Protocolo

1. recocido de vDNA

1. Combinar 1 X Buffer 10 (10 X 10 stock: 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 M NaCl, 10 mM EDTA), 10 μm 1 Oligo (5' ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG 3', 100 acciones μm) y 10 μm 2 Oligo (5' CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAATTCCATGACA 3', 100 acciones μm) en un volumen final de 1.5 mL . Alícuota de 25 μL en tubos de reacción en cadena (PCR) de 0.2 mL polimerasa sesenta.
   Nota: Dependiendo de la aplicación, oligómeros pueden modificarse con fluoróforos o etiquetas en el extremo 5'-2 Oligo o como un interno amino-T 13 base desde el extremo 5' de Oligo 1. Oligómeros modificados deben ser purificados por cromatografía líquida de alto rendimiento (HP....

Resultados

Intasomes PFV son ensamblados de IN recombinante y vDNA. Después del montaje, intasomes son purificadas por segundos (figura 1). Actividad de integración de cada fracción se ensayaron con un superenrollado ADN blanco y agarosa electroforesis en gel (figura 2). Este gel es reflejado con un analizador fluorescente para detectar EtBr (y fluoróforo, si se utiliza el fluoróforo vDNA). Usando software de análisis de imagen, volúmenes d.......

Discusión

Retroviral INs forman un complejo con DNA genómica viral para realizar integración y continuar el ciclo de vida viral multimérica. El número de monómeros por intasome puede ser tetrámeros, octamers o posiblemente mayor orden Multímeros^11,12,13,14. Intasomes PFV son un tetrámero de recombinante con oligómeros de ADN bicatenario que imitan la DNA genomic viral termina³.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Oligómeros de ADN	IDT N	/A	Oligos de ADN personalizados
Tris Ultra Pure	Gojira Fine Chemicals	UTS1003
NaCl		P212121 RP-S23020
UltraPure EDTA	Invitrogen/Gibco	15575
Amicon Ultra 0.5 mL filtros centrífugos	Sigma-Aldrich	Z677094-24EA	3 kDa MWCO
TDT	P212121	propano SV-DTT
BIS-TRIS, >=99,0% (valoración)	Sigma-Aldrich	B6755-500G
ZnCl2	Sigma-Aldrich	208086
MgSO4	Amresco	0662
Glycerol	Thermo Fisher Scientific	G37-20
Puntas de carga de gel, 1 - 200 μ L	Corning	CLS4853-400EA
Hoja de afeitar; De un solo filo; 100/paquete; Paquete de 100 unidades de	estériles Fisher Scientific	12-640
con membrana PES > 250 ml	Thermo Fisher Scientific	568-0020
Pinzas para tubos de diálisis	Spectrum Labs	132734
6-8 kDa 10 mm Tubo de diálisis	Spectrum Medical	132645
Superose 6 10/300 GL	GE Healthcare Ciencias de la Vida 17517201
Estándar de alta resolución Agarosa	AGTC Bioproducts	AG500D1
Bromuro de etidio	Thermo Fisher Scientific	BP1302
Naranja G	Fisher Scientific 0-267
Hyladder 10kb, 500 carriles	Denville Scientific	CB4225-4

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