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Genetics

C. एलिगेंस में जीनोमिक पॉइंट म्यूटेंट पैदा करने के लिए एक रैपिड और सतही पाइपलाइन का उपयोग CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Published: April 30, 2018 doi: 10.3791/57518
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Pharmacology, University of Michigan
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ, हम CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins और समरूपता निर्भर मरम्मत टेम्पलेट्स का उपयोग कर C. एलिगेंस के जीनोम को इंजीनियर करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं.

Abstract

संकुल नियमित रूप से interspersed palindromic दोहराता (CRISPR)-CRISPR-जुड़े प्रोटीन 9 (Cas9) prokaryotic अनुकूली प्रतिरक्षा सुरक्षा प्रणाली को सह गया है सटीक eukaryotic जीनोम इंजीनियरिंग के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में चुना । यहां, हम एक तेजी से और सरल विधि chimeric एकल गाइड RNAs (sgRNA) और CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) में जीनोमिक बिंदु उत्परिवर्तनों के कुशल और सटीक पीढ़ी के लिए का उपयोग कर वर्तमान में सी. एलिगेंस। हम sgRNA लक्ष्य चयन, समरूपता-निर्देशित मरंमत (HDR) टेंपलेट डिजाइन, CRISPR-Cas9-RNP और वितरण, और एक genotyping रणनीति है कि सही ढंग से संपादित पशुओं के मजबूत और तेजी से पहचान को सक्षम बनाता है के लिए एक पाइपलाइन का वर्णन । हमारे दृष्टिकोण न केवल सतही पीढ़ी और वांछित जीनोमिक बिंदु उत्परिवर्ती पशुओं की पहचान परमिट, लेकिन यह भी उच्च दक्षता और एक कम स्क्रीनिंग कार्यभार के साथ लगभग 4-5 दिनों में अंय जटिल indel alleles का पता लगाने की सुविधा ।

Introduction

हाल ही में तकनीकी प्रगति मौलिक बदल दिया है और ठीक इंजीनियर जीनोम करने की क्षमता में तेजी लाने के । विशेष रूप से, CRISPR-Cas9 प्रणाली है, जो आरएनए-निर्देशित endonuclease Cas9 पर निर्भर करता है एक डबल किनारा तोड़ (ब्याज के लक्ष्य अनुक्रम के पास DSB) प्रेरित करने के लिए, बड़े पैमाने पर सही ढंग से इस्तेमाल किया मॉडल जीवों के बहुमत के जीनोम इंजीनियर करने के लिए इस्तेमाल किया गया है बायोमेडिकल रिसर्च1,2,3,4. गौरतलब है कि CRISPR-Cas9 के इस्तेमाल से सी. एलिगेंस5जैसी मुश्किल प्रजातियों में भी जीनोम का संपादन खुला है. प्रजातियों की परवाह किए बिना, CRISPR-Cas9 आधारित जीनोम संपादन प्रणाली के साथ बिंदु उत्परिवर्तन पैदा तीन कोर घटकों पर निर्भर करता है: 1) Cas9 endonuclease, 2) एक एकल गाइड आरएनए (sgRNA) है कि एक लक्ष्य अनुक्रम को Cas9 endonuclease निर्देशन, और 3) एक उपयोगकर्ता डिजाइन समरूपता-निर्देशित मरंमत (HDR) टेंपलेट जिसमें ब्याज2का वांछित संपादन शामिल है ।

ऐसी कई विधियाँ हैं जिनका उपयोग प्लाज्मिड, आरएनए, और वायरल-आधारित डिलीवरी पद्धतियों6सहित कक्षों में लक्ष्यीकरण sgRNA और Cas9 nuclease को लागू करने के लिए किया जा सकता है. हाल ही में, पूर्व के प्रत्यक्ष वितरण परिसर में sgRNA-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) CRISPR-Cas9 आधारित जीनोम संपादन में एक शक्तिशाली और कुशल उपकरण के रूप में उभरा है7। पूर्व परिसर CRISPR-Cas9 RNPs के प्रत्यक्ष प्रसव के कई विशिष्ट लाभ है, अर्थात्: 1) RNPs बाईपास सेलुलर प्रतिलेखन और अनुवाद के लिए की जरूरत है, 2) RNPs तेजी से साफ कर रहे हैं, जो उपलब्ध समय को कम करने के लिए विशिष्टता बढ़ सकता है बंद लक्ष्य दरार, और 3) RNPs यादृच्छिक एकीकरण के माध्यम से मेजबान जीनोम में गैर देशी दृश्यों की शुरूआत को दरकिनार जो कोई विदेशी डीएनए/ एक साथ, इन विशेषताओं की संभावना एक अल्पकालिक-लक्ष्य CRISPR संपादन के फट रहते हैं, जबकि बंद लक्ष्य प्रभाव कम प्रदान करते हैं ।

हम C. एलिगेंसमें साइट-विशिष्ट जीनोमिक परिवर्तनों को प्रस्तुत करने के लिए एक सरल और कुशल प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं । इस प्रोटोकॉल sgRNA और एकल असहाय oligonucleotide (ssODN) HDR टेंपलेट डिजाइन, sgRNA-Cas9 RNP जटिल और वितरण, और ठीक से संपादित पशुओं की स्पष्ट पहचान के लिए एक genotyping रणनीति लक्ष्यीकरण भी शामिल है । इस रणनीति का प्रयोग, न केवल वांछित साइट विशिष्ट परिवर्तन बरामद किया जा सकता है, लेकिन अंय गैर विशिष्ट indel उत्परिवर्तनों भी बरामद किया जा सकता है । इस प्रकार, हमारी रणनीति एक allelic श्रृंखला के एक एकल रणनीति है, जहां दोनों मोनो allelic, द्वि-allelic, और indel म्यूटेंट एफ में उत्पंन किया जा सकता है का उपयोग कर के उत्पादन की अनुमति1 जनरेशन ।

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Protocol

सभी पशु देखभाल और प्रायोगिक प्रक्रियाओं के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों और संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) मिशिगन विश्वविद्यालय में से दिशानिर्देश का पालन किया । प्रोटोकॉल में RNase-मुक्त समाधानों और पिपेट युक्तियों का उपयोग करें । सफाई कार्य क्षेत्र, पिपेट, ट्यूबों, और निर्माता के दिशा निर्देशों के बाद RNase दूषण समाधान के साथ केंद्रापसारक ( सामग्री तालिकादेखें) ।

1. sgRNA लक्ष्य चयन

  1. किसी वेब ब्राउज़र का उपयोग कर, वेबपेज खोलें: http://crispor.tefor.net8
    1. इनपुट ~ ६० आधार जोड़े (बीपी) अनुक्रम की रुचि के वांछित संपादित करने के पार्श्व (यानी 30 bp 5 ' और 3 ' के वांछित संपादित करें) ।
    2. pulldown मेनू से Caenorhabditis एलिगेंस जीनोम का चयन करें ।
    3. HF1 मेन्यू से Protospacer सटी आकृति (20 बीपी-NGG-SpCas9, SpCas9-eSPCas9, pulldown १.१) का चयन करें ।
    4. सबमिट करेंक्लिक करें । परिणाम पृष्ठ में, रुचि के संपादन के निकटतम लक्ष्य अनुक्रम को शीर्ष स्थान का चयन करें. यदि पार्श्व ६० bp इनपुट अनुक्रम के भीतर कोई उपयुक्त लक्ष्य साइटें नहीं हैं, तो १०० bp (यानी ५० bp वांछित संपादित करें के दोनों ओर) के लिए क्वेरी अनुक्रम का विस्तार करें ।
  2. एक उपलब्ध स्रोत से, उदा synthego, निंन विनिर्देशों के साथ एक 20-मेर लक्ष्य sgRNA प्राप्त करें: 3 nmol; कोई संशोधन नहीं ।
  3. रसीद पर, केंद्रापसारक lyophilized sgRNA ट्यूब युक्त > 12, 000 एक्स जी कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए । जोड़ें ६० µ एल के nuclease-नि: शुल्क ते ट्यूब, और धीरे से पुनः निलंबित pipetting द्वारा ऊपर और नीचे 15-20 बार एक P200 पिपेट का उपयोग कर । अंतिम एकाग्रता ५० µ मीटर है ।

2. समरूपता-निर्देशित मरंमत टेम्पलेट डिजाइन

  1. डिजाइन एक ssODN HDR युक्त टेम्पलेट: 1) ब्याज के उत्परिवर्तन, 2) एक अद्वितीय में फ्रेम प्रतिबंध endonuclease साइट, 3) NGG पाम अनुक्रम के भीतर एक या दोनों जी एस के एक मूक उत्परिवर्तन, और 4) ५० bp 5 ' और 3 ' समरूपता हथियार पहले और पिछले उत्परिवर्तन के पार्श्व । (चित्रा 1C) 9 , 10.
    1. यदि NGG पाम अनुक्रम के उत्परिवर्तन संभव नहीं है, sgRNA लक्ष्य मांयता अनुक्रम के भीतर 5-6 मूक उत्परिवर्तनों परिचय ssODN HDR टेंपलेट के sgRNA मध्यस्थता दरार को रोकने के लिए ।
  2. किसी उपलब्ध स्रोत से, उदा idtdna, निंन पैरामीटर्स के साथ एक "Ultramer डीएनए oligonucleotide" प्राप्त करें: स्केल: 4 nmol; निर्माण: कोई नहीं; शुद्धि: मानक लवण ।
  3. रसीद पर, केंद्रापसारक lyophilized ssODN ट्यूब युक्त > 12, 000 एक्स जी कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए । धीरे nuclease में १०० µ मीटर के एक अंतिम एकाग्रता के लिए ssODN को फिर से निलंबित-नि: शुल्क ddH2O ऊपर और नीचे 15-20 बार एक pipetting P200 का उपयोग करके पिपेट ।

3. डिजाइन Genotyping प्राइमर

  1. डिजाइन एक प्राइमर जीनोम संशोधन पार्श्व सेट पैदा करने के लिए एक ~ ४००-७०० बीपी पीसीआर amplicon11।
  2. एक एकल और विशिष्ट amplicon11का निर्माण करने के लिए पीसीआर साइकलिंग शर्तों का अनुकूलन ।

4. इंजेक्शन मिश्रण तैयार

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए अधिकतम गति से मेज 1 एजेंट केंद्रापसारक ।
  2. सूचीबद्ध क्रम में, nuclease-मुक्त पीसीआर ट्यूब करने के लिए तालिका 1 एजेंट जोड़ें ।
  3. एक P20 पिपेट के साथ धीरे से ऊपर और नीचे 10 बार pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण ।
  4. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मशीन इंजेक्शन मिश्रण ।

5. इंजेक्शन प्रोटोकॉल

  1. इंजेक्शन के लगभग एक आधे के साथ लोड इंजेक्शन micropipette12मिश्रण मामले में इंजेक्शन सुई रोकना या टूटता है शेष इंजेक्शन मिश्रण सहेजें ।
  2. तोड़ micropipette टिप इतना है कि ~ 20-30 p.s.i. एक क्रमिकसमाधान12 बह पैदा करता है ।
    नोट: बड़ा व्यास युक्तियां नकारात्मक पशु स्वास्थ्य को प्रभावित और च1 संतान उपज घटाएं ।
  3. दोनों जननांगों बाहों में 10-15 युवा वयस्क कीड़े इंजेक्षन यदि संभव होतो12 । यदि नहीं, एक जननांगों बांह में इंजेक्शन पर्याप्त है ।
  4. इंजेक्शन जानवरों की अनुमति दें (पी0) एक OP50 पर कमरे के तापमान पर 1-2 घंटे के लिए ठीक करने के लिए ३५ mm निमेटोड ग्रोथ मीडिया (NGM) प्लेट. इसके बाद, एकल इंजेक्शन पी0 पशु व्यक्तिगत OP50 के लिए-३५ mm NGM प्लेटें एक प्लैटिनम तार कीड़ा का उपयोग कर12बीज उठाओ ।

6. स्क्रीन P0 प्लेट्स और सिंगल mCherry (+) F1s

  1. दो दिनों के बाद इंजेक्शन, पी0 प्लेटों की पहचान F1 संतति युक्त ग्रसनी में mCherry व्यक्त एक फ्लोरोसेंट stereomicroscope (चित्रा 1 डी, दिन 2-3) का उपयोग कर । तीन पी0 प्लेटें जिनमें सबसे mCherry (+) F1 पशु चुनें ।
  2. तीन चयनित पी0 प्लेटों में से प्रत्येक से, एक 8-12 mCherry (+)एफ 1 जानवरों की कुल के लिए 24-36 mCherry (+)एफ1 एक कीड़ा उठाओ(चित्रा1 डी, दिन 2-3) का उपयोग कर एस ।
    नोट: mCherry (-) जानवरों को भी इन पी0 प्लेटों से एकल किया जा सकता है, लेकिन सही ढंग से संपादित जानवरों की पहचान की संभावना बहुत कम है (चित्रा 2a).
  3. अनुमति व्यक्तिगत एफ1स्वयं के लिए s-निषेचन और 1-2 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर अंडे देना ।

7. सिंगल वर्म पीसीआर और Genotyping

  1. अंडा बिछाने के 1-2 दिनों के बाद, एक कीड़ा उठाओ(तालिका 2 , चित्रा1 डी, दिन 4-5) का उपयोग करते हुए 7 µ एल कृमि Lysis बफर युक्त व्यक्तिगत पीसीआर पट्टी ट्यूब टोपियांमें एफ 1 स्थानांतरण ।
  2. के लिए अधिकतम गति पर पीसीआर ट्यूबों कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए ट्यूब नीचे जानवरों लाने के लिए, और फ्रीज ट्यूबों-८० ° c के लिए 1 एच ।
    नोट: कीड़े-८० डिग्री सेल्सियस अनिश्चित काल तक संग्रहित किया जा सकता है ।
  3. लाइसे एक thermocycler में जमे हुए कीड़े निंनलिखित प्रोग्राम का उपयोग: ६० ° c के लिए ६० मिनट, ९५ ° c 15 मिनट के लिए, 4 ° c पकड़ो ।
  4. सेट अप पीसीआर mastermix के रूप में तालिका 3में दिखाया गया है ।
  5. पीसीआर mastermix की 21 µ l को साफ पीसीआर ट्यूबों में जोड़ें, और फिर स्टेप 3 से वर्मी lysis के 4 µ l को जोड़ें । एक पिपेट का उपयोग अच्छी तरह से मिश्रण और निर्माताओं के दिशा निर्देशों के बाद पीसीआर कार्यक्रम चलाने ( सामग्री तालिकादेखें).
  6. एक डीएनए स्वच्छ और ध्यान किट का उपयोग कर पीसीआर प्रतिक्रियाओं को शुद्ध, निर्माता निर्देशों का पालन ( सामग्री तालिकादेखें) । Elute डीएनए को 10 µ l पानी से जोड़कर स्पिन कॉलम में यूज करें ।
  7. सेट-अप प्रतिबंध एंजाइम mastermix तालिका 4में दिखाए गए के रूप में ।
  8. प्रतिबंध एंजाइम mastermix के 10 µ एल जोड़ें प्रत्येक साफ पीसीआर प्रतिक्रिया और 1-2 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियसपर13 के लिए मशीन ।
  9. एक १.५% agarose जेल पर अलग पचा पीसीआर उत्पादों १२० V का उपयोग 1x Tris-एसीटेट-EDTA (ताे) बफर14पर चला ।

8. संपादित पशुओं की पहचान और अनुक्रम सत्यापन

  1. संभावित संपादित जानवरों से संकेत मिलता है कि बैंड की उपस्थिति के लिए एंजाइम डाइजेस्ट नमूनों की जांच14 (चित्रा 1 डी, दिन 4-5).
    नोट: लोड एक N2 नियंत्रण संभावित indel उत्परिवर्तनों जो बैंड आकार और/या अप्रत्याशित और जटिल प्रतिबंध एंजाइम पाचन बैंडिंग पैटर्न में बदलाव के रूप में मनाया जा सकता है की पहचान करने के लिए ।
  2. संभावित संपादित पशुओं की पहचान करने के बाद, वर्म lysis के बचे हुए 3 µ l का उपयोग करें और पीसीआर रिएक्शन दोहराएं । सफाई या प्रतिबंध नहीं एंजाइम डाइजेस्ट कार्यक्रम पूरा होने के बाद पीसीआर प्रतिक्रिया । एक 1% agarose जेल पर पीसीआर प्रतिक्रिया लोड, अलग और एक जेल निष्कर्षण किट15 का उपयोग कर बैंड निकालने ( सामग्री तालिकादेखें) ।
  3. सैंज अनुक्रम16 जेल निकाले गए डीएनए F1 प्राइमर का उपयोग सही ढंग से संपादित जानवरों की पहचान करने के लिए (चित्र 1a)
    नोट: Heterozygote पढ़ता जंगली प्रकार और इंजीनियर एलील की उपस्थिति के कारण मढ़ा चोटियों शामिल होंगे.
  4. सत्यापित heterozygous संपादित पशुओं, एकल 8-12F 2 जानवरों से homozygous पशुओं को प्राप्त करने और 7-8 कदम प्रदर्शन करते हैं ।

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Representative Results

मानव सुपरऑक्साइड dismutase 1 में उत्परिवर्तनों (SOD1) के लिए खाते ~ पारिवारिक पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस के 10-20%, एक विनाशकारी neurodegenerative रोग है कि हमेशा पक्षाघात और मौत की ओर जाताहै17 । मानव वतन-1 एक evolutionarily संरक्षित प्रोटीन ५५% की पहचान और C. एलिगेंस वतन के साथ ७०% समानता-1 प्रोटीन (आंकड़ा 1b) साझा है । सादगी, व्यवहार्यता, और CRISPR-Cas9 RNP आधारित दृष्टिकोण की क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए, हम C. एलिगेंस वतन-1 जीन का निशाना कृमि जीनोम (चित्रा 1a) में रोग से जुड़े मानव G93A संस्करण परिचय ।

सी. एलिगेंस जीनोम में G93A उत्परिवर्तन इंजीनियर, एक sgRNA जिसका पाम मांयता साइट 3 G93 codon (चित्रा 1C) के बीपी नदी के ऊपर बैठता चुना गया था । हम एक ssODN HDR मरंमत टेम्पलेट युक्त बनाया: 1) न्यूक्लियोटाइड परिवर्तन करने के लिए G93 codon परिवर्तित करने के लिए A93 (GGA जीसीए), 2) NGG पाम अनुक्रम (CGG सीएजी) के लिए एक मूक परिवर्तन sgRNA HDR टेंपलेट के Cas9-मध्यस्थता दरार को रोकने के लिए, 3) एक मूक उत्परिवर्तन (सीटी) है कि genotyping के लिए एक अद्वितीय HindIII प्रतिबंध एंजाइम साइट का परिचय, और 4) ५० बीपी 5 ' और 3 ' समरूपता शस्त्र (चित्रा 1C) । एक पीसीआर प्राइमर सेट (F1-R1) N2 नियंत्रण (चित्र 1a) में एक एकल ५९२ बीपी पीसीआर उत्पाद का उत्पादन करने के लिए डिज़ाइन किया गया था । एक इंजेक्शन sgRNA, Cas9, ssODN और एक फ्लोरोसेंट मार्कर प्लाज्मिड (pCFJ90) युक्त मिश्रण एक साथ मिलाया गया, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मशीन, और एक microinjection पिपेट में भरी हुई ।

चित्रा 1 डी इंजेक्शन मिश्रण एक इंजेक्शन micropipette में लोड होने के बाद कार्यप्रवाह को दर्शाया गया है । 0 दिन पर, 10-15पी 0 पशु एक या दोनों gonad मानक microinjectionतकनीक18, 19 का उपयोग कर हथियारों में इंजेक्शन थे । इंजेक्शन पशु 1-2 एच के लिए बरामद किया और फिर व्यक्तिगत रूप से OP50-वरीयता प्राप्त NGM प्लेटों पर चढ़ाया गया । 2-3 दिनों के बाद, सफलपी 0 इंजेक्शन mCherry (+)एफ 1 संतति होने उन लोगों द्वारा की पहचान की गई । शीर्ष तीन पी0 प्लेट्स (यानी mCherry (+) एफ1एस की सबसे बड़ी संख्या होने उन) बाद में विश्लेषण के लिए चुना गया । इन तीन प्लेटों में से प्रत्येक से (P0-8, पी0-10, पी0-12), 8 mCherry (+) एफ1एस एकल OP50-वरीयता प्राप्त ३५ mm NGM प्लेट्स की कुल के लिए 24 mCherry (+) एफ1एस । अंडा-बिछाने (दिन 4-5) के 2-3 दिनों के बाद,व्यक्तिगत एफ 1 एस में कीड़ा lysis बफर युक्त पीसीआर ट्यूबों में स्थानांतरित किया गया और 1 ज पर-८० डिग्री सेल्सियस के लिए जमे हुए । बाद में, एफ1एस जीनोमिक डीएनए को मुक्त करने के लिए लीजड ड थे, और पीसीआर के अधीन । पीसीआर उत्पादों तो शुद्ध और 1 एच के लिए HindIII के साथ पचा रहे थे, और एक १.५% agarose जेल पर चलाने के लिए संभावित संपादित पशुओं की पहचान । सही ढंग से संपादित पशुओं में, HindIII पाचन पूरी लंबाई पीसीआर उत्पाद (५९२ बीपी) में कटौती ३७० बीपी और २२२ बीपी के दो बैंड में । इस genotyping रणनीति स्पष्ट रूप से जंगली प्रकार (५९२ बीपी), heterozygote (५९२, ३७०, २२२ बीपी) और homozygote (३७०, २२२ बीपी) जानवरों के बीच अंतर । चित्र 2a 24 mCherry (+) पशुओं के लिए genotyping परिणाम दिखाता है ।

प्रदर्शन करने के लिए कि फ्लोरोसेंट mCherry मार्कर जीनोम संशोधन के लिए समृद्ध है, हम भी तीन P0 प्लेटों में से प्रत्येक से 8 mCherry (-) जानवरों को चुना । के 24 mCherry (+) च1s दिखलाई (लाल पट्टी), 10 निहित मोनो-allelic या द्वि-allelic संशोधन (४२%), 10 जंगली प्रकार थे (४२%), 3 थे संभावित indels (13%), और वहां था 1 पीसीआर विफलता (चित्रा 2a) । इसके विपरीत, के 24 mCherry (-) F1s दिखलाई, केवल 1 पशु सही संशोधित किया गया था (4%); जबकि, 23 जंगली प्रकार थे (९६%) (चित्र 2a) । चित्रा 2 बी पूर्ण लंबाई जेल निकाले पीसीआर उत्पाद (एफ18-6) से वर्णलेख से पता चलता है, प्रदर्शन है कि सटीक न्यूक्लियोटाइड परिवर्तन ssODN HDR टेंपलेट में बनाया गया ईमानदारी से इस homozygous के जीनोम में शामिल किया गया च 1 पशु । विशेष रूप से, एफ1 जानवरों 10-7, 10-8, और 12-3 अप्रत्याशित पीसीआर उत्पाद आकार और प्रतिबंध डाइजेस्ट बैंडिंग पैटर्न का प्रदर्शन किया, इन जानवरों का सुझाव जटिल indel उत्परिवर्तनों (चित्रा 2a) ले सकता है । इस प्रकार, हमारी विधि केवल वांछित जीनोम संशोधन (ओं) आसानी, दक्षता, और निष्ठा के साथ पैदा करने में सक्षम नहीं है, लेकिन यह भी पहचान और अद्वितीय indel alleles कि जीन समारोह में महत्वपूर्ण और अप्रत्याशित अंतर्दृष्टि बहा सकता है की वसूली परमिट ।

Figure 1
चित्र 1 . CRISPR-Cas9 इंजीनियरिंग की सी. एलिगेंसवतन-1 लोकस. (क) योजनाबद्ध चित्रण वतन की एक्सॉन-intron संरचना -१ लोकस सी. एलिगेंसमें चित्रित. लाल पट्टी एक्सॉन 3 में G93 के स्थान का अर्थ है । प्राइमरी जोड़ी सेट लाल तीर (F1-R1) द्वारा नोट किया है । (ख) मानव और C. एलिगेंस (कृमि) वतन-1 प्रोटीन का अनुक्रम संरेखण । लक्षित G93 अवशेषों लाल रंग में प्रकाश डाला है । (ग) शीर्ष, जीनोमिक डीएनए के एक वर्ग G93 codon आसपास के एक संदर्भ के रूप में दिखाया गया है, और पाम (हरा) और sgRNA लक्ष्य (ब्लू) साइटों पर प्रकाश डाला जाता है । नीचे, एकल कतरा oligonucleotide (ssODN) समरूपता निर्देशित मरंमत (HDR) टेंपलेट से युक्त दिखाया गया है: codon G93 को बदलने A93, पाम आकृति को एक मूक परिवर्तन sgRNA द्वारा दरार को रोकने के लिए-Cas9 परिसर, एक मूक बदलने के लिए परिचय एक अद्वितीय HindIII प्रतिबंध एंजाइम साइट (पीला बॉक्स), और 5 ' और 3 ' ५० बीपी समरूपता हथियार (काली सलाखों) के पार्श्व । ssODN में डिज़ाइन किए गए सभी न्यूक्लियोटाइड परिवर्तन लाल हाइलाइट किए गए हैं । (D) CRISPR-Cas9 RNP आधारित बिंदु म्यूटेंट के सृजन और पहचानने के लिए पाइपलाइन का योजनाबद्ध चित्रण । 0 दिन पर, इंजेक्शन मिश्रण के साथ 10-15पी 0 जानवरों सुई । 2-3 दिन पर,सफलतापूर्वक 1 संतान फ्लोरोसेंट युक्त उन लोगों द्वारापी 0 पशुओं इंजेक्शन की पहचान, और सबसे फ्लोरोसेंट संतति के साथ तीनपी 0 प्लेट का चयन करें । तीन पी0 प्लेटों में से प्रत्येक से, एकल 8 फ्लोरोसेंट एफ1 संतान । 4-5 दिवस पर, (एक) चरण 1, व्यक्तिगतएफ1 एस उठाया और Lysis बफर युक्त पीसीआर ट्यूबों में रखा जाता है; (ख) चरण 2, पर-८० डिग्री सेल्सियस ठंड के बाद, पीसीआर ट्यूब युक्त एफ1 कीड़े जीनोमिक डीएनए, जो एक पीसीआर टेम्पलेट के रूप में प्रयोग किया जाता है जारी करने के लिए लीजड ड हैं । पीसीआर उत्पादों तो साफ और अद्वितीय प्रतिबंध एंजाइम के साथ पचा रहे हैं; (ग) चरण 3, एंजाइम डाइजेस्ट उत्पादों एक agarose जेल पर हल कर रहे हैं, जहां जंगली प्रकार (+/+), heterozygous (एम/+), और homozygous (एम/एम) जानवरों के द्वारा पहचाना जा सकता है प्रतिबंध डाइजेस्ट बैंडिंग पैटर्न । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . वतन-1 (G93A) म्यूटेंटके लिए Genotyping डाटा। (क) जेल एफ की छवि 1 पशु है कि व्यक्तिगत रूप से लीजड ड, PCRed और HindIII के साथ पचा रहे थे । प्रत्येक पी के लिए0 प्लेट (पी0-8, पी0-10, पी0-12), 8 mCherry (+) और 8 mCherry (-) एफ1 जानवरों का विश्लेषण किया गया । दोनों मोनो-allelic (नीला नंबर) और द्वि-allelic (लाल नंबर) संपादित जानवरों बरामद किए गए । आकार स्थानांतरित पीसीआर उत्पादों या अप्रत्याशित HindIII डाइजेस्ट बैंड भी बरामद किया गया है कि indel म्यूटेंट (पीले रंग की संख्या) का संकेत कर रहे हैं । N2 नियंत्रण पीसीआर उत्पाद नौकरशाही का आकार घटाने और एंजाइम विशिष्टता के लिए एक संदर्भ के रूप में दिखाया जाता है । (ख) शीर्ष, codon रिक्ति और एमिनो एसिड अनुवाद ऊपर जंगली प्रकार (WT) के लिए और नीचे G93A संशोधित किस्में के लिए दिखाए जाते हैं । इच्छित संपादन एक लाल बॉक्स द्वारा हाइलाइट किया गया है, और एक में-फ़्रेम HindIII प्रतिबंध साइट बनाने वाले मूक परिवर्तन एक पीला बॉक्स द्वारा हाइलाइट किए गए हैं । सभी डिजाइन न्यूक्लियोटाइड बदलाव बोल्ड में दिखाया गया है । नीचे, homozygous एफ1 पशु 8-6 से प्रतिनिधि वर्णलेख । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अभिकर्मक वॉल्यूम अंतिम एकाग्रता
ddH२हे ६.३ μL ----
KCl (4M) ०.९४ μL 300mm
HEPES (0.5 मीटर) पीएच ७.४ ०.५ μL 20 एमएम
pCFJ90 (25 एनजी/μL) १.२५ μL २.५ एनजी/μL
ssODN (५०० एनजी/μL) १.२५ μL ५० एनजी/μL
sgRNA (५० माइक्रोन) १.२५ μL 5 माइक्रोन
Cas9 (६१ माइक्रोन) १.०३ μL 5 माइक्रोन
अंतिम मात्रा १२.५ μL ----

तालिका 1. CRISPR-Cas9 RNP इंजेक्शन मिक्स. nuclease-फ्री ddH में सभी रिएजेंटों को फिर से निलंबित किया जाना चाहिए2O. RNase मुक्त तकनीक जब रिएजेंट हैंडलिंग और इंजेक्शन मिश्रण बनाने जब इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।

अभिकर्मक अंतिम]
KCl 50mm
Tris-एचसीएल नं० ८.३ 10 एमएम
MgCl2 २.५ एमएम
एनपी-४० ०.४५%
के बीच-20 ०.४५%
Proteinase K 1 मिलीग्राम/एमएल

तालिका 2. वर्मी Lysis बफर रेसिपी. Proteinase कश्मीर प्रत्येक उपयोग से पहले ताजा जोड़ा जाना चाहिए ।

अभिकर्मक 1x 24x
2x Q5 Mastermix १२.५ μL ३०० μL
प्राइमर F1 (10 माइक्रोन) १.२५ μL 30 μL
प्राइमर R1 (10 माइक्रोन) १.२५ μL 30 μL
वर्म Lysis 4 μL ----
ddH२हे 6 μL १४४ μL
अंतिम मात्रा 25 μL ५०४ μL

तालिका 3. पीसीआर Mastermix । पीसीआर mastermix pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रित किया जाना चाहिए जब तक कि समाधान सजातीय है । पीसीआर mastermix के 21 µ एल को साफ पीसीआर ट्यूबों में जोड़ा जाना चाहिए, और फिर व्यक्तिगत कीड़ा lysate के 4 µ एल ठीक से लेबल ट्यूबों के लिए जोड़ा जाना चाहिए ।

अभिकर्मक 1x 24x
10x एंजाइम बफर 2 μL ४८ μL
जरुर पीसीआर रिएक्शन 10 μL ----
ddH२हे 7 μL १६८ μL
प्रतिबंध एंजाइम (10 U/μL) 1 μL 24 μL
अंतिम मात्रा 20 μL २४० μL

तालिका 4. प्रतिबन्ध एंजाइम Mastermix. प्रतिबंध एंजाइम mastermix अच्छी तरह से pipetting द्वारा मिश्रित किया जाना चाहिए जब तक समाधान सजातीय है । 10 µ l के प्रतिबंधक एंजाइम mastermix को जरुर पीसीआर प्रोडक् ट के 10 µ l में जोड़ा जाना चाहिए

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Discussion

CRISPR-Cas9 प्रणाली ठीक मॉडल जीवों के जीनोम को संशोधित करने के लिए एक शक्तिशाली और प्रभावी उपकरण है । यहां, हम प्रदर्शित करते है कि chimeric sgRNAs20 ssODN HDR के साथ युग्मित टेम्पलेट्स सी. एलिगेंसमें जीनोमिक बिंदु उत्परिवर्तनों के अत्यधिक कुशल पीढ़ी को सक्षम. महत्वपूर्ण बात, हम प्रदर्शित करते है कि RNP वितरण उच्च संपादन दक्षता का उत्पादन जब प्रतिदीप्ति एक सह चयन मार्कर के रूप में प्रयोग किया जाता है, आसानी और तकनीक की विश्वसनीयता पर प्रकाश डाला ।

सी. एलिगेंस जीनोम इंजीनियरिंग के लिए CRISPR-Cas9 तरीकों के बहुमत विशिष्ट आनुवंशिक पृष्ठभूमि या सह CRISPR रणनीतियों1पर भरोसा करते हैं । सह-CRISPR विधि एक अविश्वसनीय रूप से उपयोगी उपकरण है कि एक सफल जीनोम संपादित प्राप्त करने की संभावना बढ़ जाती है साबित हो गया है । हालांकि, सह CRISPR तरीकों एक मार्कर लोकस कि ब्याज के जीनोम संपादित करने के लिए समृद्ध पर एक phenotype चयन संपादित शुरू करने की आवश्यकता है । जबकि शक्तिशाली, चयन phenotype असर उत्परिवर्तनों शुरू अवांछनीय हो सकता है अगर तनाव को संपादित करने या ब्याज ही phenotypes दर्शाती है कि या गहरा मार्कर phenotype द्वारा दबा हो सकता है की वांछित बिंदु उत्परिवर्तन । इसके अलावा, सह CRISPR रणनीतियां एक मार्कर लोकस पर एक अतिरिक्त दोहरे किनारा तोड़ बनाने जरूरत कि बंद लक्ष्य प्रभाव में योगदान कर सकते हैं । यहाँ, हम एक क्षणिक फ्लोरोसेंट मार्कर का उपयोग करता है कि न केवल सफलतापूर्वक पी0 पशुओं इंजेक्शन की पहचान करने के लिए कार्य करती है, लेकिन यह भी उचित जीनोम संपादन के लिए समृद्ध । हमारा डेटा इस विधि का प्रदर्शन महत्वपूर्ण गैर फ्लोरोसेंट जानवरों की तुलना में सफलतापूर्वक संपादित जानवरों के लिए समृद्ध है, और कई विशिष्ट लाभ प्रदान करता है: 1) केवल एक लक्ष्यीकरण साइट विशिष्ट sgRNA आवश्यक है, 2) Cas9 में एक 5 गुना कमी और sgRNA एकाग्रता, 3) तनाव और phenotype-चयन स्वतंत्रता, और 4) एक नाममात्र स्क्रीनिंग कार्यभार (~ 24 F1s) । इस विधि का उपयोग करके सुदृढ़ CRISPR-Cas9 जीनोम संपादन एफ1 जनरेशन में देखा गया था । विशेष रूप से, पीसीआर-प्रतिबंध एंजाइम आधारित पता लगाने की रणनीति एफ1 पीढ़ी में मोनो और द्वि-allelic संपादित जानवरों का स्पष्ट पता लगाने में सक्षम बनाता है । अंत में, genotyping रणनीति संभावित indel उत्परिवर्तनों की पहचान की सुविधा है, जो पीसीआर बैंड बदलाव के रूप में देखा जा सकता है जब N2 नियंत्रण की तुलना में, कि या तो प्रतिबंध पचाने के लिए अतिसंवेदनशील नहीं है या जटिल बैंड उपज जब पचा ।

अगली पीढ़ी के बड़े पैमाने पर जीनोमिक प्रयासों के साथ मिलकर अनुक्रमण के आगमन जीनोमिक वेरिएंट है कि रोग के साथ अलग21की पहचान में तेजी आई है । हालांकि, pathogenicity के कार्यात्मक परीक्षणों सेलुलर और जीव मॉडल प्रणालियों में वेरिएंट के बहुमत के लिए प्रदर्शन नहीं किया गया है । इस अध्ययन में हमने वतन-१ जीन को सी. एलिगेंस में व्यापक रूप से अध्ययन ALS-एसोसिएटेड वतन-१G93A उत्परिवर्तन पेश करने का लक्ष्य रखा. तारीख करने के लिए, इस उत्परिवर्तन मॉडलिंग की गई है और सी. एलिगेंस और चूहों में मुख्य रूप से ट्रांसजेनिक एक्सप्रेस का उपयोग कर का अध्ययन किया । हालांकि पशु मॉडल में वेरिएंट के व्यक्त दोहराऊंगा प्रमुख सेलुलर, आणविक और रोग के व्यवहार पहलुओं, यह तेजी से स्पष्ट है कि ' खुराक ' phenotypes का निर्धारण करने में एक हालात extenuating कारक है हो सकता है 22 । उदाहरण के लिए, उच्च प्रतिलिपि संख्या वतन-1G93A चूहों के उत्परिवर्ती मानव वतन की ~ 24 प्रतियां-1 जीन प्रदर्शन बहुत त्वरित वतन की तुलना में रोग कोर्स-1G93Adl चूहों, जो केवल ले ~ 8-10प्रतियां23, 24 । यहां, हम प्रदर्शित करते है कि हमारे CRISPR-Cas9 RNP आधारित विधि तेजी से मानव संस्करण उत्पंन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है orthologous कीड़ा जीन में जुड़े उत्परिवर्तनों ट्रांसजेनिक व्यक्त की आवश्यकता के बिना, और अधिक ठीक करने के लिए एक प्रयास में आनुवंशिक प्रतिकृति रोग के संदर्भ । हमारे विधि अंतर्जात विनियामक नियंत्रण और अभिव्यक्ति के संदर्भ में अज्ञात महत्व के जीनोमिक वेरिएंट का उत्पादन और परीक्षण करने के लिए एक व्यवहार्य मंच प्रदान करता है, जो precludes के दायरे में । अंत में, हम भी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (यानी GFP), जो visualizing कैसे वेरिएंट प्रोटीन स्थानीयकरण, एकत्रीकरण, और कारोबार को प्रभावित करने के लिए एक अतिरिक्त उपकरण प्रदान करेगा के साथ अंतर्जात जीन टैग करने के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया है ।

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Disclosures

हम इस पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए बेग प्रयोगशाला के सदस्यों को धंयवाद । उपभेदों Caenorhabditis जेनेटिक्स केंद्र है, जो अनुसंधान अवसंरचना कार्यक्रम (P40 OD010440) के NIH कार्यालय द्वारा वित्त पोषित है द्वारा प्रदान की गई । बेग प्रयोगशाला में अनुसंधान NIH (R01 NS094678) और पेशी Dystrophy एसोसिएशन (MDA382300) से अनुदान द्वारा समर्थित है A.A.B.

Acknowledgments

इस रिपोर्ट से संबंधित रुचि का कोई टकराव नहीं है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CRISPRevolution sgRNA  EZ Kit Synthego Inc. chimeric sgRNA
Nuclease-free TE Synthego Inc. provided with the sgRNA kit EZ kit
Nuclease-free water Synthego Inc. provided with the sgRNA kit EZ kit
4 nmole Ultramer DNA Oligo Integrated DNA Technologies ssODN HDR template
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS Integrated DNA Technologies 1078728 Cas9 protein
pCFJ90  Addgene 19327 Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid
KCl Sigma P5405
HEPES Sigma H4034
DNA Clean & Concentrator Zymo Research D4004
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit Zymo Research D4002
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix New England Biolabs M0494L
Proteinase K Sigma P2308
Glass Borosilicate Glass Micropipettes Sutter Instruments BF100-78-10 OD: 1.0mm. ID: 0.78mm
Trizma Hydrochloride Sigma T5941
MgCl2 Sigma M2393
NP-40 Sigma 74385
Tween-20 Fisher Scientific BP337-100
RNaseZap Decontamination Solution Fisher Scientific AM9780

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References

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जेनेटिक्स इश्यू १३४ CRISPR Cas9 Ribonucleoprotein सी. एलिगेंस जीनोम इंजीनियरिंग वतन-1
<em>C. एलिगेंस</em> में जीनोमिक पॉइंट म्यूटेंट पैदा करने के लिए एक रैपिड और सतही पाइपलाइन का उपयोग CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins
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Prior, H., MacConnachie, L., Martinez, J. L., Nicholl, G. C. B., Beg, A. A. A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins. J. Vis. Exp. (134), e57518, doi:10.3791/57518 (2018).

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