Målet med detta protokoll är att spektrofotometriskt övervaka trans-plasma membran elektrontransport utnyttja extracellulära Elektronacceptorer och analysera enzymatisk samspel som kan uppstå med dessa extracellulära Elektronacceptorer.
Trans-plasma membran elektrontransport (tPMET) spelar en roll i skyddet av celler från intracellulära reduktiv stress samt skydd mot skador av extracellulära oxidanter. Denna process för transport av elektroner från intracellulära reduktionsmedel till extracellulära oxidanter är inte väldefinierade. Här presenterar vi spektrofotometrisk analyser av C2C12 myotubes att övervaka tPMET utnyttja de extracellulära Elektronacceptorer: vattenlösliga tetrazolium salt-1 (WST-1) och 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP eller DCIP). Genom minskning av dessa Elektronacceptorer har vi möjlighet att övervaka denna process i en realtidsanalys. Med tillägg av enzymer såsom askorbinsyra oxidas (AO) och superoxiddismutas (SOD) att analyserna, kan vi avgöra vilken del av tPMET beror askorbat produktion för export eller superoxid, respektive. Medan WST-1 visades att producera stabila resultat med låg bakgrund, kunde DPIP vara åter oxiderat efter tillsats av AO och SOD, vilket visades med spektrofotometrisk analys. Denna metod visar en realtid, flera, snabb spektrofotometrisk analysen med fördelar jämfört med andra metoder som används för att övervaka tPMET, såsom Kaliumferricyanid (FeCN) och ferricytochrome c minskning.
Renat plasma membran förmåga att minska Elektronacceptorer har lett till att plasmamembranet har en inneboende redox kapacitet1. TPMET tidigare sett i svampar, växter och djur, och är en process som är gemensamma för flera organismer2,3,4,5. Specifikt, har denna process visats i Saccharomyces cerevisiae, morot celler, erytrocyter, lymfocyter, osteosarkom, melanom, makrofager, skelettmuskel och neutrofiler2,3, 4 , 5 , 6 , 7. en process som transporterar elektroner över plasmamembranet att minska extracellulära oxidanter, tPMET är involverad i många cellulära funktioner inklusive: cell tillväxt5,8, cell livskraft9, järn ämnesomsättningen10, cell signalering11,12,13och skydd från reaktivt syre arter12,14,15. På grund av Tpmet’s medverkan i många cellulära funktioner, har en obalans i tPMET antagit hypotesen för att bidra till utvecklingen av vissa allvarliga hälsotillstånd, inklusive cancer16, hjärt-kärlsjukdom17, och metaboliska syndrom18.
Det finns flera sätt att övervaka överföring av elektroner över plasmamembranet, men den mest använda tekniken är att bedöma minskningen av extracellulära Elektronacceptorer genom kolorimetrisk analyser. Vanligen används extracellulära Elektronacceptorer är tetrazolium salter, DPIP, FeCN och ferricytochrome c19,20. Det vanligaste tetrazolium saltet är en andra generationens salt känd som WST-119. Denna förening är lättare att utnyttja kolorimetriska analyser jämfört med första generationens tetrazolium salter på grund av två sulfonat grupper, som ökar dess vatten löslighet21. WST-1, reduceras jämförd med den mellanliggande elektron acceptorn 1-metoxi-phenazine metosulfat (mPMS), i två single-elektronöverföring händelser. Denna minskning ändrar svagt färgade oxiderade form av WST-1 till en mer intensiv, gul formazan20,22. WST-1 har en hög molar extinktionskoefficient 37 x 103 M-1cm-1, vilket leder till en hög assay känslighet21,22. DPIP utnyttjas också som en extracellulär Elektronacceptor att övervaka tPMET. Det har visat att DPIP kan minskas extracellularly genom tPMET utan hjälp av mellanliggande elektron acceptorer23,24. På grund av mellanliggande Elektronacceptorer, DPIP direkt kan pickupen elektroner från plasmamembranet, till skillnad från WST-124. Liknar DPIP, FeCN har visat att minskas extracellularly till kaliumferrocyanid genom tPMET utan hjälp av mellanliggande elektron acceptorer19,24. Till skillnad från WST-1 och DPIP har FeCN en låg molar extinktionskoefficient leder till en lägre analysens känslighet9. En annan vanligt förekommande extracellulära Elektronacceptor att övervaka tPMET är ferricytochrome c. liknar WST-1, ferricytochrome c minskning ökar med användning av mellanliggande Elektronacceptor, mPMS22. Till skillnad från WST-1 dock är ferricytochrome c metoden mindre känslig på grund av en hög bakgrund och en låg molar absorption koefficient22.
Här presenterar vi en metod för realtidsanalys av tPMET genom spektrofotometrisk analyser. Metoden utnyttjas de extracellulära Elektronacceptorer WST-1 och DPIP, som de båda har en hög molar extinktionskoefficient medan att vara mindre dyr jämfört med andra ofta används extracellulära Elektronacceptorer såsom ferricytochrome c. Vi utnyttjade phenazine metosulfat (PMS) i stället för mPMS de har en liknande kemisk makeup och PMS är betydligt billigare. mPMS är photochemically stabila vilket ett viktigt kännetecken för en kommersiell kit som behöver en lång hållbarhet. Men gör vi PMS färska för varje analys, så stabilitet inte bör vara ett problem. Vi presenterar också en metod för att utvärdera möjliga enzymatisk interaktioner (se figur 1) mellan extracellulära Elektronacceptor och enzymer som kan utnyttjas för att ytterligare karakterisera processen för tPMET. Specifikt, avgöra de enzymer som AO och SOD kan användas som del av tPMET beror på askorbat transport eller extracellulära superoxid release, två vanliga metoder för elektronerna transporteras över plasmamembranet.
Vi har lagt fram två metoder för att utnyttja extracellulära Elektronacceptorer, WST-1 och DPIP, spektrofotometrisk analyser att övervaka tPMET i C2C12 myotubes. Med tillväxten av cellinjer i standard kultur förfaranden och en spektrofotometer Plattläsare är det möjligt att övervaka tPMET med dessa Elektronacceptorer i en enkel mikroplattan-analys. WST-1 minskning är reproducerbara från väl-att-väl inom ett test, men det finns variation. Dagliga variationskoefficienten (CV) utnyttja PBS som bufferten är 0,…
The authors have nothing to disclose.
Vi skulle vilja tacka Thomas Bell, Lyn Mattathil, Mark Mannino och Neej Patel för deras tekniska support. Detta arbete stöds av United States Public Health Service award R15DK102122 från nationella institutet för Diabetes och mag- och njur sjukdomar (NIDDK) till Jonathan Fisher. Manuskriptet innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella åsikter NIDDK eller National Institutes of Health.
C2C12 myoblasts | American Type Culture Collection | CRL-1772 | |
Dulbecco's modified eagle's medium – low glucose | Sigma | D6046 | |
Fetal Plex animal serum complex | Gemini Bio-Products | 100-602 | |
penicillin-streptomycin | Sigma | 516106 | |
horse serum | Gibco Technologies | 16050-130 | |
Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | |
trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
15 cm culture dishes | TPP | 93150 | |
96 well culture plates | TPP | 92096 | |
2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1) | Accela ChemBio Inc | SY016315 | |
phenazine methosulfate | Sigma | P9625 | |
L-ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
ascorbate oxidase | Sigma | A0157 | |
superoxide dismutase | Sigma | S5395 | |
2,6-dichloroindophenol sodium salt | ICN Biomedicals | 215011825 | |
D-(+)-glucose | Sigma | G7528 | |
HEPES sodium salt | Sigma | H3784 | |
sodium chloride | Sigma | S7653 | |
potassium chloride | Fisher Scientific | BP366 | |
magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M5921 | |
calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | |
potassium phosphate | Fisher Scientific | BP363 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
Powerwave X-I spectrophotometer | Biotek Insturments | discontinued | |
Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 336001 | |
PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile | MidSci | 781602 | |
Iron (II) chloride tetrahydrate | Sigma | 220299 | |
Iron (II) sulfate heptahydrate | Sigma | 215422 | |
hypoxanthine | Sigma | H9636 | |
xanthine oxidase | Sigma | X4500 | |
Excel | Microsoft | ||
R Studio | Rstudio | https://www.rstudio.com/products/rstudio/ | |
KC4 | Biotek Insturments | discontinued |