Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

מעקב ברמת הגנום של שגיאות תיעתוק היצורים האיקריוטים

doi: 10.3791/57731 Published: September 13, 2018

Summary

פרוטוקול זה מספק חוקרים עם כלי חדש כדי לפקח על הנאמנות של שעתוק אורגניזמים דגם מרובים.

Abstract

תמלול מדויק נדרש עבור הביטוי הנאמן של מידע גנטי. באופן מפתיע למרות, מעט מאוד ידוע על המנגנונים השולטים על הנאמנות של שעתוק. כדי למלא את הפער הזה של הידע המדעי, אנחנו לאחרונה ממוטב וזמינותו מעגל-רצף כדי לזהות שגיאות תיעתוק ברחבי transcriptome של האפייה, melanogaster דרוזופילה Caenorhabditis elegans. פרוטוקול זה יספק לחוקרים עם כלי חדש חזק כדי למפות את הנוף של שגיאות תיעתוק התאים האיקריוטים כך מנגנוני בקרה על הנאמנות של שעתוק יכולים להיות הובהר בפירוט חסר תקדים.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הגנום מספק שרטוט ביולוגי מדויק של החיים. כדי ליישם תוכנית זו כראוי, חשוב על הגנום יש לשעתק בדייקנות נהדרת. עם זאת, תמלול סביר להיות נטולת שגיאות. לדוגמה, ה-RNA polymerases יש כבר זמן רב ידוע להיות מועדת לטעויות במבחנה1,2, לאחרונה זה הוצג כי הם מבצעים שגיאות ויוו וכן3,5,6, במיוחד כאשר קיימות עם ה-DNA נזק7,8,9,10. יחדיו, תצפיות אלה מציינים כי שגיאות תיעתוק מתרחשים ללא הרף כל התאים החיים, רומז שאולי הם מקור עשיר של חלבונים מוטציה.

התהליך הזה, הנקרא תעתיק מוטגנזה מכוונת, שונה מוטגנזה מכוונת קלאסית בשתי דרכים. ראשית, בניגוד מוטציות גנטיות, שגיאות תיעתוק להשפיע mitotic והן שלאחר mitotic תאים, כפי שהם אינם תלויים שכפול ה-DNA. לומד את המנגנונים להשפיע על הנאמנות של שעתוק, לכן, יספק תובנות בעלות ערך לתוך עומס מוטציה של תאים mitotic והן שלאחר mitotic. . מעניין, שגיאות תיעתוק לאחרונה היו מעורבים בקידום חלבון צבירת11,12,13 , היה שיערו לתרום שני carcinogenesis10 ו התפתחות עמידות לאנטיביוטיקה חיידקים14.

שנית, בניגוד מוטציות גנטיות, שגיאות תיעתוק אינם ארעי בטבע. קיומם הזמני הוא מאתגר במיוחד כי זה עושה שגיאות תיעתוק קשה מאוד לזהות. לדוגמה, בעוד מספר מעבדות המציאו כתב ערך מבחני לחקר מוטגנזה מכוונת תעתיק, מבחני אלה מסוגלים רק למדוד שגיאות תיעתוק במספר מוגבל של ההקשרים, מודל אורגניזמים4,15. כדי להתגבר על מגבלות אלה, חוקרים רבים פנו טכנולוגיה רצפי RNA (RNA-seq), המאפשר תיאורטית שגיאות תיעתוק שיירשמו ברחבי transcriptome של כל מין. עם זאת, מחקרים אלה הם בקלות מבולבל על ידי ספריית הבנייה חפצים, כגון שגיאות תיעתוק הפוכה, PCR הגברה שגיאות הטבע לשגיאות של רצף עצמה. לדוגמה, הפוך transcriptases התחייב כ שגיאה אחת בכל הבסיסים ~ 20,000, בעוד ה-RNA polymerases (RNAPs) צפויים לעשות שגיאה אחת בלבד בכל הבסיסים 300,0005,6. כי שיעור שגיאה של שעתוק במהופך לבד גמדים שיעור שגיאה של RNA polymerases בתוך תאים, זה כמעט בלתי אפשרי להבחין שגיאות תיעתוק האמיתי לבין חפצים הנגרמת על ידי הכנת ספריה בנתוני ה-RNA-Seq המסורתית ( איור 1a).

כדי לפתור בעיה זו, פיתחנו גירסה אופטימיזציה של המעגל-הרצף (Cirseq, או C-seq מעתה ואילך)5,assay16. Assay זה מאפשר למשתמש לזהות שגיאות תיעתוק והווריאנטים נדירים אחרים ב- RNA ברחבי transcriptome5. מעגלי-רצף וזמינותו שיישא את השם הזה כי צעד המפתח assay הזה סובב סביב ה-RNA circularization. פעם אחת המטרות RNA הם circularized, הם הפוכה עיבד באופן מעגל המתגלגל, לייצר מולקולות cDNA לינאריים המכילות עותקים רבים של אותה תבנית הרנ א. אם שגיאה היה נוכח באחת מתבניות אלה, שגיאה זו גם יהיה נוכח בכל חוזר יחיד בתוך המולקולה cDNA. לעומת זאת, טעויות שנעשות על ידי שעתוק במהופך, PCR הגברה או רצף נוטים להיווצר באקראי, ובכך יהיה נוכח חזרה אחד או שניים בלבד. לפיכך, על ידי יצירת רצף קונצנזוס עבור כל מולקולה cDNA, הבחנה שגיאות אקראי של שגיאות כל חזרה, ספריית הבנייה חפצים יכול ביעילות ניתן להפריד בין שגיאות תיעתוק אמיתי (איור 1b).

אם משתמשים בו כראוי, ניתן להשתמש וזמינותו C-seq במדויק לזהות קצב הבסיס החלפות, הוספות ומחיקות RNA ברחבי transcriptome של כל מין (ראה לדוגמה, טרוורס, Ochman17). לדוגמה, השתמשנו וזמינותו C-seq לספק מדידות ברמת הגנום של שיעור שגיאה של שעתוק האפייה, דרוזופילה melanogasterו Caenorhabditis elegans עם רזולוציה בסיס יחיד5 (לא פורסם תצפיות). במקור נהגו במדויק רצף אוכלוסיות וירוס רנ א, גירסה זו אופטימיזציה של C-seq וזמינותו התייעלה כדי למזער בתנאים קשים במהלך הכנת ספריה לתרום חפצים בניית ספריה. בנוסף, באמצעות מספר ערכות זמינים מסחרית, התפוקה של וזמינותו במידה רבה משופרת, כמו גם ידידותיות למשתמש שלה. אם משתמשים בו כראוי, וזמינותו הזה יכול לזהות במדויק אלפי שגיאות תיעתוק לכל שכפול, ובכך מיעיל באופן משמעותי על מחקרים קודמים6. בסך הכל, בשיטה זו מספק כלי רב עוצמה כדי ללמוד מוטגנזה מכוונת תעתיק, יאפשר למשתמש לקבל הרומן תובנות לגבי המנגנונים השולטים על הנאמנות של שעתוק במגוון רחב של אורגניזמים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. הכנה

  1. RNases נמצאים בכל מקום; לכן, לנקות את סביבת העבודה ביסודיות על ידי התזה למטה עם ריאגנט טיהור (למשל, RNase משם) ו-70% אתנול. תרסיס למטה מכל פיפטות, עטים, או ארונות תקשורת צינור כדי להסיר את מקורות RNase זיהום פוטנציאליים.
  2. כדי למנוע עוד יותר RNases של מזהם את הדגימות, ללבוש חלוק המעבדה או שרוולים ארוכים חולצה של במהלך הניסויים. יש למנוע מגע בין הכפפות הפנימי של כל צינורות אשר ישמש, במיוחד כאשר איחזורם מתיבת או שקית.
  3. לפני שעתוק לאחור, משתנים לעתים קרובות כפפות.
    הערה: לקבלת תוצאות אופטימליות, לא להשהות את הניסוי לפני שעתוק לאחור.

2. תא בעלי חיים ותרבות אוסף

  1. אוסף וצמיחה של האפייה
    1. אם ספריית C-seq רצוי של שמרים, תחילה לחסן מושבה בודדת של cerevisiae ס ב- 3 מ"ל של בינוני המכיל תמצית שמרים, אדנין, peptone ו- dextrose (YAPD), דגירה אותו בן לילה ב 30 מעלות צלזיוס תוף המתגלגל.
    2. בבוקר, לחסן מחדש את התרבות ב- 50 מ של YAPD בינוני צפיפות אופטית (OD) של 0.1 ולגדול התאים עד שיגיעו OD של 0.5-0.7 (~ 7 x 106 תאים/mL).
    3. לאסוף את התרבות כולה 50 מ ל (כ- 350 x 106 תאים) צינור חרוטי 50 מ ל, לסובב את התאים עבור 3 דקות ב 2,100 x g. בזהירות להסיר את המדיום YAPD ולשטוף את גלולה פעם אחת עם 1 x PBS.
    4. לאחר מכן, resuspend בגדר µL 480 פירוק המאגר, µL 48 למען חברה דמוקרטית 10%, ו 480 µL באלכוהול פנול: כלורופורם: Isoamyl (25:24:1), pH 6.8. מערבולת המדגם במהירות המרבית עבור 5 s, והעברת לו כובע בורג 1.5 mL צינור עם 750 µL של חרוזי קריסטל קר כקרח (מסופק עם הקיט). המשך לשלב 3 של פרוטוקול זה כדי להפוך את פירוק התא הכולל החילוץ-RNA.
      הערה: כל ריאגנטים הנדרש עבור שלב 2.1.4 הינם מסופקים שמרים מומלץ ערכת חילוץ RNA. נוגדנים אלה לעבוד באותה מידה טוב של שמרים, תולעים וזבובים כך אחרי האוסף של שמרים (שלב 2.1), תולעים (שלב 2.2) או זבובים (שלב 2.3), גישה אחידה יכול לשמש ליצירת ספריות C-seq (שלבים 3-10).
  2. תרבות Caenorhabditis elegans אוסף
    1. אם ספריית C-seq רצוי של תולעים, להפקיד 30 תולעים בוגרות על צלחת אגר עם חיידקים OP50 טריים.
      הערה: חמישה לוחות מספיקים עבור שכפול 1.
    2. תרבות התולעים ארבעה ימים לאסוף את התולעים על ידי בעדינות שטיפת הצלחות עם 5 מיליליטר M9 מדיה ו בריכה התולעים לתוך צינור חרוטי בודד 50 מ.
    3. לסובב את התולעים למטה ב x 100 g למשך 2 דקות ליצור גלולה. להאט לצנטריפוגה במהירות הנמוך ביותר האפשרי לא להפריע בגדר.
    4. בעדינות להזיז את התולעים לתוך צינור 1.5 mL לשטוף אותם פעמיים ב 1.5 מיליליטר M9 מדיה, centrifuge את הצינור ב x 100 g עבור 1 דקות להסיר חיידקים ולהפיק גלולה µL נקי 100 של תולעים.
    5. Resuspend תולעים µL 480 פירוק המאגר, µL 48 למען חברה דמוקרטית 10% ו- 480 µL של פנול: כלורופורם: Isoamyl אלכוהול. מערבולת המדגם במהירות המרבית עבור 5 s והעברת לו כובע בורג 1.5 mL צינור המכיל 750 µL של חרוזי קריסטל קר כקרח. המשך לשלב 3 של פרוטוקול זה עבור פירוק של התולעים, החילוץ RNA הכולל.
  3. דרוזופילה melanogaster תרבות, אוסף
    1. אם ספריית C-seq רצוי מהזבובים, תרבות 20 – 25 זבובים בקבוקונים המכילים דקסטרוז או מדיום מבוסס-מולסה. Aliquot הזבובים מעל 3 שבקבוקי, כי כל בקבוקון מכיל כ 8 זבובים.
    2. כדי לאסוף את הזבובים, מקם את המבחנה לתוך דלי קרח עד הזבובים הם תרופות הרגעה. לאחר מכן, לאסוף אותם עם מכחול בשפופרת 1.5 mL. לא לאסוף הזבובים על ידי טיפול2 CO.
    3. אתן את הזבובים חמים לטמפרטורת החדר (RT), במהירות להוסיף תערובת premade של 500 µL פירוק מאגר µL 50 10% למען חברה דמוקרטית, µL 500 של אלכוהול פנול: כלורופורם: Isoamyl ברכבת התחתית. השתמש micropestle כדי לטחון את הזבובים עם-15 משיכות, מלווה על ידי חברת פיתול תנועה כשאחוז איחדו החלק התחתון של הצינור.
    4. שופכים את התערובת של זבובים, פירוק המדיה לתוך כובע בורג 1.5 mL צינור המכיל 750 µL של חרוזי קריסטל קר כקרח, מערבולת זה במהירות המרבית עבור להמשיך ס' 5 לשלב 3 של פרוטוקול זה עבור פירוק של הזבובים, החילוץ RNA הכולל.

3. טיהור RNA הכולל

הערה: בשלב זה, כל שלושת הפרוטוקולים מתכנסת, גישה אחת מאוחדת יכול לשמש ליצירת ספריות C-seq.

  1. לדפוק את הכובע על בחוזקה, לצרף את הצינור vortexer עם מתאם או סרט דביק. מערבולת הצינור במהירות מקסימלית 10 דקות lyse הדגימות. לאחר מכן, centrifuge את הדגימה ב x 16,100 g למשך 5 דקות להפריד את ממיסים אורגניים השלב מימית.
  2. בזהירות להסיר את µL 400 – 500 של שלב מימית מבלי להפריע את לאטמוספרה לבן, מעונן, ולהוסיף אותו צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 1.9 מ של איגוד מאגר. מערבבים אותם ביסודיות על ידי vortexing.
  3. מוסיפים 1.25 מ ל 100% אתנול ומערבבים את הדגימה על-ידי vortexing. להעביר µL 700 המדגם מחסנית מסנן התאספו בשפופרת איסוף ולסובב את הדגימה ב 14,500 x g ' חזור ' ס' 30 עד כל המדגם הוא עבר את מיכל הדיו.
    הערה: בשלב זה, הדגימה יכול להפעיל כמעצמה. אם תאים רבים מדי, תולעים או זבובים היו lysed, פוחת משקעים יכול להופיע כי ייתכן סותמים את המסנן.
  4. לשטוף את המסנן פעם עם 700 µL של שטיפת פתרון 1, ועם פעמיים 500 µL של שטיפת פתרון 2 או 3. לסיים את שוטף על ידי סחרור הדגימות ב x 14,500 g למשך 2 דקות להסיר את כל העודפים אתנול.
  5. להעביר את מחסנית מסנן צינור דולפין 1.5 מ"ל ולהוסיף µL 108 של פתרון • תנאי prewarmed (65 ° C).
    הערה: אף פעם לא לחשוף RNA דגימות לטמפרטורות גבוהות מ- 65 ° C לפני שעתוק במהופך, כפי עושה כל כך לעורר ציטוזין לאירועים דיאמינציה אורציל שאי אפשר להבחין בין שגיאות תיעתוק.
  6. לבזות את הזיהום DNA ב- RNA מבודד (ראה שלבים 2.1 – 3.4) על-ידי הוספת µL 11 של 10 x DNase אני מאגר µL 2 של RNase מעכב, µL 4 של DNase אני (8 U), דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  7. לאחר עיכול, להוסיף µL 11 של ריאגנט איון DNase. מערבולת התערובת ולתת לו לשבת ב RT במשך 5 דקות. לאחר מכן, centrifuge את הדגימה ב x 15,000 g למשך 3 דקות הצניפה הכימית איון ולאסוף µL 110 של תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר. להעביר את תגובת שיקוע צינור 1.5 מ.
    הערה: הכימית איון DNase יכול להיות די קשה pipet כראוי, אז באופן חזותי לבחון את הטיפ פיפטה לאחר כל פעולה pipetting. אם הכימית איון נעשית צמיגה יותר מדי כדי pipet, להוסיף 10 מ מ טריס-HCl (pH 7.4) שווה ל- 1/5 של אמצעי האחסון הנותרת.
  8. (בדיקת איכות) מודדים את ריכוז RNA הכולל שימוש ספקטרופוטומטרים. לאחר מכן להפריש 1 µL של RNA הכולל, למהול אותו כדי ריכוז של 10 ng/µL במים נטולי נוקלאז (NF). הפעל את הרנ א על מכשיר ניתוח נוקלאוטיד המתאים עם קלטת RNA רגישות גבוהה כדי להבטיח הרנ א לא יורד יש ערך ארין לפחות 8.5 או גבוה יותר (איור 2B).

4. mRNA העשרה

  1. לבצע את העשרת mRNA עם miniprep mRNA קיט (ראה טבלה של חומרים). להוסיף µL 140 NF מים לדוגמה עבור הנפח הכולל של 250 µL. לאחר מכן, הוסף 250 µL של 2 x מחייבת מאגר, לערבב את הדגימה ביסודיות על ידי vortexing, והוסף µL 15 של חרוזים oligo (dT).
  2. לערבב את הדגימה על-ידי pipetting זה למעלה ולמטה, דגירה זה ב 65 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. אז, במקום המדגם-RT למשך 10 דקות. לבסוף, centrifuge את הדגימה ב x 16,100 g למשך 2 דקות הצניפה את מתחמי חרוז: mRNA.
  3. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 500 µL של שטיפת פתרון. להעביר את הפתרון עמודה ספין, תסבני 1 דקות ב 15,000 x g. למחוק את הזרימה דרך ולשטוף את הדגימה עם µL 500 נוספים של שטיפת פתרון. . ואז, לסובב את הדגימה למשך 2 דקות ב x 15,000 g כדי להסיר אתנול עודף כל המסננים ספין.
  4. להעביר את המסנן ספין צינור דולפין, resuspend בגדר בעמודת µL 80 של פתרון • תנאי prewarmed (65 ° C). דגירה המדגם 1.5 דקות ב 65 ° C, elute זה על ידי סחרור זה עבור 1 דקות ב 15,000 x g.
  5. למדוד את הריכוז של RNA מטוהרים באמצעות ספקטרופוטומטרים או כלי דומה המאפשר כימות של RNA ריכוז ואיכות.

5. RNase הפיצול השלישי ו- RNA לנקות

הערה: (חשוב) להכין מולקולות RNA מעגלי המתאים ליצירת ספריות C-seq, הרנ א חייבים להיות מפוצלים בערך 60 – 80 הבסיסים אורך. בעוד שיטות קודמות השתמשו של פיצול כימי למקטע RNA, פיצול כימי עם מתכות כבדות מציג נזקים הדגימות RNA יכול להיות כשייך שגיאות תיעתוק במהלך הניתוח הסופי. כדי לעקוף בעיה זו, מסתמכים במקום על פיצול שימוש RNase השלישי כדי ליצור שברים קטנים. יתרון נוסף של גישה זו אנזימטי הוא שיוצר מסתיים תואם הדרושות מצדו, obviating את הצורך סוף-תיקון לאחר פיצול כימי.

  1. להגדיר את התגובה פיצול RNA עם 1 µg של RNA מטוהרים, µL 10 תגובה מאגר µL 5 RNase השלישי, NF מספיק מים כדי להביא את אמצעי האחסון עד 100 µL (ראה טבלה של חומרים). להוסיף את האנזים האחרון, pipette את התערובת למעלה ולמטה לפחות 10 פעמים כדי לערבב. דגירה המדגם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 25 דקות, אשר נוטה לייצר קטעים RNA של-60-80 הבסיסים אורך.
  2. לאחר סיום הדגירה 25 דקות, לנקות את התגובה מיד עם oligo לנקות, רכז קיט (ראה טבלה של חומרים) כדי למנוע כל עיכול נוספות. להוסיף 200 µL מחייב oligo מאגר לדגימת, לערבב את זה ביסודיות על ידי vortexing, ולהוסיף 800 µL של 100% אתנול. לערבב את הדגימה על ידי vortexing והעברתה לעמודה ספין שסופקו בשפופרת איסוף.
  3. Centrifuge הדגימה ב x 10,000 g s 30, לשטוף אותו עם µL 750 מאגר לשטוף כדי להסיר RNase השלישי. Centrifuge הדגימה ב x 10,000 g ב-30 s, למחוק את הזרימה דרך, ולשטוף המדגם עוד פעם עם µL 750 שטיפת מאגר כמתואר לעיל. לאחר הטיפול השני זרימה דרך מושלחת, centrifuge את העמודה ב 15,000 x g למשך 2 דקות להסיר את כל העודפים אתנול.
  4. להעביר את העמודה צינור טריים mL 1.5 ו- elute לדוגמה ב- µL 24 NF מים על ידי סחרור זה ב x 10,000 g עבור 1 דקות.
  5. בדיקת האיכות: לקחת 2 µL של השברים RNA מטוהרים, למהול אותו קיפול כפול על-ידי הוספת 2 µL של מים NF אליו. הפעל את הרנ א מפוצלים על קלטת מסך כדי להבטיח הרנ א מפוצלים בטווח של 50 – 100 בסיסים אורך (איור 2 c).

6. RNA Circularization, מתגלגל מעגל שעתוק במהופך

  1. כדי circularize את מקטעי RNA, חום-denature 20 µL של המדגם ב 65 ° C עבור 1 דקות ומניחים אותו על הקרח מיד למשך 2 דקות. לאחר מכן, להוסיף 4 µL של 10 x מאגר ליגאז T4 RNA, µL 4 10 מ מ ATP, µL 1 של RNase מעכב, 1 µL של מים NF ו 8 µL של 50% פוליאתילן גליקול (PEG).
  2. לערבב את הדגימה ביסודיות על ידי vortexing, ואז להוסיף 2 µL של 10 U µL של T4 רנ א ליגאז אני תמהיל המדגם שוב על-ידי pipetting זה, דגירה זה 25 ° c עבור 2 h ב- thermocycler עם הטמפרטורה של המכסה שוכן בגובה 30 ° C.
  3. לאחר 2 h, להוסיף 10 µL של מים NF המדגם ולנקות את הדגימה עם ערכת ניקיון וריכוז oligo בהתאם למפרט היצרן. Elute הדגימה ב 20 µL של מים NF.
  4. כדי להפוך לתעתק את מולקולות ה-RNA מעגלי, להוסיף 4 µL של 10 מ מ dNTPs µL 4 של 50 ng/µL hexamers אקראי, µL 9 NF מים µL 9 של RNA. לערבב הכל היטב על ידי pipetting, denature את הדגימה ב 65 ° C עבור 1 דקות, ומניחים אותו על קרח 2 דק החנות את הרנ א הנותרות בתור גיבוי.
  5. מוסיפים µL 8 המאגר הראשון-strand סינתזה x 5, µL 2 של 0.1 מ מ DTT ו 4 µL של 200 U/µL רוורס טרנסקריפטאז ומערבבים הכל על-ידי pipetting. דגירה המדגם ב 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואחריו עם הדגירה 20 דקות ב 42 ° C עם המכסה להגדיר ב 5 ° C גבוה יותר מאשר הטמפרטורה הדגירה.
    הערה: רוורס טרנסקריפטאז עם סטרנד הדחק יכולות יש להשתמש בשלב זה כדי לאפשר שעתוק במהופך מתגלגל מעגל.
  6. להוסיף 10 µL של מים NF המדגם, לנקות את זה עם oligo לנקות וריכוז הקיט בהתאם להמלצות היצרן. Elute את מדגם 42 µL של פתרון • תנאי.
  7. בדיקת האיכות: למהול 2 µL של cDNA חד גדילי ב 2 µL של מים NF ולהפעיל את הדוגמית הזו על מכשיר ניתוח נוקלאוטיד עם קלטת RNA רגישות גבוהה. אם שעתוק לאחור עבד כמו שצריך, ספריית cDNA מולקולות, החל בערך 60 – 1,500 הבסיסים אורך, צריך להיות גלוי. באופן אידיאלי, רוב cDNA הוא בטווח של 500-1000 בסיסים (איור דו-ממדי).

7. שני סטרנד cDNA סינתזה ותיקון קצה

  1. להשתמש ערכת סינתזת גדיל השני כדי ליצור ספריית cDNA גדילי כפול. למקם את הדגימות הקרח ולהוסיף µL 30 NF מים µL 38 הדוגמית שלכם. לאחר מכן, להוסיף µL 8 של 10 x מאגר סטרנד השני ו 4 µL של האנזים סטרנד השניה ומערבבים המדגם מאת pipetting עדין לפני שלה הדגירה ב 16 ° C עבור 2.5 h.
  2. לנקות הדגימות עם oligo ניקיון וריכוז קיט על פי ההמלצות של היצרן עבור 100 תגובות µL, elute את הדגימות ב 38 µL של מים NF.
  3. להגדיר את התגובה סוף-תיקון על-ידי הוספת 20 µL של מים NF 35.5 µL של גדילי כפול cDNA, µL 6.5 סוף תיקון התגובה המאגר, 3 µL של סיום ההכנה אנזים מיקס. בזהירות לבדוק המאגר התגובה פוחת משקעים לבן, לפזר אותם על ידי חימום יד אם קיים.
  4. לערבב את התגובה סוף-תיקון על ידי pipetting, דגירה זה ב 20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ואחריו דגירה 30 דקות השני ב 65 º C. לקבוע את הטמפרטורה של המכסה thermocycler 5 ° C גבוה יותר מאשר הטמפרטורה הדגירה.

8. מתאם מצדו ובחירת גודל של ספריות מוכן

  1. להשתמש מודול הכנת ספריה רב שלבי ההכנות הסופי בספריה (ראה טבלה של חומרים). ראשית, לדלל את מתאמים עבור רצף 10-fold הדור הבא ב- 10 מ מ טריס-HCl כדי ריכוז סופי של 1.5 מיקרומטר. לאחר מכן, להוסיף 2.5 µL של מתאם מדולל 1 µL של מצדו משפר כל מדגם ומערבבים אותם על-ידי vortexing.
  2. להוסיף µL 15 של בלאנט/ת א ליגאז מאסטר לערבב, לערבב את זה על-ידי pipetting, דגירה זה ב 20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן, להוסיף 3 µL של האנזים מגיב ספציפית אורציל כריתה, דגירה זה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. עם השלמת מצדו, להוסיף µL 13.5 NF מים לדוגמה עבור הנפח הכולל של 100 µL והמשך בחירת גודל.
    הערה: מומלץ לבחור גודל עבור cDNA מולקולות הנמצאות בטווח של 600 – 800 הבסיסים אורך. אם מולקולות RNA מפוצלים היו כ- 60 – 80 הבסיסים אורך, בחירת עבור מולקולות שאינן 600 – 800 הבסיסים אורך יבטיח כי רוב המולקולות שנבחרו מכילים לפחות שלושה חזרה טנדם, אשר הינו אידיאלי עבור עיבוד במורד הזרם, ניתוח.
  3. כדי לבחור עבור מולקולות הנמצאות 600 – 800 bp אורך, להוסיף 30 µL של resuspended beads מגנטי (ראה טבלה של חומרים), זמן קצר RT, אחד לטעום ולערבב על-ידי pipetting. להעביר את הדגימה אל צינור 1.5 mL, דגירה זה ב RT במשך 5 דקות.
  4. מניחים את הדגימה על עמדה מגנטי עבור 5 דקות להפריד את החרוזים תגובת שיקוע. להעביר את תגובת שיקוע (המכיל את המולקולות cDNA המבוקש) ל mL 1.5 החדש צינור ולחסל החרוזים מגנטי (אשר מאוגדים גדול cDNA מולקולות).
  5. להוסיף aliquot טריים של 15 µL של beads מגנטי כל דגימות, לערבב ביסודיות על ידי pipetting, ואת תקופת דגירה של 5 דקות במקום RT. את הדוגמאות על מתלה מגנטי דגירה אותם למשך 5 דקות ב- RT. לאחר מכן, בזהירות להסיר, להיפטר supernatants, מוודא שלא להפריע את החרוזים.
    הערה: אל תשליך החרוזים מגנטי, עכשיו להכיל את cDNA היעד הרצוי.
  6. להוסיף 200 µL של 80% להתמחויות אתנול לכל אחת הדגימות מבלי להפריע את החרוזים מגנטי pelleted תקופת דגירה של ביטול ס' 30 האתנול, לשטוף את הדגימות. עוד פעם עם 80% אתנול. ואז, באופן מלא להסיר את עקבות של אתנול מדגימות מילה נהדרת את החרוזים עבור 5 דקות אך יש להקפיד לא לייבש יתר על המידה את החרוזים. אם החרוזים הם overdried, יופיעו סדקים כדורי.
  7. כדי elute דגימות מן החרוזים, להסיר את הצינורות הדוכן מגנטי ולהוסיף µL 19 10 מ מ טריס-HCl. Pipet זה למעלה למטה מספר פעמים כדי resuspended את החרוזים ואת דגירה הדגימות למשך 5 דקות ב- RT. אם החרוזים היו overdried, דגירה אותם > 10 דקות.
  8. למקם את הדגימות חזרה לדוכן מגנטי, דגירה אותם למשך 5 דקות להפריד את החרוזים תגובת שיקוע. בזהירות להסיר את µL 15 של תגובת שיקוע המכילה את הספריות cDNA מטוהרים, שנבחר בגודל של הצינורות, להעביר אותו צינור mL 1.5 טריים.

9. PCR הגברה וטיהור חרוז הסופי

  1. מוסיפים 5 µL של פריימר אוניברסלי 5 µL של פריימר אינדקס ייחודי (ראה טבלה של חומרים) לכל אחד מטוהר ספריית cDNA ומערבבים אותם באופן יסודי על-ידי pipetting. בזהירות לבדוק את התמהיל פולימראז מאסטר קריסטלים, פוחת משקעים אחרים, לחמם את תערובת הבסיס בעבודת יד עד התמוססות פוחת משקעים.
    1. להוסיף 25 µL של המיקס מאסטר פולימראז לדגימת, לערבב אותם על-ידי pipetting ובצע את התנאים אופניים מתחת הגברה PCR. להפעיל את דנטורציה הראשונית ב 98 ° C ל 30 s, ולאחר מכן לבצע צעד כפול PCR תגובה מאת denaturating הדגימות ב 98 ° C עבור 10 s וחישול/הרחבה של מוצרי ה-PCR-65 מעלות צלזיוס במשך 75 s (12 x), ואחריהם סיומת הסופי ב 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, להחזיק לא מוגדר על 4 מעלות צלזיוס.
  2. לנקות את הספריות סופית על-ידי הוספת 45 µL של resuspended beads מגנטי ישירות אל התגובה PCR, לערבב אותם על-ידי pipetting, ואת דגירה אותם ב RT עבור 5 דק העברת לדוגמה כדי צינור 1.5 mL ומניחים אותו בתבנית עמדה מגנטי. תקופת דגירה זה של 5 דקות, למחוק את תגובת שיקוע, לשטוף אותו פעמיים עם שזה עתה הוכנו 80% אתנול ל 30 s.
  3. לאחר השטיפה השנייה לחלוטין להסיר האתנול מן המדגם, מילה נהדרת בגדר חרוז במשך 5 דקות, elute זה ב µL 35 של 0.1 x טה. Resuspend החרוזים מאת pipetting אותם, דגירה אותם ב RT עבור 5 דק המקום המדגם על הדוכן מגנטי ואחרי 5 דקות, להעביר 30 µL של תגובת שיקוע צינור mL 1.5 טריים. לאחסן את הספריות ב- 80 ° c
  4. בדיקת האיכות: למהול 1 µL של הספרייה הסופי µL 9 NF מים ולהפעיל את הדגימה כלי ניתוח DNA ייעודי עם שבב רגישות גבוהה; הרוב המכריע של cDNA צריך להיות בטווח של 600 – 800 bp אורך (2e איור).
  5. לאחר • תנאי, לשלוח. את הדגימות רצף על פלטפורמה רצף מקביל בנפט באמצעות קריאות לזווג-end bp 250 או 300 bp יחיד-end קריאות.

10. ביו-informatic ניתוח מעגל רצף נתונים

הערה: ניתוח ופרשנות של נתונים גולמיים של C-seq וזמינותו מחייבת צינור ייעודי ביו-informatic. תיאור סכמטי של הצינור ששימש עבור ניתוחים שלנו מתואר באיור3. הורד את הצינור ב- https://github.com/LynchLab/MAPGD.

  1. ראשית, לקצץ את הקריאות כדי להסיר מתאם רצפים ושיחות באיכות נמוכה בסיס עם cutadapt18, באמצעות סף ציון האיכות של 20.
  2. לאחר מכן, לזהות חוזר מקודד על ידי מולקולת RNA concatemerized באמצעות אלגוריתם המתאים כדי לזהות כל חזרה עם גודל מינימלי של 30 נוקלאוטידים וחוזר לכל היותר 2 אי-התאמות בין18. רצף הקונצנזוס שואבים אלה חזרה, לשמור על מעקב אחר של כל שיחות הבסיס ואת איכות המשויך ציונים-לכל תפקיד.
    הערה: כיוון שעתוק במהופך יכולה להתחיל בכל במיקום על מולקולת RNA circularized, תחילת שידור חוזר אינן תואמות בהכרח יונקות-סוף מולקולת RNA מפוצלים (ןלהל הנקודה מצדו). בהתאם לכך, רצף קונצנזוס לא ימפה באופן רציף נגד transcriptome המתאים, אשר מחייבת הזיהוי של הנקודה מצדו.
  3. כדי לזהות את נקודת מצדו, מפה של concatemer של רצף קונצנזוס נגד transcriptome הפניה באמצעות יישור דמוי פיצוץ כלי (בלאט)19.
    1. לשרשר שני מופעים של רצף קונצנזוס על מנת להבטיח כי הרצף ממופה מכיל מופע ללא הפרעה מלאה לפחות אחד של רצף מקטע RNA הראשוני. לאחר מכן, לסובב את רצף קונצנזוס להתחיל במיקום הנקודה מצדו החזוי.
  4. למפות את רצפי הקונצנזוס מסובב נגד הגנום באמצעות TopHat20 ולהשתמש את היישורים כדי לזהות כל פולימורפיזמים נוקלאוטיד יחיד (SNPs) אשר עלולים להיחשד על שגיאות תיעתוק.
  5. קוראים את שגיאות תיעתוק רצפי הקונצנזוס שסובבו ממופה ותבדוק אם השגיאות המועמד לעבור ארבע בדיקות נוספות.
    1. תחילה, ודא כי שגיאת תיעתוק אינו חופף עם הסנ פ (דרישה טיפוסי הוא קורא לפחות 20 צריך לכסות מסוים הבסיס ולא יותר מאשר 5% הקריאות עשויים לתמוך שיחה בסיס חלופי).
    2. שנית, בדוק רצף קונצנזוס נגזרת לפחות 3 חזרה טנדם, שכל אחד מהם קורא את אותו זוג בסיס; שלישית, לוודא כי הסכום על עשרות רבות של איכות של עמדה זו חייבת להיות מעל 100
  6. עבור הרביעית והאחרונה לבדוק, לסובב את רצף הסכמה של כל השילובים האפשריים (הדמיית כל העמדות אפשרי של הנקודה מצדו), למפות כל גירסה נגד הגנום הפניה באמצעות TopHat.
    הערה: אם אחד של הרצף שסובבו מוצא התאמה מושלמת הגנום, הנקודה המתאימה מצדו נחשב כיום הנכונה, יש לדחות את השיחה שגיאת תיעתוק.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כמו כל הגישות רצף מקביל בנפט, ניסוי C-seq מייצרת dataset מסורבל, גדול. עבור משתמשים בפעם הראשונה, זה יכול להיות קשה לטפל datasets אלה; לכן, מומלץ כי כל המשתמשים קשר של informatician-ביו מנוסה לפני הניסויים. בממוצע, הצפי הוא כי המשתמשים יפיק כ 55-70 גיגה בסיסים (Gbases) לכל הפעלה בפלטפורמות רצף מקביל מאסיבית ביותר. עבור פרוטוקול זה, בדרך כלל, 12 – 30 הדגימות היו מרובב לכל הפעלה כך עבור כל דגימה נרכשו כ- 2-6 Gbases. לאחר קיצוץ מתאם רצפים של שיחות הבסיס באיכות נמוכה (< 20) את הנתונים (dataset), נותרה ~ 70% של גודל הנתונים ההתחלתיים.

בסיסים אלה ואז ניתוח נוסף כדי לחקור את היעילות של פיצול RNA ו- circularization על-ידי קביעת הגודל של חוזר זה נוצרו. רוב חוזר נוטים להיות בסיסים 45-80 אורך (איור 4A), כ- 50% של הבסיסים בהם היו וסודרו הם חלק אלה חזרה (איור 4B). היות רוב בסיסים אלה הם נוכח קריאות המכילים חזרה 3 או יותר, מספר ייחודי הבסיסים בהם הם וסודרו הוא כשליש של המספר הכולל של בסיסים וסודרו. בממוצע, > 75% של רצפי הקונצנזוס אלה ניתן למפות בחזרה הגנום הפניה. לבסוף, כ- 25% של בסיסים אלה מכוסים על ידי קריאות 20 או יותר, אשר בסופו של דבר אומר כי כ 10% של הנתונים יכול לשמש עבור שגיאות. דוגמה של ניתוח זה הוא נתון באיור 4, אשר מייצג את המידע רצף שנרכשה במהלך הסידור של פרוטוקול זה עבור שכפול 1 של ספריית C-seq יחיד בה היה וסודרו רדודות יחסית ומייצג התחתונה מגבלת הנתונים המשתמשים יכולים לצפות לרכוש.

כ 5,000 – 25,000 שגיאות לכל הפעלה נוטים להיות מזוהה, למרות המספרים האלה יכול להשתנות באופן משמעותי בהתאם שיעור שגיאה עצמה (גבוה יותר שיעור שגיאה, השגיאות יותר יזוהו), לגודל transcriptome (גדול transcriptome, בסיסי פחות יהיה מכוסה 20 קריאות, הגבלת הנתונים רצף יכול לשמש עבור שגיאות), ואת העומק שבו הוא רציף (רצף עמוק יותר תצליח יותר סביר כי בסיס נתון יכוסו על-ידי קורא 20 או יותר). שגיאות אלה נוטים להיות מופץ ברחבי הגנום כולו, כך בממוצע ~ 47 אחוז השגיאות ממוקמים ב mRNA מולקולות שנוצר על ידי RNA פולימראז II (RNAP II), ~ 49% ממוקמים מולקולות rRNA שנוצר על ידי RNAP, ~ 3% הנותרים ממוקמים RNAs שנוצר על-ידי RNAP השלישי של RNA פולימראז מיטוכונדריאלי. עם זאת, אלה יחסי יכול להשתנות באופן משמעותי בהתאם סוג התא או אורגניזם תחת חקירה (איור 4C). לדוגמה, סוגי תאים המסתמכים בכבדות על פונקציית מיטוכונדריאלי, כגון cardiomyocytes, להכיל RNA באופן משמעותי מיטוכונדריאלי יותר מאשר סוגי תאים אחרים, המגביר את מספר מולקולות רנ א מיטוכונדריאלי רציף, וכך מספר שגיאות זוהה.

ברגע רשימת שגיאות נאסף, למיקומם ברחבי הגנום ידועים, שגיאות אלה ניתן להשתמש כדי לזהות את הפרמטרים השולטים שיעור שגיאה של שעתוק של כל אורגניזם. לדוגמה, המיקום של אלה שגיאות תיעתוק יכול להיות בקורלציה עם תכונות רבות של הגנום, כגון הנוכחות של ה-DNA חוזרים, בהקשרים גנטי, או את קצב הביטוי, כדי להבין כיצד תכונות אלה לשנות את אמינות תמלול5. הצפי הוא כי בעתיד, למרות, למשתמשים תהיה אפשרות לקבוע כיצד אינספור תכונות נוספות משפיעות על נאמנות תעתיק, כולל סמני epigenetic, הארגון תלת-ממדי של הגנום, זמינות חומרי הזנה, גיל או חשיפה רעילים תרכובות, להבהיר את התרומה של גורמים גנטיים וסביבתיים על נאמנותם של שעתוק.

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של RNA-seq לעומת C-תת סעיף. (א) RNA מסורתי-seq ניסויים ולבודד RNA מתוך מדגם של עניין, קטע את הרנ א ולאחר הפוכה לתעתק את זה לפני רצף והכנה ספריית הסופי. עם זאת, נהלים הכנה אלה מציגים פריטים טכניים רבים לתוך הספריה בצורה של שעתוק במהופך שגיאות, PCR הגברה, ושגיאות רצף שגיאות. (B) זו אופטימיזציה של C-seq assay מאפשר על התיקון של לכלוכים טכניים אלה על-ידי circularizing מולקולות RNA המפוצלים לפני שעתוק במהופך, המאפשר להם להיות הפוכה עיבד בצורה מעגל המתגלגל לייצר ליניארי חזור על cDNA מולקולות המכילות מספר עותקים של התבנית המקורית RNA במשולב. אלה חזרה טנדם ואז ניתן להבחין שגיאות תיעתוק נכון בין חפצים, כמו שגיאות תיעתוק אמיתי (סטאר) יהיה נוכח כל חזרה באותו מיקום, ואילו חפצים כגון להפוך שגיאות תיעתוק (מרובע) ו- PCR הגברה שגיאות (עיגול) נמצאים רק חזרה אחת או שתיים של כל מולקולה cDNA נתון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: נציג תוצאות עבור ספריית הכנה- אלה הצג חלוניות electrophoretogram עבור הקלטת מסך רגישות RNA (A) גבוה סולם (ראה טבלה של חומרים), ה-RNA (B) סה כ מכל האפייה, RNA מפוצלים RNase השלישי (C) ו ( D) מתגלגל בעיגול cDNA עיבד הפוכה. (E) ספריית cDNA שנבחר בגודל הסופי פועל על ניתוח רגישות גבוהה כפול גדילי הדנ א שבב (ראה טבלה של חומרים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: סכימטי של הצינור ביו-informatic המשמש לניתוח נתונים רצף מעגל. לאחר קיצוץ של קריאות רצף, חזרה מזוהים, רצף קונצנזוס נוצר באמצעות הקריאה בסיס סביר במיקום נתון כלשהו. לאחר מכן, הנקודה מצדו של תבנית ה-RNA הראשוני מזוהה, רצף קונצנזוס מיושר הגנום הפניה כך ניתן לזהות שגיאות תיעתוק פוטנציאליים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: דוגמה של תוצאות עבור C-Seq צינור. (א) לוח זה מראה התפלגות גודל רצפי הקונצנזוס המתקבל ניסוי C-Seq טיפוסי. (B) לוח זה מציג את מספר בסיסים קריאות, אחוז של קריאות וסודרו בכל שלב של הצינור ביואינפורמטיקה C-Seq. (ג) לוח זה מציג את מספר שגיאות תיעתוק זוהה, האחוז של שגיאות לייחס RNA פולימראז אני RNA פולימראז II, ה-RNA פולימראז השלישי, מיטוכונדריאלי RNA פולימראז. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ממוטב עבור הכנת C-seq ספריות איתור שגיאות תיעתוק האפייה, דרוזופילה melanogasterו Caenorhabditis elegans. פרוטוקול זה יש יתרונות רבים על פני הפרוטוקולים הקיימים, כמו גם טכניקות חלופיות.

במהלך 15 השנים האחרונות, מערכות כתב רבים פותחו המסתמכים על לוציפראז7,8 או Cre-לקס רקומבינציה3,4,15,21 לזהות שעתוק שגיאות. מערכות אלו כתב לא תסולא בפז להבנת החוקרים של אמינות תעתיק כי הם הרשו גנים אללים, המנגנונים המולקולריים להיות מזוהה ישירות המסדירים את הנאמנות של שעתוק. עם זאת, הם רק מדווחים על שגיאות בתבניות פגום באופן מלאכותי, או בתוך הקשרי גנטי ספציפי מאוד, אשר מגביל את השאלות המדעיות שהם יכולים לענות. יתרון חשוב של פרוטוקול C-seq הוא כי היא מפקחת על הנאמנות של שעתוק לאורך כל transcriptome5, הרחבה הידע המדעי של דיוק אשר מתבטא מידע גנטי. שנית, מכיוון וזמינותו C-seq מנצל RNA כחומר המקור שלו, סביר כי assay זו ניתן להתאים כל אורגניזם של בחירה, obviating את הצורך ליצור כתב מסובך בונה לדגם לכל הטרנסגניים. פרוטוקול זה יש גם יתרונות על פני רצף מקביל בנפט קיימות גישות17,22. בעיקר, רוב הגישות הללו עושים שימוש של מתכות כבדות לספריות קטע RNA. עם זאת, שיטות אלה פיצול להציג חפצים לתוך RNA הם נבדלים שגיאות תיעתוק נכון5. כדי לפתור בעיה זו, פרוטוקול זה קטעים RNA enzymatically עם RNase השלישי, אשר יש יתרון נוסף כי זה משאיר קצוות תואם עבור עצמי מצדו, פישוט ה-RNA circularization והגברת הרגישות של וזמינותו במידה רבה ~ 10-fold.

במקביל, וזמינותו C-seq יש לשתף משלה של מגבלות. ראשית, אף-על-פי וזמינותו מודד שגיאות תיעתוק ברחבי הגנום כולו, מרכיב גדול של הנתונים נוטה להיגזר הגנים מבוטאים מאוד, כמו תעתיקים של גנים אלה נוטים להשתלט רוב ספריות ה-RNA. גורם נוסף זה מסלף את הניתוח לכיוון מאוד ביטוי גנים הוא הסף בנוי לתוך הצינור ביו-informatic מונע מוטציות גנטיות ו- RNA עריכת אירועי בלבול המדידות הסופי. הסף הזה מכתיב כי רק הבסיסים בהם היו וסודרו 20 פעמים או יותר יכולים לשמש לניתוח הסופי. מגבלה נוספת נוגעת ספריית גיוון. כמו רוב ערכות המשמש להפקת RNA, ערכת המשמש כאן לא ביעילות לטהר מולקולות RNA קטנות, אשר מגביל את מספר הקריאות נגזר מולקולות מסונתז על ידי השלישי RNAP. המגוון של הספרייה רצף הסופי עוד יותר מוגבל על ידי השלב טיהור mRNA מועסק כאן. אף-על-פי מולקולות שנוצר על ידי RNAP אני יכול להיות יעיל וסודרו, רוב RNAs מיטוכונדריאלי, הנותרים tRNAs, ואת אי קידוד RNAs אובדות במהלך שלב זה. כדי ללכוד את מולקולות אלה יותר לעתים קרובות, ערכה שונה המטהרת מולקולות RNA קטנות במיוחד אמור לשמש, או סוגי תאים צריך להיות ממוקד כי הם מועשרים עבור מולקולות אלה. שימו לב, כי רוב הבעיות הללו ניתן לפתור על ידי רצף עמוק יותר מהרגיל, או במקביל רצף ה-DNA מ לאותם התאים, למרות שני הפתרונות האלה דורשים השקעה כספית גדולה יותר על-ידי החוקרים.

בנוסף, התפתחויות טכנולוגיות עתידיות הן צפוי לשפר את הבדיקה C-seq ברמה הבסיסית. לדוגמה, על-ידי הרחבת לקריאה-אורך קיים רצף טכנולוגיה, אותו ניתן יהיה רצף ארוך יותר מולקולות, מה שאומר כי חזרה יותר יכול לשמש כדי לברר את הנאמנות של שעתוק. שיפורים כזה יגרום באופן אוטומטי לעומק רצף גדול ועלייה באחוז קריאות שיכול לשמש לניתוח במורד הזרם. טענה דומה ניתן לבצע עבור כל טכנולוגיה רצף המאפשר מולקולות נוספות היה לסדרם במקביל. בנוסף, רבים מרכיבי וזמינותו C-seq נשארים שיש למטב, כולל את היעילות של RNA circularization, את לכתחילה של בחירת גודל מהות וזמינותו עצמה זמן רב. לבסוף, מומלץ מאוד כי כל המשתמשים לקבל גישה כלי ייעודי, רגישות גבוהה עבור חומצות גרעין ניתוח ופתרון בעיות פוטנציאליות (ראה טבלה של חומרים). בלי כלי זה, זה יכול להיות קשה מאוד לקבוע באיזו נקודה מתעוררות בעיות פוטנציאליות, ובכך הפיכתם אי אפשר לתקן.

אמנם הפרוטוקול כולו סלחנית למדי (טעות קטנה נוטים להיות השלכות משמעותיות), ישנם מספר שלבים הם קריטיים לחלוטין להצלחה של C-seq וזמינותו. אחת הדרישות החשובות ביותר היא RNA מבודד מטופלת בעדינות ככל האפשר. רוב שיטות החילוץ RNA וערכות עיבוד במורד הזרם אכפת לי מעט על ההרכב הכימי של הרנ א מעבר בתקני תעשייה בסיסית, אשר היא מספקת ניתוחים מולקולריים ביותר. עם זאת, וזמינותו C-seq הוא המוטל עם זיהוי שגיאת תיעתוק יחיד בין מאות אלפי בסיסים WT, המגביר את הצורך להפחית את הלחץ מולקולרית. אפילו ללחץ משפיעה רק 1 ל-10,000 בסיסים ניתן להציג לכלוכים הרסניים לפסול לחלוטין את התוצאות. לדוגמה, משתמשים חייבים מעולם לא להימנע/גבול וחושפים הרנ א בכל טמפרטורה מעל 65 מעלות צלזיוס. שנית, כל משתמש חייב בזהירות לייעל את הזמן הנדרש עבור הפיצול RNA עם RNase השלישי. זה בהחלט הכרחי להצלחת וזמינותו כי המולקולות הסופי הם כ- 60 – 80 הבסיסים אורך. מולקולות קצרות עלול להיות קשה למפות הגנום, ועוד יותר מולקולות לא יאפשר עבור 3 חזרה עצמאית היה לסדרם בתוך קריאה bp 250. לבסוף, מומלץ להימנע הקפאה והפשרה של RNA יותר מפעם אחת במהלך כל פרוטוקול. במקום זאת, לבודד את הרנ א ולסינתזה של cDNA ביום אחד. בגלל זמן ומאמץ מעורב עם התחייבות זו, המורכבות של הפרוטוקול עצמו במספר הדגימות המעובדות לעתים קרובות בעת ובעונה אחת, מומלץ כי שני חוקרים לעבוד יחד כדי ליצור ספריות אלה.

כאשר הוא מוצלח, ניסויים אלה יאפשרו לזהות באופן מדויק שגיאות תיעתוק מכל יצור, בשום מצב ניסיוני. לדוגמה, על ידי השוואת שליטה ויחידים חולה אחד לשני, יתכן אפשר לקבוע אם מחלות מסוימות משויכים שגיאות תיעתוק, אשר עלול לגלות רכיב חדש של האטיולוגיה של פתולוגיות אנושיים רבים. פרמטרים אחרים זה יכול להיות נחקר הם הזדקנות organismal, תזונה, גנוטיפ, גורמים סביבתיים, כגון חשיפה לכימיקלים רעילים. יתר על כן, כי זה וזמינותו מזהה שגיאות תיעתוק ברחבי transcriptome, זה יאפשר לחוקרים לנתח את המנגנונים שונים שתורמים הנאמנות של RNA פולימראז אני, II, III, וכן את מיטוכונדריאלי RNA פולימראז. בהתאם לכך, אנו מצפים כי פרוטוקול זה יפתח את שדה חדש של מוטגנזה מכוונת לניסויים נרחבת, המאופיינת על ידי המחקר של מוטציות ב- RNA ולא ב- DNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

פרסום זה התאפשר על ידי מימון גרנט T32ES019851 (ל ג Fritsch), R01AG054641, חוקר צעיר עפר להעניק (Vermulst מ').

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RiboPure RNA purification kit ThermoFisher AM1926 Total RNA purification
Genelute mRNA purification kit Sigma-Aldrich MRN70-1KT mRNA purification
Nuclease-free Water Ambion AM9937 Elution and dilution
Ambion RNase III ThermoFisher AM2290 RNA fragmentation
T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) New England Biolabs M0204S RNA circularization
Ribolock ThermoFisher EO0381 RNase inhibitor
SuperScript III Reverse Transcriptase ThermoFisher 18080044 Rolling circle reverse transcription
10 mM dNTP mix ThermoFisher 18427013 Rolling circle reverse transcription
Random hexamers (50 ng/µL) ThermoFisher N8080127 Rolling circle reverse transcription
NEB Second Strand Synthesis Module New England Biolabs E6111S Second Strand Synthesis
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina New England Biolabs E7370S cDNA library preparation
NEB Next index primers NEB E7335S Multiplex PCR primers
Oligo Clean & Concentrator Zymo Research D4061 Clean up of RNA and DNA samples
DynaMag-2 Magnet ThermoFisher 12321D Magnetic bead purification
AMPure XP beads Beckman Coulter A63881 Magnetic bead purification
Eppendorf 5424 Microcentrifuge FisherScientific 05-403-93 centrifugation
INCU-Shaker 10 L Benchmark Scientific H1010 Cell culture
T100 Thermal Cycler BIO RAD 1861096 Medium to High temperature cycling conditions
PTC-200 Thermal Cycler GMI 8252-30-0001  Low temperature cycling conditions
RNase Away Molecular Bioproducts 700S-11 Sterilization
50 mL Centrifuge Tube Corning 430290 Nuclease-free
15 mL Centrifuge Tube Corning 430052 Nuclease-free
Eppendorf tubes USA Scientific 1615-5500 Nuclease-free
4200 Tapestation System Agilent G2991AA Nucleotide analysis instrument for quality control of RNA and single stranded DNA samples
High Sensitivity RNA Screen Tape Agilent 5067-5579 Quality control of RNA and single stranded DNA samples
RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent 5067-5577 Quality control of RNA and single stranded DNA samples
RNA ScreenTape Ladder Agilent 5067-5578 Quality control of RNA and single stranded DNA samples
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent G2939BA Double stranded DNA quality control
High Sensitivity DNA Kit Agilent 5067-4626 Quality control for double stranded cDNA samples
Water Bath VWR 462-0244 Incubation
NanoDrop 2000/2000C Spectrophotometer ThermoFisher ND-2000C Determination of RNA concentration

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kireeva, M. L., et al. Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation. Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).
  2. Walmacq, C., et al. Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II. The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).
  3. Strathern, J., et al. The fidelity of transcription: RPB1 (RPO21) mutations that increase transcriptional slippage in S. cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2689-2699 (2013).
  4. Irvin, J. D., et al. A genetic assay for transcription errors reveals multilayer control of RNA polymerase II fidelity. PLoS Genetics. 10, e1004532 (2014).
  5. Gout, J. F., et al. The landscape of transcription errors in eukaryotic cells. Science Advances. 3, e1701484 (2017).
  6. Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. Large-scale detection of in vivo transcription errors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).
  7. Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells. Science. 284, 159-162 (1999).
  8. Bregeon, D., Doddridge, Z. A., You, H. J., Weiss, B., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis induced by uracil and 8-oxoguanine in Escherichia coli. Molecular Cell. 12, 959-970 (2003).
  9. Saxowsky, T. T., Doetsch, P. W. RNA polymerase encounters with DNA damage: transcription-coupled repair or transcriptional mutagenesis. Chemical Reviews. 106, 474-488 (2006).
  10. Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).
  11. Vermulst, M., et al. Transcription errors induce proteotoxic stress and shorten cellular lifespan. Nature Communications. 6, 8065 (2015).
  12. van Leeuwen, F. W., Burbach, J. P., Hol, E. M. Mutations in RNA: a first example of molecular misreading in Alzheimer's disease. Trends in Neurosciences. 21, 331-335 (1998).
  13. van Leeuwen, F. W., et al. Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer's and Down patients. Science. 279, 242-247 (1998).
  14. Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance. Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).
  15. Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. Isolation and characterization of transcription fidelity mutants. Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).
  16. Acevedo, A., Andino, R. Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses. Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).
  17. Traverse, C. C., Ochman, H. Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity. mBio. 8, (2017).
  18. Martin, M. Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads. EMBnet.journal. 17, (1), 10-12 (2011).
  19. Kent, W. J. BLAT--the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12, 656-664 (2002).
  20. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14, R36 (2013).
  21. Zhou, Y. N., et al. Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).
  22. Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).
מעקב ברמת הגנום של שגיאות תיעתוק היצורים האיקריוטים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fritsch, C., Gout, J. F. P., Vermulst, M. Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms. J. Vis. Exp. (139), e57731, doi:10.3791/57731 (2018).More

Fritsch, C., Gout, J. F. P., Vermulst, M. Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms. J. Vis. Exp. (139), e57731, doi:10.3791/57731 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter