Her beskriver vi standardprotokollen for påvisning av β-galactosidase aktivitet i tidlig hele mouse embryoer og metoden for parafin snitting og counterstaining. Dette er en enkel og rask prosedyre å overvåke genuttrykk under utvikling som kan også brukes til vev deler, organer eller kulturperler celler.
Escherichia coli LacZ genet, koding β-galactosidase, brukes hovedsakelig som en reporter for genuttrykk og en tracer i celle avstamning studier. Klassisk histochemical reaksjonen er basert på hydrolyse av underlaget X-gal i kombinasjon med ferric og jern ioner, som produserer en uløselig blå bunnfall som er lett å visualisere. Derfor fungerer β-galactosidase aktivitet som en markør for uttrykket mønsteret av genet av interesse som utviklingen fortsetter. Her beskriver vi standardprotokollen for påvisning av β-galactosidase aktivitet i tidlig hele mouse embryoer og påfølgende metoden for parafin snitting og counterstaining. I tillegg tilbys en prosedyre for å avklare hele embryo bedre visualisere X-gal flekker i dypere områder av fosteret. Konsekvente resultater er oppnådd ved å utføre denne prosedyren, selv om optimalisering av reaksjonen forhold er nødvendig for å minimere bakgrunn aktivitet. Begrensninger i analysen bør også vurderes, spesielt om størrelsen av embryoet i hele mount flekker. Våre protokollen gir en følsom og en pålitelig metode for påvisning av β-galactosidase under musen utvikling som kan brukes mer kryostaten deler samt hele organer. Dermed dynamisk genet uttrykk mønstre gjennom utvikling enkelt kan analyseres ved hjelp av denne protokollen i hele embryoer, men også detaljert uttrykk på cellenivå kan vurderes etter parafin snitting.
For å beskrive spesifikke genet uttrykk mønstre, er bruk av reporteren gener som markører viktig fra Drosophila for pattedyr. Eksperimenter med transgene og knockout dyr, er bakteriell β-galactosidase genet (LacZ) av Escherichia coli (E. coli) en av de mest brukte1,2,3, 4. β-galactosidase (β-gal) gir hydrolyse av β-galactosides (for eksempel laktose) i monosaccharides (glukose og galaktose)5. Det mest brukte underlaget er X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), en glycoside som er hydrolyzed av β-galactosidase gir opphav til 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole og galaktose. Først er oksidert i således en dimer som, når kombinert med kalium ferri- og ferro-cyanid, produserer en karakteristisk uløselig, blått utløse (figur 1)6.
LacZ genet begynte å bli brukt som en reporter genet over tretti år siden7,8. Vanligvis LacZ settes nedstrøms en endogen formidler stedet åpent lesing rammen, slik at den kan brukes i bakteriell og cellen kultur visualisere cellene som inneholder en bestemt setter og transgene dyr som en tracer av endogene Gene expression mønstre under utvikling9. I denne forbindelse har visualisering av β-galactosidase aktivitet vært mye brukt i Drosophila for å forstå de utviklingsmessige og cellulære prosessene fra enkeltceller hele vev. Drosophila arvelighetsforskning favorisere generering av stabil linjer som en endret P-element konstruksjon som inneholder reporter genet LacZ er satt inn tilfeldig steder i genomet. Dermed når plassert under påvirkning av enhancer elementer kan det drive sitt uttrykk i en vev bestemt måte, som har tillatt systematisk analyse av uttrykk mønstre av mange gener i løpet av de siste to tiår10. I tillegg kan bruken av transgene mus å overvåke LacZ genuttrykk også påvisning av genet rekombinasjon hendelser etter grobunn-loxP mediert rekombinasjon, og lokalisering av mutant embryonale stamcelleforskningen derivater i chimeric analyser 11, som forenkler kontroll av LacZ uttrykk i bestemte vev også som timelig. Også i hele embryoer, kan oppdagelsen av β-galactosidase aktivitet produsere differensial flekker mønstre på forskjellige intensiteter som enkelt kan observeres over forskjellige utviklingsstadier analysere tidsmessige endringer i genuttrykk 8,12.
I denne artikkelen presenterer vi en protokoll for å visualisere genuttrykk gjennom X-gal flekker i hele mount vev på tidlig i utviklingen etapper av mouse embryoer. Vi presenterer denne histochemical metoden som en svært følsom og billig teknikk som favoriserer nøyaktig påvisning av merket cellene i hele mount prøver eller på cellenivå etter parafin innebygd vev eller embryoer. Metoden tillater direkte visualisering av flekker i musen vevet med minimum bakgrunnen sammenlignet med andre metoder13.
E. coli LacZ genet har vært mye brukt som reporter i studier av genet uttrykk mønstre på grunn av dens høy følsomhet og enkel oppdagelsen. Nåværende protokollen beskriver en klassisk metode for å oppdage β-gal uttrykk basert på en enzymatisk reaksjon som er raskt og enkelt å utføre og billig. Denne metoden kan brukes også uten store endringer i hele mount embryo, intakt organer, kryostaten vev deler eller kulturperler celler.
Nøyaktig anvendelse av denne metoden resulter…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Histopathological tjenesten for deres kundestøtte på Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC). Vi takker også Dr. Motoharu Seiki for vennlige gi Mt4-mmpLacZ mus, og Dr. Alicia G. Arroyo for å støtte vårt prosjekt og hennes kritisk lesning av manuskriptet. Vi ønsker å takke Peter Bonney for korrekturlesing av denne artikkelen. Dette arbeidet ble støttet av Universidad Europea de Madrid med stipend (# 2017UEM01) til C.S.C.
REAGENTS | |||
2-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 24137-1L-R | |
Agarose | SCHARLAU | 50004/ LE3Q2014 | |
Aqueous mounting medium | VECTOR LABS | H-5501 | |
Synthetic mounting media | MERCK | 100579 | |
96% Ethanol | PROLABO | 20824365 | |
99.9% Ethanol absolute | SCHARLAU | ET00021000 | |
50% Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G6403-100ml | |
85% Glycerol | MERCK | 104094 | |
99.9% Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5516 | |
Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA-ALDRICH | 63064 | |
Nonionic surfactant (Nonidet P-40) | SIGMA-ALDRICH | 542334 | |
Nuclear Fast Red counterstain | SIGMA-ALDRICH | N3020 | |
Paraffin pastilles | MERCK | 111609 | |
Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500g | |
Phosphate buffered saline (tablets) | SIGMA-ALDRICH | P4417-50TAB | |
Potassium ferrocyanate | MERCK | 1049840500 | |
Potassium ferrocyanide | MERCK | 1049731000 | |
Sodium azide | SIGMA-ALDRICH | S8032 | |
Sodium deoxycholate | SIGMA-ALDRICH | 30970 | |
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | SIGMA-ALDRICH | 106346 | |
Sodium phosphate dibasic dihydrate | SIGMA-ALDRICH | 71638 | |
Thymol | SIGMA-ALDRICH | T0501 | |
Tris hydrochloride (Tris HCl) | SIGMA-ALDRICH | 10812846001 (Roche) | |
X-GAL | VENN NOVA | R-0004-1000 | |
Xylene | VWR CHEMICALS | VWRC28973.363 | |
EQUIPMENT | |||
Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm | SAKURA | 4566 | |
Rotatory Microtome | Leica | RM2235 | |
Cassettes | Oxford Trade | OT-10-9046 | |
Microscope Cover Glasses 24×60 mm | VWR | ECN631-1575 | |
Microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | AGAA000001#12E | |
Adhesion microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | J1820AMNZ | |
Flotation Water bath | Leica | HI1210 | |
Disposable Low Profile Microtome Blades | Feather | UDM-R35 | |
Paraffin oven | J.R. SELECTA | 2000205 | |
Wax Paraffin dispenser | J.R. SELECTA | 4000490 | |
Stereomicroscope | Leica | DM500 | |
Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL | SIGMA-ALDRICH | T2795 | |
Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL | SIGMA-ALDRICH | T9661 | |
Orbital shaker | IKA Labortechnik | HS250 BASIC | |
Stirring Hot Plate | Bibby | HB502 | |
Vortex Shaker | IKA Labortechnik | MS1 | |
Laboratory scale | GRAM | FH-2000 | |
Precision scale | Sartorius | ISO9001 | |
pHmeter | Crison | Basic 20 | |
Optic fiber | Optech | PL2000 |