Summary
يتم استخدام تقنية ميوجراف الأسلاك للتحقيق في وظائف العضلات الملساء والأوعية الدموية، وأدوية جديدة للشاشة. نحن تقرير بروتوكول مفصلاً لقياس contractility متساوي القياس الشريان المساريقي العلوي الماوس وفحص جديد إرخاء العضلات الملساء والأوعية الدموية.
Abstract
يتم استخدام تقنية ميوجراف الأسلاك لتقييم كونتراكتيليتي للعضلات الملساء والأوعية الدموية في الرد على ديبولاريزيشن ويضع GPCR/مثبطات والمخدرات. ويستخدم على نطاق واسع في العديد من الدراسات على الوظائف الفسيولوجية للعضلات الملساء والأوعية الدموية والآلية المرضية لأمراض الأوعية الدموية مثل ارتفاع ضغط الدم، واستحداث أدوية ارتخاء العضلات الملساء. الفأر حيوان نموذجية مستخدمة على نطاق واسع مع مجموعة كبيرة من النماذج المرض والسلالات المحورة وراثيا. قدمنا هذا الأسلوب لقياس متساوي القياس تقلص الشريان المساريقي العلوي الماوس بالتفصيل. شريحة 1.4 ملم من الشريان المساريقي العلوي المقاومة الماوس معزولة وشنت في دائرة ميوجراف بتمرير اثنين من الأسلاك الصلب عن طريق التجويف به. بعد خطوات الموازنة والتطبيع، كان potentiated الجزء السفينة بحل عالية-ك+ مرتين قبل الفحص الانكماش. كمثال لتطبيق هذا الأسلوب في تطوير العقاقير، قمنا بقياس أثر ارتخاء مادة طبيعية الرواية، نيولينسينيني، معزولة عن عشب صيني، أجنة البذور لوتس (جذور اللوتس (جايرتن.) على الماوس المساريقي العلوي الشرايين. كانت تحفز أجزاء السفينة التي شنت على الدائرة ميوجراف مع حل عالية-ك+ . عند التوتر القوة وصلت إلى مرحلة متواصلة مستقرة، أضيفت الجرعات التراكمية من نيولينسينيني إلى الدائرة. وجدنا أن نيولينسينيني كان لها أثر ارتخاء تعتمد على الجرعة على تقلص العضلات الملساء، مما يشير إلى أن يتحمل نشاط محتمل ضد ارتفاع ضغط الدم. وباﻹضافة إلى ذلك، كما يمكن البقاء على قيد الحياة على الأقل 4 ساعات بعد تصاعد الجزء السفينة والحفاظ على كونتراكتيليتي الناجمة عن الحل عالية-ك+ لمرات عديدة، فإننا نقترح أن يمكن استخدام نظام ميوجراف سلك لعملية تستغرق وقتاً طويلاً لفحص المخدرات.
Introduction
وكان النظام ميوجراف السفينة الصغيرة المستخدمة هنا لقياس انكماش متساوي القياس من السفن الصغيرة المقاومة بأقطار داخلية تتراوح من 100 إلى 400 ميكرون. معزولة السفن الصغيرة (حوالي 2 مم طويل) أدرجت بأسلاك قطرها 40 ميكرومتر اثنين وكانت في ذلك الحين شنت على الفكين ميكرومتر-جانب محول طاقة والتتابع. كان هذا الأسلوب ميوجراف اقترح أولاً في عام 19721 وثم وضعت أساسا عن طريق مولفاني وله الزملاء3،2،4،،من56. والآن أسلوب ناضجة مع المعدات مستقرة وسهلة الأداء قياسية تطبيع الداخلي7،،من89. ونحن تستخدم هذا الأسلوب مع بعض التعديلات للقياسات في الشريان المساريقي العلوي الماوس.
خطوط العضلات الملساء والأوعية الدموية على جدران الأوعية الدموية كلها تقريبا. وظيفتها الأساسية لتوليد القوى من خلال تقلص في الاستجابة للمحفزات المختلفة. كونتراكتيليتي طبيعي للعضلات الملساء والأوعية الدموية أمر ضروري لتنظيم ضغط الدم والتغذية الملحق10. تنظيم نتائج ضغط الدم في مجموعة متنوعة من الأمراض، بما في ذلك ارتفاع ضغط الدم وفشل القلب واحتباس الدم. غير طبيعية واقترح العديد من الدراسات أن ضغط الدم غير طبيعي يرتبط دائماً مع اختلال العضلات الملساء والأوعية الدموية كونتراكتيليتي7،11،،من1213. يسمح أسلوب ميوجراف التحقيق في كونتراكتيليتي متساوي القياس سفن الماوس المستحث بالمنبهات المختلفة بما في ذلك فاسوكونستريكتورس ومثبطات والمخدرات. قياسات ناجحة من الانكماش سوف تساعدنا على فهم آليات الحفاظ على ضغط الدم، وأمراض من أمراض الأوعية الدموية المرتبطة بالعضلات الملساء واستكشاف النهج العلاجية رواية.
العديد من الأعشاب الصينية قد استخدمت على نطاق واسع للعلاج السريري لأمراض الأوعية الدموية؛ ومع ذلك، مكوناتها الفعالة عادة ما زال غير معروف. وهكذا، عزل وتحديد المكونات الفعالة مهم جداً لتطوير أدوية جديدة. ميوجراف أسلاك متعددة التكنولوجيا يوفر نهج بسيط لفحص المكونات النشطة في الأعشاب. لقد أفادت دراسات عديدة باستخدام نظام ميوجراف سفينة صغيرة للتحقيق في تقلص الشريان المساريقي العلوي الماوس وتحديد المركبات الطبيعية مع النشاط المضادة ارتفاع ضغط الدم12،،من1314. هنا، يمكننا وصف مفصل البروتوكول للأسلوب ميوجراف وتقييم أثر ارتخاء نيولينسينيني المعزولة من أجنة بذور اللوتس (جايرتنجذور اللوتس ). 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافق الحيوانية التلاعب "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة "نموذج الحيوان بحوث مركز نانجينغ".
1-حل إعداد
- إعداد هيبيس-تيرودي الحل (ح تي) باستخدام 137.0 مم كلوريد الصوديوم، 2.7 مم بوكل و 1.8 مم كاكل2، 1 مم مجكل2∙6H2س، 5.6 ملم د-الجلوكوز و 10 مم هيبيس، 7.3-7.4 درجة الحموضة.
- إعداد حل تيرودي حبيس دون الكالسيوم (Ca2 +-مجاناً ح تي) استخدام مم 140.6 كلوريد الصوديوم، 2.7 مم بوكل، 1 مم مجكل2∙6H2س، 5.6 ملم د-الجلوكوز و 10 ملم حبيس، 7.3-7.4 درجة الحموضة.
- إعداد حل تيرودي حبيس 124 مم بوكل (عالية ك+) 15.7 ملم كلوريد الصوديوم، مم 124.0 بوكل، كاكل 1.8 مم2، 1 مم مجكل2∙6H2س، 5.6 ملم د-الجلوكوز، و 10 ملم حبيس، الأس الهيدروجيني باستخدام باستخدام 7.3-7.4.
2-تجربة إعداد
- يسخن ح تي والحلول عالية-ك+ باستخدام حمام مائي 37 درجة مئوية.
- قم بتشغيل نظام ميوجراف والبيانات اقتناء الأجهزة والكمبيوتر.
- ملء بعناية جميع الدوائر ميوجراف مع 5 مل ح تي الحل.
- ملء أطباق بيتري اثنين مع 20 مل من 4 ° ج ح تي و Ca2 +-مجاناً ح تي الحلول، على التوالي، وتخزين على الجليد.
- ملء طبق بيتري مغلفة 10 سم مع 20 مل من محلول ح تي، والحفاظ عليه في درجة حرارة الغرفة.
3-الماوس تشريح الشريان المساريقي العلوي
- Euthanize العمر 8-12 أسبوع C57BL/6J الإناث أو الذكور ماوس بخلع عنق الرحم. دبوس الماوس باستمرار مع البطن مواجهة.
- ترطيب البطن مع الإيثانول 70%. ثم قطع الجلد مع المقص على طول خط الوسط البطني من الفخذ، وجعل شقوق من بداية الشق الأول أسفل الساقين على كلا الجانبين. سحب الجلد مرة أخرى على كلا الجانبين؛ جعل شقوق مماثلة لفتح الصفاق.
- باستخدام مقص، قص المريء والقولون والأنسجة الضامة الأخرى لعزل الجهاز الهضمي مع تغذية المفرج من الجسم تماما.
- مع الملقط، نقل الجزء المعزول إلى الطبق الذي يحتوي على البرد ح تي إعدادها في الخطوة 2، 4، ولطف شطف الأنسجة في حل ح تي عدة مرات ليغسل الدم.
- نقل الجزء المعزول في طبق بتري المغلفة بإعدادها في الخطوة 2، 5، وإجراء تشريح الشريان المساريقي العلوي في درجة حرارة الغرفة.
- على نحو سلس المعدة وصائم، اللفائفي والاعور في اتجاه عقارب الساعة، ويعلقون على المعدة والاعور على الجانب الأيسر والأيمن، على التوالي.
- تمتد السرير المفرج المساريقي العلوي وإصلاح الأمعاء باستخدام دبابيس لكشف تشريح الشرايين المساريقي العلوي.
ملاحظة: في ظل هذه الظروف، الشرايين على رأس الأوردة. - تشغيل نقل مصدر الضوء مجهر مجسم، وتشريح الشرايين تحت المجهر. تأكد من أن الأنسجة كاملة هي مغمورة في الحل.
- المشبك الأنسجة الدهنية حول الشرايين مع الملقط، وعزل الشرايين بقطع جميع الأنسجة الضامة مع مقص التشريح. تجنب إصابة الشرايين.
4-الشرياني تصاعد
- نقل وتزج شجرة الشريان المساريقي العلوي في كاليفورنيا البارد2 +-الحرة حل ح تي (أعد في الخطوة 2، 4) قبل لقط الشرايين الزائدة بالملقط.
- اقتطاع نسبة 1.4 ملم من الشريان الدانية لجدار الأمعاء من ممر المساريقي العلوي، واستخدام الملقط اثنين لفتح كلا الجانبين من هذا الجزء من الشريان بعناية.
- إعداد جزأين من أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ طولها 2.5 سم، ووضعها في الطبق نفسه.
- المشبك بلطف واحدة من نهاية الشريان باستخدام الملقط، وإدراج اثنين من الأسلاك بعناية في تجويف الشريان واحداً تلو الآخر مع مساعدة من الملقط آخر. تأكد من أن الأسلاك يتم الاحتفاظ بها مباشرة، ولا تلمس البطانة.
- استخدام الملقط اثنين، المشبك اثنين من الأسلاك الصلب خارج السفينة الخيوط في وقت واحد، ونقل السفينة بعناية من طبق بيتري إلى غرفة ميوجراف كانت مليئة بحل ح تي (الخطوة 2، 3).
- برغي الفكين بعيداً لإفساح المجال لتصاعد. المشبك كلا الجانبين من واحد من اثنين من الأسلاك تم إدراجها باستخدام الملقط اثنين، ومكان السفينة في الفجوة الفك (الشكل 1A).
- التفاف على جانبي الأسلاك فرضت حول مسامير الفك متصلاً الميكرومتر (الشكل 1B).
- إصلاح المسمار الأيسر بالتواء في اتجاه عقارب الساعة. تصويب السلك باستخدام الملقط الأيمن, ثم إصلاح المسمار الأيسر بالتواء في اتجاه عقارب الساعة (الشكل 1). تأكد من أن السفينة دائماً داخل الفجوة الفك، ولكن لا تلمس الفك لتجنب الضرر.
- إغلاق الفكين هما استخدام الميكرومتر (الشكل 1). تأكد من جوز اثنين يتم إغلاق كافية ولكن أن لا تلامس بعضها البعض، وأن السلك غير المثبتة على رأس سلك ثابت.
- استخدام الملقط الأيمن، بعناية إضعاف السلك مفكوك في زاوية الفك متصلة بقوة محول الطاقة، والتفاف من عكس اتجاه عقارب الساعة حول المسمار الجانب الأيمن (الشكل 1E). ثم، إصلاح المسمار. كرر هذه الخطوة على الجانب الأيسر من الأسلاك وإصلاح الجانب الأيسر المسمار (الشكل 1F).
- تحريك الفكين قليلاً عن بعضها البعض بالتناوب بعناية الميكرومتر (الشكل 1). تجنب تمتد السفينة. استخدام الملقط لنقل الأسلاك إلى جانب ميكرومتر إلى الطائرة الأفقي للأسلاك إلى جانب محول طاقة. تدوير الميكرومتر بعناية حيث أن تتسع الفجوة بين فكي اثنين فقط لاثنين من الأسلاك.
- كرر الخطوات من 4.2-4.11 جبل الشرايين على الدوائر الأخرى. توصيل جميع الدوائر بالمعدات وتغطية الدوائر، تعلق إمدادات الأكسجين 100% ومسبار درجة حرارة وبدء تشغيل التدفئة إلى 37 درجة مئوية. فتح رسم برامج الحاسوب واضغط على زر ابدأ في نافذة عرض الرسم البياني لبدء التسجيل.
- حجته لحوالي 20 دقيقة.
5-التطبيع
ملاحظة: بغية توحيد الشروط التجريبية والحصول على استجابة فسيولوجية موثوقة من السفن، هو إجراء تطبيع اللازمة15. وفقا للعلاقة بين القوة النشطة ومحيط الداخلية للسفينة، النظام ميوجراف سلك لديها برنامج تطبيع قياسية لتقييم محيط الداخلية (IC) السفينة المحملة5،8، 9. بإيجاز، لحساب IC (ميكرومتر) وقراءة الميكرومتر وإدخال القيمة كقيمة X ومحول إخراج القوة، أي يستريح الجدار التوتر (mN/مم)، كقيمة Y. البرنامج سوف يعود منحنى مجهزة من (X, Y) وحساب IC المقابلة لضغط ترانسمورال من 100 مم زئبق (IC100). يتم تعيين السفينة إلى محيط الداخلية تم تسويتها (جيم1) القصوى عند استجابة نشطة.
- تعيين قوات إلى الصفر لجميع القنوات على الجهاز، وحجته لآخر 1-2 دقيقة.
- حدد إعدادات التطبيع من "دمت القائمة، وقم بإعداد المعلمات كما يلي:
معايرة العدسة (ملم/div): 0.36؛ تستهدف الضغط (الكوري): 13.3؛ IC1/IC100: 0.9؛ متوسط الوقت (بالثواني) على الإنترنت: 2؛ تأخير الوقت (بالثواني): 60. انقر فوق الزر موافق لإغلاق نافذة الإعدادات تطبيع دمت . - قم بتحديد قناة اهتمام من دمت القائمة لفتح نافذة تطبيع دمت للقناة المقابلة. أدخل القيم الثابتة في الإطار كما يلي: الأنسجة اندبوينتس a1: 0.1؛ الأنسجة اندبوينتس a2: 4؛ قطر السلك (ميكرومتر): 40. يعرض الإطار طول السفينة المحسوب ك 1.40 ملم.
- قراءة الميكرومتر الدائرة الأنسجة المناسبة. أدخل القيمة في المربع القراءة ميكرومتر ، وانقر فوق الزر إضافة نقطة . هذه القيمة هي القيمة الأولى من س (X0). بعد فترة تأخير s 60، يعرض الإطار القوة والضغط الفعال (أرتب) المقابلة لهذه القيمة ميكرومتر. في نفس الوقت، يصبح المربع ميكرومتر القراءة النشطة.
- تمتد السفينة يجري تطبيعها بتحول الميكرومتر في اتجاه عقارب الساعة. أدخل قيمة ميكرومتر في المربع القراءة ميكرومتر ، وانقر فوق الزر إضافة نقطة . الانتظار لفترة تأخير 60 s مرة أخرى.
- كرر الخطوة 5، 5، لا تزال تمتد السفينة، وإضافة قيم ميكرومتر حتى النافذة بعرض قيمة "X ميكرومتر1"، الذي هو الإعداد ميكرومتر المحسوبة المطلوبة على امتداد السفينة إلى IC1.
- تعيين الميكرومتر X القيمة1 .
ملاحظة: أن التوتر تطبيع هو عادة mN 1-2.
6. تسجيل تقلص الشريان
ملاحظة: تم إعداد جميع الحلول، بما في ذلك ح تي والحل عالية-ك+ المستخدمة في هذا القسم، في الخطوة 2، 1.
- بعد التطبيع وحجته السفينة في الدائرة لمدة 15-20 دقيقة.
ملاحظة: هذه لا حاجة إلى تغيير الحل في هذه الخطوة. - تحدي السفينة مع الحل عالية-ك+ مرتين.
- للطعن في السفينة، يحل محل الحل ح تي مع 5 مل من محلول عالي ك+ للحث على تقلص مدة 10 دقيقة، تليها الغسيل مع 5 مل من محلول ح تي 3-4 مرات.
ملاحظة: قد تقلص نموذجي قوة قصوى 3 mN وقوة المطرد مستمر حول 2.5 mN12. إذا كان التحدي الأول يولد قوة قصوى أدناه 2.5 mN أو يقلل من قوة مستمرة مع مرور الوقت أو التحدي الثاني الذي يولد قوة أقل بكثير من الجرعة المرة الأولى، يتم تجاهل السفينة ولن تستخدم لإجراء مزيد من التحقيقات.
- للطعن في السفينة، يحل محل الحل ح تي مع 5 مل من محلول عالي ك+ للحث على تقلص مدة 10 دقيقة، تليها الغسيل مع 5 مل من محلول ح تي 3-4 مرات.
- تحدي السفينة مع 5 مل من محلول عالي ك+ للحث على الانكماش. بعد 5 دقائق، إضافة 0.5 ميليلتر من حل الأسهم (10 ملم في [دمس]) نيولينسينيني14 في قاعة للاسترخاء السفينة بتركيز 1 ميكرومتر نيولينسينيني نهائية.
- عندما تكون القوة مستقرة (وهذا عادة ما يستغرق عدة دقائق)، إضافة آخر ميليلتر 0.5 لحل نيولينسينيني الأسهم في الدائرة لزيادة التركيز إلى 2 ميكرومتر. أضف 1 ميليلتر حل الأسهم في كل مرة لزيادة التركيز إلى 4، 6، 8 و 10 ميكرون لتوليد t أنه منحنى الاستجابة للجرعة.
ملاحظة: الأسهم وتركيزات العامل تختلف بين المخدرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ونحن قياس contractility متساوي القياس الشريان المساريقي العلوي الماوس باستخدام نظام ميوجراف أسلاك متعددة وقيمت أثر ارتخاء نيولينسينيني تنقيته من أجنة بذور اللوتس (جايرتنجذور اللوتس ). 14-الشريان المساريقي العلوي المقاومة الماوس كانت معزولة وتنظيفها من الأنسجة الضامة ومقطعة شرائح 1.4 ملم. تم إدراج الجزء الشريان باثنين من الأسلاك الفولاذية في Ca2 +-الحرة حل ح تي في طبق بتري، وثم تم تحميل الجزء على جوز اثنين من دائرة ميوجراف (الشكل 2A). بعد تركيب القطعة، عدلت اثنين من الأسلاك لتكون متوازية، قريبة لكن عدم لمس كل منهما الآخر (الشكل 2). قبل قياس القوة، طبعت الجزء المتعلق بالسفن و potentiated مرتين من قبل الحل عالية-ك+ بغية تحقيق استقرار السفينة. كانت السفينة أثناء إجراءات التطبيع، تمتد عدة مرات حتى وصلت إلى قيمة IC100، وشملت كل دورة تمتد انكماش قوي والاسترخاء السريع وصيانة قوة في 60 ثانية (الشكل 3). وأظهرت انكماش العضلات الملساء والأوعية الدموية الناجمة عن حل عالية-ك+ عادة مرحلتين، مرحلة قوية ومرحلة متواصلة (الشكل 3). يمكن أن يكون الجزء المتعلق بالسفن المستخدمة لتجارب أخرى إلا إذا العالية-ك+-يظهر تقلص مقولة عادية واستنساخه. يتم تمثيل مقياس نموذجي مع نيولينسينيني في الشكل 4. عندما قوة التوتر الناجم عن عالية-ك+ وصلت إلى مرحلة متواصلة، أضفنا الجرعات التراكمية من نيولينسينيني (1، 2، 4، 6، 8 و 10 ميكرومتر) من خلال الثقوب في تغطية الدائرة. كما زادت الجرعات، خفضت القوة بطريقة تعتمد على الجرعة. النتيجة أشارت إلى أن نيولينسينيني هو عبارة عن مادة ارتخاء العضلات الملساء والأوعية الدموية التي يحتمل أن تكون بمثابة المضادة ارتفاع ضغط الدم المخدرات مرشح14.
رقم 1: طيطي الشرياني تصاعد الداخلي. الخطوط الزرقاء تمثل الأسلاك، والمستطيل الأحمر الذي يمثل الشريان. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: شنت شريحة شريان المساريقي العلوي ماوس على الدائرة ميوجراف. (أ) شنت شريحة شريان المساريقي العلوي ماوس على جوز اثنين باستخدام اثنين من الأسلاك الفولاذية. شريط أبيض = 2 مم. (ب) ألف مجهرية صورة الجزء الشريان المساريقي العلوي الماوس المحملة في الفريق (أ). شريط أسود = 0.5 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الممثل الأصلي وسم تبين إجراءات التطبيع والتقوية بالحل عالية-ك+ . بعد تنشيط عالية-ك+ الثاني، يمكن إجراء التجربة العادية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 4: تمثيلية تتبع الماوس الشريان المساريقي العلوي الذي هو تعاقد عالية-ك + الحل وخففت بعد ذلك بإضافة الجرعات التراكمية من نيولينسينيني- كما زادت الجرعات، خفضت القوة بطريقة تعتمد على الجرعة الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ارتفاع ضغط الدم تحد صحة العامة على نطاق واسع نظراً لحدوث مضاعفات خطيرة، بما في ذلك القلب والأوعية الدموية و أمراض الكلي16. فهم الآلية المرضية لارتفاع ضغط الدم، واستكشاف المزيد من الأدوية الخافضة للضغط قد أصبح مهمة ملحة في هذا المجال. ولدت ضغط الدم والحفاظ على المقاومة المحيطية للتداول. وفقا للقانون في بوازوي، تولد نسبة كبيرة من المقاومة الدورة الدموية الشرايين صغيرة نسبيا بمثابة منتج المهيمنة لضغط الدم3،10. وهكذا، قياس الشرايين الصغيرة-المقاومة بدلاً من الشرايين الكبيرة أكثر ملاءمة لإجراء دراسات لضغط الدم. التكنولوجيا ميوجراف الأسلاك واحدة من أفضل الطرائق لدراسة الوظائف الفسيولوجية للشرايين الصغيرة-المقاومة والمرضية لأمراض الأوعية الدموية.
النظام ميوجراف سلك السفينة الصغيرة موثقة في تقارير أخرى، وكانت تستخدم لقياس الانكماش للفئران الشرايين المساريقي العلوي8 والماوس الشرايين مثل الشريان الاورطي9. وأصبحت الاستفادة من التلاعب بالجينات، ومجموعة متنوعة من نماذج المرض ونماذج فحص المخدرات، الماوس حيوان نموذجية مستخدمة على نطاق واسع في العديد من المجالات. ولذلك، هنا، قدمنا بروتوكول تعديل هذا الأسلوب لقياس تقلص الشريان المساريقي العلوي الماوس. في هذا التقرير، قمنا بقياس contractility الشرايين المساريقي العلوي الماوس مع التعديلات الأساسية المخازن المؤقتة وخطوات التركيب بنجاح. تستخدم العديد من الدراسات على قياس السابقين فيفو فاسوكونتراكتيليتي المحاليل المحتوية على ناكو3، مثل حلول كريبس، لتقليد الحل الملح الفسيولوجية. ومع ذلك، تحتاج هذه المخازن المؤقتة CO2 لضبط قيمة pH في جميع أنحاء القياس، أدى إلى إنتاج كربونات الكالسيوم3. تحديد الحل ح تي كنظام تشغيل المخزن المؤقت، ووجدت أنها عملت بشكل جيد. نظراً لدرجة الحرارة له تأثير ضئيل على فك قيمة حبيس، قيمة الرقم الهيدروجيني للحل هو تعديل ملائم في درجة حرارة الغرفة ولم يتغير في 17من 37 درجة مئوية. وبالإضافة إلى ذلك، نحن نستخدم Ca2 +-مجاناً الحل ح تي عند توجيه الأسلاك عن طريق التجويف السفينة بغية منع انقباض السفينة بواسطة Ca2 +. تعديل آخر في هذا البروتوكول هو إجراء التركيب. ويوصي بعض التقارير8،9 و جهاز يدوي5 توجيه السلك الثاني بعد إصلاح السلك الأول في الفك. ونجد أنه يعمل بشكل أفضل عندما تسترشد اثنين من الأسلاك عن طريق التجويف السفينة قبل تركيب السفينة لأن هذا الأسلوب قد يقلل من الأضرار المحتملة لمحول نظراً لمساحة الدائرة المحدودة.
وعلى الرغم من إمكانية تكرار نتائج عالية لهذا الأسلوب، ينبغي أن نولي المزيد من الاهتمام لبعض الخطوات الرئيسية. الأكثر أهمية لتجنب إلحاق الضرر بالسفن التي تسببها ملقط ومقص. أثناء تشريح السفينة، ينبغي استخدام الملقط لطف عندما تمتد في الأنسجة الدهنية للمشغل واستخدام المقص بعناية عند قطع الأنسجة الضامة. وباﻹضافة إلى ذلك، لقط السفينة للتثبيت ينبغي أن يكون ذلك بلطف، وينبغي تجنب الأضرار بالبطانة عند توجيه الأسلاك لأن السفينة المتضررة بسبب البطانة سوف تؤدي إلى استجابات غير طبيعي، على سبيل المثال. ,، السفينة التالفة يظهر التوتر الظاهر القوة بعد التحفيز مع أستيل, بينما السفينة العادية يظهر تأثير ارتخاء. وتفسير هذه الظاهرة أن البطانة التالفة لا يمكن إنتاج أكسيد النيتريك بشكل صحيح. لاحظ أن في التجربة التي تنطوي على انكماش المتصلة بالبطانة، ينبغي اختبار حالة البطانة قبل قياس القوة. وبالإضافة إلى ذلك، نحن ينبغي أيضا بعناية جبل السفينة في الفكين سبب تلف محول بسهولة إذا ما طبقت بقوة الثابت. أخيرا، نحن عادة لا تستخدم قيمة زيادة مستمرة في الميكرومتر عند تنفيذ التطبيع. قيمة الزيادة 30 أو 20 ميكرومتر في البداية و 10 ميكرون بعد ضغط فعالة تصل إلى 11-12 الجيش الشعبي الكوري. هذا الأسلوب قد يقلل من وقت التطبيع وقد تحول دون إرهاق، وبالتالي تخفيف الضرر السفينة.
على الرغم من أن التحقيق تركز على الماوس المساريقي العلوي الشرايين، يمكن أيضا استخدام هذا الأسلوب للشريان الاورطي والقصبات الهوائية، وأخرى من السفن الصغيرة بما في ذلك الكلي، الدماغ والشرايين الرئوية. نظراً إلى أن هذا النظام يشمل أربع قنوات، أنها ملائمة لقياس أربع عينات موازية في نفس الوقت. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن توفر سرير الأوعية الدموية المساريقي العلوي كامل مالا يقل عن أربعة قطاعات الشريان، وبالتالي فمن السهل جداً لتصميم المجموعات التجريبية المختلفة. وفقا لتجربتنا، كل قطعة الشريان 4 ساعات على الأقل على قيد الحياة ويحافظ استجابات جيدة للحل عالية-ك+ على الأقل 6 من التكرار. هذه الخاصية مفيدة للغاية لقياس آثار عدة إضافات من مختلف المخدرات مرشح. ومع ذلك، هناك أيضا القيود المفروضة على النظام ميوجراف الأسلاك. التجربة ميوجراف سلك فيفو السابقين فقط قادرة على قياس فاسوكونتراكتيليتي متساوي القياس، ولكن فإنه عادة ما ينبغي أن تقترن بقياسات أخرى للتحليل المعقد للسفينة.
وباختصار، وصفت لنا طريقة لقياس contractility متجازئه في الشريان المساريقي العلوي الماوس باستخدام نظام ميوجراف أسلاك متعددة. يمكن استخدام هذا الأسلوب لتقييم وظائف العضلات الملساء والأوعية الدموية، وشاشة إرخاء العضلات الملساء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر الدكتور وي تشي أنه (جامعة سوشو، سوتشو، الصين)، والدكتور يان نينغ تشياو (جامعة شنشي للمعلمين، شيان، الصين) للمساعدة التقنية. هذا العمل ودعم مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (منحة 31272311 و 81373295 و 81473420) وتمويل المشروع "أولوية الأكاديمية برنامج التنمية من جيانغسو مؤسسات التعليم العالي" (رقم المنحة يسكسك-2016).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi wire myograph system | DMT | 610-M | |
| Stainless steel wire | DMT | 400447 | |
| Geuder dissection scissor | DMT | 400431 | |
| Dumont forceps | DMT | 300413 | |
| PowerLab/8SP | ADInstruments | ML785 | |
| Software | ADInstruments | LabChart 5 | |
| NaCl | SigmaAldrich | S5886 | |
| KCl | SigmaAldrich | P5405 | |
| CaCl2 | SigmaAldrich | C4901 | |
| MgCl2·6H2O | SigmaAldrich | M2393 | |
| D-Glucose | SigmaAldrich | G6152 | |
| HEPES | Sangon Biotech | A100511-0250 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045 | |
| DMSO | SigmaAldrich | D2650 |
References
- Bevan, J. A., Osher, J. V. A direct method for recording tension changes in the wall of small blood vessels in vitro. Agents and Actions. 2 (5), 257-260 (1972).
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260 (5552), 617-619 (1976).
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile Properties of Small Arterial Resistance Vessels in Spontaneously Hypertensive and Normotensive Rats. Circulation Research. 41 (1), 19-26 (1977).
- Mulvany, M. J., Nyborg, N. An increased calcium sensitivity of mesenteric resistance vessels in young and adult spontaneously hypertensive rats. British Journal of Pharmacology. 71 (2), 585-596 (1980).
- Mulvany, M. J. Procedures for investigation of small vessels using small vessel myograph. , Danish Myo Technology. Denmark. (2004).
- Halpern, W., Mulvany, M. J., Warshaw, D. M. Mechanical properties of smooth muscle cells in the walls of arterial resistance vessels. The Journal of Physiology. 275, 88-101 (1978).
- Michael, S. K., et al. High blood pressure arising from a defect in vascular function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (18), 6702-6707 (2008).
- Bridges, L. E., Williams, C. L., Pointer, M. A., Awumey, E. M. Mesenteric artery contraction and relaxation studies using automated wire myography. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- del Campo, L., Ferrer, M. Wire Myography to Study Vascular Tone and Vascular Structure of Isolated Mouse Arteries. , Springer. New York. (2015).
- Fisher, S. A. Vascular smooth muscle phenotypic diversity and function. Physiological Genomics. 42 (3), 169-187 (2010).
- Crowley, S. D., et al. Distinct roles for the kidney and systemic tissues in blood pressure regulation by the renin-angiotensin system. The Journal of Clinical Investigation. 115 (4), 1092-1099 (2005).
- Qiao, Y. N., et al. Myosin phosphatase target subunit 1 (MYPT1) regulates the contraction and relaxation of vascular smooth muscle and maintains blood pressure. The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22512-22523 (2014).
- He, W. Q., et al. Role of myosin light chain kinase in regulation of basal blood pressure and maintenance of salt-induced hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (2), H584-H591 (2011).
- Yang, G. M., et al. Isolation and identification of a tribenzylisoquinoline alkaloid from Nelumbo nucifera Gaertn, a novel potential smooth muscle relaxant. Fitoterapia. 124, 58-65 (2018).
- Slezák, P., Waczulíková, I., Bališ, P., Púzserová, A. Accurate Normalization Factor for Wire Myography of Rat Femoral Artery. Physiological Research. 59 (6), 1033-1036 (2010).
- Kearney, P. M., et al. Global burden of hypertension: analysis of worldwide data. The Lancet. 365 (9455), 217-223 (2005).
- Good, N. E., et al. Hydrogen Ion Buffers for Biological Research. Biochemistry. 5 (2), 467-477 (1966).
