Summary
采用线 myograph 技术对血管平滑肌功能和筛查新药进行了研究。我们报告一个详细的协议, 以测量的等距收缩性的小鼠肠系膜动脉和筛选新的松弛剂血管平滑肌。
Abstract
线 myograph 技术是用来评估血管平滑肌收缩性的反应, 对退极化, GPCR 激动剂/抑制剂和药物.它广泛应用于血管平滑肌的生理功能、高血压等血管疾病的发病机制, 以及平滑肌松驰药物的发展。老鼠是一种广泛使用的模型动物, 有大量的疾病模型和基因改良菌株。本方法对小鼠肠系膜动脉的等距收缩进行了详细的测定。1.4 毫米的小鼠肠系膜血管阻力动脉被隔离, 并安装在一个 myograph 室通过通过两个钢丝通过其流明。在平衡和规范化步骤之后, 在收缩试验前两次用高钾+溶液增强容器段。作为该方法在药物开发中应用的一个例子, 我们测量了一种新的天然物质 neoliensinine 的松弛效应, 从中草药中分离出来的, 莲子的胚胎 (莲莲莲藕). 小鼠肠系膜上动脉。在 myograph 室安装的容器段受到高 K+溶液的刺激。当力张力达到稳定的持续阶段时, neoliensinine 的累积剂量增加到腔室。我们发现 neoliensinine 对平滑肌收缩有剂量依赖性的松弛作用, 因此表明它对高血压有潜在的活性。此外, 由于在高钾溶液的安装和维持收缩力的作用下, 血管段至少能存活4小时 , 我们建议 myograph 系统可用于药物筛选的耗时过程。
Introduction
这里使用的小容器 myograph 系统是用来测量直径从100到400µm 的小电阻容器的等距收缩. 隔离的小容器 (大约2毫米长) 被两个 40-µm 直径导线插入并且然后按顺序安装在千分尺端和换能器侧颚上。这 myograph 技术在1972年第一次被建议了, 然后主要由 Mulvany 和他的同事开发了2,3,4,5,6。它现在是一个成熟的技术与稳定的设备, 容易的性能和标准规范化程序7,8,9。我们利用这种方法对小鼠肠系膜动脉的测量进行了一些修改。
血管平滑肌线几乎所有血管的墙壁。它们的基本功能是通过收缩来产生力量来响应各种刺激。血管平滑肌的正常收缩力对血压调节和营养补充10至关重要。血压异常调节导致多种疾病, 包括高血压、心力衰竭和缺血.一些研究表明, 异常的血压总是与功能失调的血管平滑肌收缩7,11,12,13。myograph 方法允许研究各种刺激, 包括血管收缩剂, 抑制剂和药物诱发的小鼠血管的等距收缩力。成功的收缩测量将有助于我们了解血压维持机制和血管平滑肌相关疾病的发病机理, 并探讨新的治疗方法。
许多中草药已广泛用于血管疾病的临床治疗;然而, 它们的有效成分通常仍不得而知。因此, 有效成分的分离和鉴定对新药的开发具有重要意义。多线 myograph 技术为筛选草药中的活性成分提供了一种简单的方法。我们报告了几项研究使用小血管 myograph 系统来调查小鼠肠系膜动脉收缩和确定的天然化合物与抗高血压活动12,13,14。在这里, 我们描述了 myograph 方法的详细协议, 并评估了 neoliensinine 从莲子的胚胎中分离出的松弛效应 (莲莲藕)。14。
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Protocol
动物操作由南京大学动物研究中心的动物保育和使用委员会 (IACUC) 批准。
1. 解决方案准备
- 用137.0 毫米氯化钠, 2.7 毫米氯化钾, 1.8 毫米 CaCl2, 1 毫米氯化镁2∙6H2O, 5.6 毫米 d-葡萄糖, 10 毫米 HEPES, pH 7.3-7.4, 制备 HEPES Tyrode 溶液 (h-T)。
- 用140.6 毫米氯化钠, 2.7 毫米氯化钾, 1 毫米氯化镁2∙6H2O, 5.6 毫米 d-葡萄糖, 10 毫米 HEPES, pH 7.3-7.4, 制备 HEPES-Tyrode 溶液, 不含钙 (Ca2 +自由 H T)。
- 用15.7 毫米氯化钠, 124.0 毫米氯化钾, 1.8 毫米 CaCl2, 1 毫米氯化镁2∙6H2O, 5.6 毫米 d-葡萄糖, 10 毫米 HEPES, pH 7.3-7.4, 制备 HEPES-Tyrode 溶液, 使用124毫米氯化钾 (高 K+)。
2. 实验准备
- 使用37摄氏度水浴预热 H T 和高钾+溶液。
- 打开 myograph 系统、数据采集硬件和计算机。
- 用5毫升的 H T 溶液将每个 myograph 腔仔细地填满。
- 分别用20毫升4°c 的 h t 和 Ca2 +免费的 h t 溶液填充两个培养皿, 并储存在冰上。
- 用20毫升的 H T 溶液填充10厘米涂层培养皿, 并在室温下保持。
3. 小鼠肠系膜动脉夹层
- 弄死8-12 周大的 C57BL/6J 雌或雄性小鼠颈椎脱位。把鼠标钉在腹部朝上。
- 用70% 乙醇滋润腹部。然后, 沿腹中线从腹股沟切开皮肤与剪刀, 并使切口从第一切口开始向下到两侧的腿。将皮肤拉回两侧;做类似的切口打开腹膜。
- 使用剪刀, 切断食道, 结肠和其他结缔组织, 完全隔离胃肠道与喂养血管从身体。
- 用镊子, 将隔离段移入含有在步骤2.4 中制备的冷 H t 的盘中, 并在 h t 溶液中轻轻冲洗组织几次以冲洗血液。
- 将隔离段转移到2.5 步制备的涂层培养皿中, 并在室温下进行肠系膜动脉夹层。
- 顺时针方向平滑胃、空肠、回肠和盲肠, 分别将胃和盲肠固定在左右侧。
- 伸展肠系膜血管床, 用针固定肠道以暴露肠系膜动脉的解剖。
注意: 在这些条件下, 动脉在血管的顶端。 - 打开立体显微镜的透射光源, 在显微镜下解剖动脉。确保整个组织沉浸在溶液中。
- 用镊子钳住动脉周围的脂肪组织, 用解剖剪刀切断所有结缔组织, 隔离动脉。避免损伤动脉。
4. 动脉安装
- 将肠系膜动脉树转移并浸入冷钙2 +游离的 H T 溶液 (在步骤2.4 中制备), 方法是用镊子夹紧多余的动脉。
- 切除肠系膜拱廊肠道壁近1.4 毫米的动脉部分, 并使用两个镊子仔细打开这段动脉的两侧。
- 准备两段不锈钢丝长度为2.5 厘米, 并将它们放入同一盘中。
- 用镊子轻轻夹住动脉的一端, 在另一钳的帮助下, 小心地将两根导线插入动脉的腔内。确保导线保持直, 不要接触内皮。
- 使用两个钳, 同时夹紧螺纹容器外的两根钢丝, 并小心地将容器从培养皿中转移到以前用 h-T 溶液填充的 myograph 室 (步骤 2.3)。
- 把下巴拧紧, 使空间安装。用两个钳夹住两根插入导线之一的两侧, 并将该容器置于颚间隙 (图 1A)。
- 将夹紧导线的两侧缠绕在与千分尺连接的颚螺钉上 (图 1B)。
- 用顺时针方向拧紧固定左手螺钉。用右手钳伸直导线, 然后顺时针旋转 (图 1C) 固定右手螺钉。确保该容器始终在颚间隙内, 但请勿触摸下颚以避免损坏。
- 使用千分尺关闭两个颚 (图 1D)。确保两个下巴足够近, 但他们不接触对方, 不固定的电线是在电线的顶部。
- 使用右手钳, 小心地折叠在下巴的角落连接到力传感器的拧开的电线, 并按顺时针方向绕右螺钉 (图 1E)。然后, 固定螺丝。在导线的左侧重复此步骤, 并固定左侧螺钉 (图 1F)。
- 仔细旋转千分尺 (图 1G), 将颚稍微分开。避免伸展船只。使用镊子将在千分尺侧的导线移动到换能器一侧导线的水平面上。小心地旋转千分尺, 使两只颚之间的缝隙能容纳两条线。
- 重复步骤4.2 至 4.11, 将动脉安装到其他房间。将所有房间连接到设备, 盖住房间, 连接100% 氧气供应和一个温度探头, 并开始加热到37摄氏度。打开绘图软件, 然后按 "图表视图" 窗口上的 "开始" 按钮开始录制。
- 平衡约20分钟。
5. 正常化
注意: 为了规范实验条件, 获得可靠的血管生理响应, 规范化的程序是必要的15。根据该容器的主动力与内圆周之间的关系, myograph 系统有一个标准的规范化程序来评估装入的容器5、8的内部周长 (IC), 9。简而言之, 计算 IC (µm), 读取千分尺和输入值作为 X 值和传感器输出力,即静止壁张力 (锰/毫米), 作为 Y 值。该程序将返回一个拟合曲线 (X, Y) 和计算的 IC 对应的壁压力 100 mmHg (IC100)。当主动响应最大时, 该容器被设置为规范化的内部圆周 (IC1)。
- 对设备上的所有通道设置强制为零, 并平衡另一个1-2 分钟。
- 从 "DMT" 菜单中选择规范化设置, 并按如下方式设置参数:
目镜校准 (毫米/div): 0.36;目标压力 (人民军): 13.3;ic1/ic100: 0.9;在线平均时间 (秒): 2;延迟时间 (秒):60。单击"确定" 按钮关闭 " DMT 规范化设置" 窗口。 - 从dmt 菜单中选择感兴趣的通道, 打开相应通道的 dmt 规范化窗口。在窗口中输入常量值, 如下所示: 组织终点 a1: 0.1;组织终点 a2: 4;钢丝直径 (µm):40。该窗口将计算出的容器长度显示为1.40 毫米。
- 阅读适当的组织室的千分尺。在 "千分尺" 阅读框中输入值, 然后单击 "添加点" 按钮。此值是 X (X0) 的初始值。在六十年代延迟时间之后, 窗口显示与此千分尺值对应的力和有效压力 (ERTP)。同时,千分尺读数盒变得活跃。
- 通过在逆时针方向转动千分尺来拉伸容器正常化。在 "千分尺" 阅读框中输入千分尺值, 然后单击 "添加点" 按钮。等待六十年代的延迟时间。
- 重复步骤 5.5, 继续拉伸该容器, 并添加千分尺值, 直到窗口显示 "千分尺 X1" 的值, 这是将容器拉伸到其 IC1所需的计算千分尺设置。
- 将千分尺设置为 X1值。
注: 正常化的张力通常为1-2 锰。
6. 动脉收缩记录
注意: 在步骤2.1 中编写了所有解决方案, 包括本节中使用的 h-T 和高 K+解决方案。
- 规范化后, 将容器平衡在腔内15-20 分钟。
注意: 这些不需要在这个步骤中更改解决方案。 - 用高 K+溶液对容器进行两次挑战。
- 对该容器进行挑战, 用5毫升高钾溶液取代 h-t 溶液,以诱导收缩10分钟, 接着用5毫升的 h t 溶液洗涤3-4 次。
注: 典型收缩有最大力超过3锰和恒定持续力大约2.5 锰12。如果第一个挑战产生的最大力低于2.5 锰或持续力下降的时间或第二个挑战产生比第一次剂量更低的力量, 该船舶被丢弃, 不会被用于进一步调查。
- 对该容器进行挑战, 用5毫升高钾溶液取代 h-t 溶液,以诱导收缩10分钟, 接着用5毫升的 h t 溶液洗涤3-4 次。
- 用5毫升的高钾溶液来挑战容器 , 以诱导收缩。5分钟后, 将 neoliensinine 库存溶液的0.5 µL (10 毫米在亚砜)14放入室内, 以使容器在最后浓度为1µM neoliensinine 时松弛。
- 当力稳定 (这通常需要几分钟), 添加另外0.5 µL 的 neoliensinine 库存溶液进入会议厅, 以增加浓度为2µM. 每次添加1µL 的库存解决方案, 增加浓度为 4, 6, 8 和10µM 产生 t他的剂量反应曲线。
注意: 药品的库存和工作浓度各不相同。
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Representative Results
我们用多线 myograph 系统测量了小鼠肠系膜动脉的等距收缩力, 并对莲子胚 neoliensinine 纯化的松驰效应进行了评估 (莲莲藕)。14. 小鼠肠系膜抗性动脉被隔离, 清除结缔组织, 并切割成1.4 毫米段。动脉段是由两根钢丝插入在 Ca2 +免费的 H T 溶液中的培养皿, 然后该段安装在两个颌骨的 myograph 室 (图 2A)。安装后, 两根电线被调整为平行, 关闭, 但不接触对方 (图 2B)。在力测量前, 用高 K+溶液对容器段进行规范化和增强两次, 以稳定容器。在规范化的过程中, 该船只被拉伸数次, 直到达到 IC 100 的价值,每个拉伸周期包括强劲的收缩, 快速松弛和部队维护在六十年代 (图 3)。高钾溶液诱导的血管平滑肌收缩通常表现为两个阶段, 一个健壮的阶段和一个持续的阶段 (图 3)。只有当高钾诱发收缩出现正常且重现性时, 才可将该血管段用于进一步实验。neoliensinine 的典型测量在图 4中表示。当高 K+引起的力张力达到一个持续阶段时, 我们通过腔盖中的孔增加了 neoliensinine (1、2、4、6、8和10µM) 的累积剂量。随着剂量的增加, 力以剂量依赖性的方式减少。结果表明, neoliensinine 是一种血管平滑肌松弛物质, 可能作为候选抗高血压药物14。
图 1: 动脉安装程序示意图.蓝线代表电线, 红色矩形代表动脉。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 在 myograph 室安装的小鼠肠系膜动脉段.(a)用两根钢丝在两颚上安装小鼠肠系膜动脉段。白色的酒吧 = 2 毫米(B)在面板 (A) 中的小鼠肠系膜动脉段的显微图像。黑酒吧 = 0.5 毫米.请点击这里查看这个数字的大版本.
图 3: 代表原始追查显示规范化程序和增强的高 K+解决方案。第二次高 K+刺激后, 可以进行常规实验。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 由高钾溶液收缩的小鼠肠系膜动脉的代表追踪, 然后通过增加累计剂量的 neoliensinine 来放松.随着剂量的增加, 力减少的剂量依赖性的方式,请点击这里查看一个更大的版本这个数字.
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Discussion
高血压是一个广泛的公共卫生挑战, 由于其严重并发症, 包括心血管和肾脏疾病16。了解高血压发病机制, 探索更多抗高血压药物已成为该领域的一项紧迫任务。血压是由循环的外周阻力产生和维持的。根据泊肃叶定律, 相对较小的动脉产生很大比例的循环阻力, 并作为主导的血压3,10的生产者。因此, 测量小阻力动脉而不是大动脉更适合于血压的研究。线 myograph 技术是研究小阻力动脉生理功能和血管疾病发病机制的最佳方法之一。
小血管线 myograph 系统已在其他报告中得到很好的记录, 用于测量大鼠肠系膜动脉8和小鼠动脉 (如主动脉9) 的收缩。利用遗传操作、多种疾病模型和药物筛选模型, 鼠标已成为许多领域广泛使用的模型动物。因此, 在这里, 我们提供了一个改进的协议, 该方法测量小鼠肠系膜动脉收缩。在本报告中, 我们成功地测量了小鼠肠系膜动脉的收缩力和基本缓冲和安装步骤的修改。许多研究在体外 vasocontractility 测量使用了包含 NaHCO3的解决方案, 如克雷布斯解决方案, 以模拟生理盐溶液。然而, 这种缓冲器需要2的调节 pH 值在整个测量, 导致生产的碳酸钙3。我们选择了 h-T 溶液作为缓冲系统, 发现它工作良好。由于温度对 HEPES 的 pK值影响不大, 因此溶液的 pH 值在室温下方便调节, 在37°c 17时不变。此外, 我们使用 ca2 +免费的 H T 解决方案时, 引导导线通过血管腔, 以防止船舶收缩由 Ca2 +。此协议中的另一项修改是安装过程。一些报告8,9和设备手册5建议在修复下颌第一根导线后, 引导第二根导线。我们发现, 当两根导线通过容器管腔在安装容器之前被引导时, 它的效果更好, 因为这种方法可能会由于有限的腔室空间而减少传感器可能造成的损坏。
尽管这种方法具有很高的重现性, 但我们还是要注意一些关键步骤。最重要的是避免损坏的船只由镊子和剪刀。在血管解剖过程中, 操作者应在拉伸脂肪组织时轻轻地使用镊子, 并在切割结缔组织时小心使用剪刀。此外, 应轻轻夹紧血管, 在引导导线时应避免对内皮的损伤, 因为内皮损伤的血管会引起异常反应,例如 g。,损伤后的血管在乙酰胆碱刺激后显示出明显的力张力, 而正常血管显示松弛效应。这种现象的解释是, 受损的内皮不能正确地产生一氧化氮。注意, 在涉及内皮相关收缩的实验中, 应在力测量前检测内皮状态。此外, 我们也应该小心地安装在颚上的船只, 因为传感器是容易损坏, 如果使用硬力。最后, 在执行规范化时, 我们通常不会在千分尺上使用常量递增值。增量的价值是30或20µm 最初和10µm 在有效的压力以后到达11-12 帕。该方法可减少规范化时间, 并可防止过度, 从而减轻船舶损坏。
虽然我们的研究集中在小鼠肠系膜动脉, 这种方法也可以用于主动脉, 支气管, 和其他小血管, 包括肾, 脑和肺动脉。该系统包括四通道, 同时便于测量四平行采样。此外, 整个肠系膜血管床可以提供至少四个动脉段, 因此很容易设计不同的实验组。根据我们的经验, 每个动脉段存活至少4小时, 并保持对高钾+解决方案至少6重复的良好反应。这一属性对于测量多种候选药物的几种添加效果非常有用。然而, 电线 myograph 系统也有局限性。前体线 myograph 实验仅能测量等距 vasocontractility, 但通常应与其它测量相结合, 进行复杂的血管分析。
总之, 我们描述了一种用多线 myograph 系统测量小鼠肠系膜动脉中的异构收缩力的方法。该方法可用于评价血管平滑肌的功能和松弛剂平滑肌的筛查。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢魏琪博士 (苏州大学, 苏州市, 中国) 和闫宁桥 (陕西师范大学, 西安, 中国) 的技术援助。这项工作得到了中国国家自然科学基金 (赠款31272311、81373295和 81473420) 的支持, 并由江苏省高等教育机构优先学术项目开发资助的项目 (批准号:ysxk-2016)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi wire myograph system | DMT | 610-M | |
| Stainless steel wire | DMT | 400447 | |
| Geuder dissection scissor | DMT | 400431 | |
| Dumont forceps | DMT | 300413 | |
| PowerLab/8SP | ADInstruments | ML785 | |
| Software | ADInstruments | LabChart 5 | |
| NaCl | SigmaAldrich | S5886 | |
| KCl | SigmaAldrich | P5405 | |
| CaCl2 | SigmaAldrich | C4901 | |
| MgCl2·6H2O | SigmaAldrich | M2393 | |
| D-Glucose | SigmaAldrich | G6152 | |
| HEPES | Sangon Biotech | A100511-0250 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045 | |
| DMSO | SigmaAldrich | D2650 |
References
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