Summary
La técnica del miógrafo de alambre se utiliza para investigar las funciones del músculo liso vascular y nuevos fármacos de la pantalla. Se presenta un protocolo detallado para medir la contractilidad isométrica de la arteria mesentérica de ratón y para la detección de nuevos relajantes del músculo liso vascular.
Abstract
La técnica de laringe de alambre se utiliza para evaluar la contractilidad de los músculos lisos vasculares en respuesta a la despolarización, agonistas/inhibidores de GPCR y drogas. Es ampliamente utilizado en muchos estudios sobre las funciones fisiológicas del músculo liso vascular, la patogenesia de enfermedades vasculares como la hipertensión y el desarrollo de drogas relajantes del músculo liso. El ratón es un animal modelo ampliamente utilizado con un gran número de modelos de la enfermedad y las cepas genéticamente modificadas. Se introdujo este método para medir la contracción isométrica de arteria mesentérica ratón en detalle. Un segmento de 1,4 mm de ratón resistencia mesentérica arteria fue aislado y montado en una cámara de laringe por pasar dos cables de acero a través de su luz. Después de conseguir el equilibrio y normalización de pasos, el segmento de buques era potenciado por una solución high-K+ dos veces antes del ensayo de contracción. Como ejemplo de la aplicación de este método en el desarrollo de fármacos, medimos el efecto relajante de una nueva sustancia natural, neoliensinine, aislado de una hierba China, embriones de la semilla de loto (Nelumbo nucifera Gaertn.) en el ratón mesentérico arterias. Los segmentos de buque montados en la cámara de la laringe fueron estimulados con una solución de alto-K+ . Cuando la tensión de fuerza alcanza una fase sostenida estable, dosis acumulativas de neoliensinine fueron agregados a la cámara. Se encontró que neoliensinine tenía un efecto relajante del dependiente de la dosis en la contracción del músculo liso, así sugiriendo que tiene actividad potencial contra la hipertensión. Además, que el segmento vascular puede sobrevivir al menos 4 horas después del montaje y mantener la contractilidad inducida por la solución high-K+ para muchas veces, nos sugieren que el sistema del miógrafo de alambre puede utilizarse para el proceso desperdiciador de tiempo de la detección de drogas.
Introduction
El sistema de vasos miógrafo utilizado aquí fue para medir la contracción isométrica de los vasos de resistencia pequeña con diámetros interiores que van desde 100 hasta 400 μm. aislados los vasos pequeños (de unos 2 mm) se inserta por dos cables de 40 μm de diámetro y estaban entonces montado en las mordazas del micrómetro y transductor secuencialmente. Esta técnica de laringe fue primero sugerida en 19721 y entonces desarrollada principalmente por Mulvany y sus colegas2,3,4,5,6. Es una técnica madura con equipamiento, fácil funcionamiento y un procedimiento de normalización estándar7,8,9. Utilizamos este método con algunas modificaciones para la medición en la arteria mesentérica de ratón.
Músculo liso vascular recubre las paredes de casi todos los vasos sanguíneos. Su función fundamental es generar fuerzas a través de la contracción en respuesta a diversos estímulos. La contractilidad normal del músculo liso vascular es esencial para la regulación de la presión arterial y nutrición suplemento10. Regulación anormal de la presión arterial resulta en una variedad de enfermedades, como hipertensión, insuficiencia cardíaca y la isquemia. Varios estudios han sugerido que la presión de sangre anormal siempre es asociada con el músculo liso vascular disfuncional contractilidad7,11,12,13. El método de laringe permite investigación de contractilidad isométrica de los vasos del ratón inducida por varios estímulos, incluyendo drogas, inhibidores y vasoconstrictores. Medidas exitosas de contracción nos ayudará a comprender los mecanismos de mantenimiento de la hipertensión y la patogenesia de enfermedades asociadas de músculo liso vasculares y explorar nuevos enfoques terapéuticos.
Muchas hierbas chinas se han utilizado ampliamente para el tratamiento clínico de enfermedades vasculares; sin embargo, sus ingredientes eficaces generalmente siguen siendo desconocidos. Así, el aislamiento y la identificación de los componentes eficaces es muy importante para el desarrollo de nuevos fármacos. Tecnología multifilar miógrafo ofrece un enfoque simple para la detección de componentes activos en hierbas. Hemos divulgado varios estudios utilizando el sistema de laringe vasos para investigar la contracción de la arteria mesentérica de ratón e identificar compuestos naturales con actividad anti-hipertensión12,13,14. Aquí, describimos los detalles del protocolo para el método de la laringe y evaluar el efecto relajante de neoliensinine aislado de embriones de semilla de loto (Nelumbo nucifera Gaertn.) 14.
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Protocol
Animal manipulaciones fueron aprobadas por el cuidado de Animal institucional y Comité uso (IACUC) de la Universidad Modelo Animal Research centro de Nankín.
1. preparación de la solución
- Prepare solución de Tyrode HEPES (H-T) con 137,0 mM NaCl, KCl de 2,7 mM, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2∙6H2O, 5,6 mM D-glucosa y 10 mM HEPES, pH 7.3-7.4.
- Preparar la solución de Tyrode HEPES sin calcio (Ca2 +-libre H-T) utilizando 140,6 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2∙6H2O, 5,6 mM D-glucosa y 10 mM HEPES, pH 7.3-7.4.
- Prepare solución de Tyrode HEPES con 124 mM KCl (alto K+) usando 15,7 mM NaCl, KCl, de 124,0 mM 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2∙6H2O 5,6 mM D-glucosa y 10 mM HEPES, pH 7.3-7.4.
2. preparación del experimento
- PRECALIENTA el High-K+ soluciones usando un baño de agua de 37 ° C y H-T.
- Encienda el sistema miógrafo, hardware de adquisición de datos y la computadora.
- Cuidadosamente llene todas las cámaras de laringe con 5 mL de solución de H-T cada uno.
- Llenar dos placas de Petri con 20 mL de 4 ° C H-T y Ca2 +-gratis soluciones H-T, respectivamente y almacenar en hielo.
- Llenar un plato de Petri cubierto de 10 cm con 20 mL de solución de H-T y mantener a temperatura ambiente.
3. ratón disección de la arteria mesentérica
- Eutanasia a un ratón de C57BL/6J 8-12 semanas de edad hombre o mujer por dislocación cervical. Prender el ratón hacia abajo con el abdomen hacia arriba.
- Humedezca el abdomen con etanol al 70%. A continuación, cortar la piel con tijeras a lo largo de la línea media ventral desde la ingle y hacer incisiones desde el inicio de la primera incisión hacia abajo a las piernas a ambos lados. Tire de la piel en ambos lados; hacer incisiones similares para abrir el peritoneo.
- Con unas tijeras, cortar el esófago, el colon y otros tejidos conectivos para aislar completamente el tracto gastrointestinal con la alimentación de vasculatura del cuerpo.
- Con pinzas, mover el segmento aislado en el recipiente que contiene el frío H-T preparado en el paso 2.4 y enjuagar suavemente el tejido en solución H-T varias veces para lavar la sangre.
- Transferir el segmento aislado en la caja Petri cubierto preparado en el paso 2.5 y realizar la disección de la arteria mesentérica a temperatura ambiente.
- Alisar el estómago, yeyuno, íleon y ciego en sentido horario, y fijar el estómago y el intestino ciego en el lado izquierdo y derecho, respectivamente.
- Estirar la cama de la vasculatura mesentérica y fijar el intestino con pernos para exponer las arterias mesentéricas disecadas.
Nota: En estas condiciones, las arterias están encima de las venas. - Encienda la fuente de transmisión de luz de un microscopio estereoscópico y disecar las arterias bajo el microscopio. Asegúrese de que el tejido entero se sumerge en la solución.
- Sujetar los tejidos adiposo alrededor de las arterias con pinzas y aislar las arterias por todos los tejidos conectivos de corte con tijeras de disección. Evitar lesionar las arterias.
4. arterial de montaje
- Transferencia y sumerja el árbol de la arteria mesentérica en el frío Ca2 +-libre H-T solución (preparada en el paso 2.4) por las arterias exceso de sujeción con pinzas.
- Cortar una porción de 1,4 mm de la arteria proximal a la pared intestinal de un arcade mesentérico y utilizar dos pinzas para abrir ambos lados de este segmento de la arteria con cuidado.
- Prepare dos segmentos de alambre de acero inoxidable 2,5 cm de longitud y colocarlos en el mismo plato.
- Suavemente Sujete un extremo de la arteria con unas pinzas y cuidadosamente Inserte dos cables en el lumen de la arteria uno por uno con ayuda de pinzas para otros. Asegúrese que los cables se mantengan rectos y no tocan el endotelio.
- Utilizando dos pinzas, sujete los dos cables de acero fuera de la nave roscada simultáneamente y transferir cuidadosamente el vaso de la placa de Petri a una cámara de laringe previamente llenada con solución de H-T (paso 2.3).
- Atornille las mordazas aparte para hacer espacio para el montaje. Sujete ambos lados de uno de los dos cables insertados utilizando dos pinzas y colocar el vaso en el hueco de la mandíbula (figura 1A).
- Envolver ambos lados del alambre afianzado con abrazadera alrededor de los tornillos de la mordaza conectado al micrómetro (figura 1B).
- Fijar el tornillo izquierdo girando hacia la derecha. Enderezar el alambre con unas pinzas de la derechas, y luego fijar el tornillo de la derecho girando hacia la derecha (figura 1). Asegúrese de que el buque está siempre dentro de la brecha de la mandíbula, pero no toque la mandíbula para evitar daños.
- Cerca de las dos mordazas utilizando el micrómetro (figura 1). Asegúrese de que las dos mandíbulas están lo suficientemente cercanas pero que no toquen entre sí y que el cable no fijado en la parte superior el alambre fijo.
- Utilizando la pinza derecha, cuidadosamente doblar el alambre desatornillarse en la esquina de la mandíbula conectada a transductor de la fuerza y enróllela en sentido horario alrededor del tornillo del lado derecho (Figura 1E). A continuación, fijar el tornillo. Repita este paso en el lado izquierdo del hilo y fijar el tornillo del lado izquierdo (Figura 1F).
- Mueva las mordazas ligeramente separadas girando con cuidado el micrómetro (figura 1). Evitar estiramiento del buque. Utilice pinzas para mover el cable en el lado del micrómetro al plano horizontal del alambre en el lado del transductor. Gire con cuidado el micrómetro para que la brecha entre las dos mordazas sólo puede acomodar los dos cables.
- Repita los pasos 4.2 – 4.11 para montar las arterias en las otras cámaras. Conectar todas las cámaras a la cubierta de las cámaras, conecte el suministro de oxígeno al 100% y una sonda de temperatura y comienza a calentar a 37 ° C. Abra el software de gráficos y pulse el botón iniciar en la ventana de la Vista de tabla para empezar a grabar.
- Equilibre durante unos 20 minutos.
5. normalización
Nota: Con el fin de estandarizar las condiciones experimentales y obtener confiable respuesta fisiológica de los vasos, un procedimiento de normalización es necesario15. Según la relación entre la fuerza activa y la circunferencia interna de la nave, el sistema de laringe de alambre tiene un programa de normalización estándar para evaluar la circunferencia interna (IC) del recipiente montado5,8, 9. Brevemente, calcular IC (μm), leer el micrómetro y el valor de entrada como el valor de X y el transductor de fuerza de salida, es decir, descansar de la tensión de la pared (mN/m), como el valor Y. El programa volver una curva integral de (X, Y) y calcular el CI correspondiente a una presión transmural de 100 mmHg (IC100). El buque se ajusta a la circunferencia interna normalizada (IC1) cuando es máxima la capacidad de respuesta activa.
- Fuerzas a cero para todos los canales en el dispositivo y equilibre durante otro 1-2 min.
- Seleccione configuración de la normalización de la "carta DMTy configurar los parámetros como sigue:
Calibración del ocular (mm/div): 0,36; Objetivo de presión (kPa): 13,3; IC1IC100: 0,9; En línea con un promedio de tiempo (segundos): 2; Retardo de tiempo (segundos): 60. Haga clic en el botón OK para cerrar la ventana de Configuración de la normalización de DMT . - Seleccione el canal de interés en el menú DMT para abrir una ventana de normalización de DMT para el canal correspondiente. Entrar los valores constantes en la ventana siguiente: tejidos terminales a1: 0,1; Tejido puntos extremos a2: 4; Diámetro de alambre (μm): 40. La ventana muestra la longitud calculada del vaso como 1,40 m.
- Leer el micrómetro de la cámara de tejido apropiado. Introduzca el valor en el cuadro de lectura del micrómetro y haz clic en el botón Añadir punto . Este valor es el valor inicial de X (X0). Después de un tiempo de retraso 60 s, la ventana muestra la fuerza y la presión efectiva (ERTP) correspondiente a este valor de micrómetro. Al mismo tiempo, el cuadro de lectura del micrómetro se convierte en activo.
- Estirar el vaso se normalizó al girar el micrómetro en agujas. Introduzca el valor del micrómetro en el cuadro de lectura del micrómetro y haz clic en el botón Añadir punto . Esperar un retraso de 60 s otra vez.
- Repita el paso 5.5, continuar estirar el vaso y agregar valores de micrómetro hasta que la ventana muestra el valor de "X micrómetro1", que es el ajuste del micrómetro calculado requerido para estirar el vaso a su IC1.
- Ajustar el micrómetro x valor de1 .
Nota: La tensión normalizada es generalmente 1-2 mN.
6. arteria contracción grabación
Nota: Todas las soluciones, incluyendo H-T y High-K+ solución utilizada en esta sección, se prepararon en el paso 2.1.
- Después de la normalización, equilibrar el buque en la cámara durante 15-20 min.
Nota: Estos es necesario cambiar la solución en este paso. - Desafío dos veces el recipiente con la solución High-K+ .
- Para desafiar a la nave, reemplazar la solución H-T con 5 mL de solución de alto-K+ para inducir la contracción durante 10 min, seguido de lavado con 5 mL de solución de H-T 3 - 4 veces.
Nota: Contracción típica tiene una fuerza máxima durante 3 minutos y una fuerza sostenida constante alrededor de 2,5 mN12. Si el primer desafío genera una fuerza máxima por debajo de 2,5 mN o la fuerza sostenida disminuye con el tiempo, el segundo desafío genera una fuerza mucho más baja que la dosis de la primera vez, la nave se descarta y no se utilizará para la posterior investigación.
- Para desafiar a la nave, reemplazar la solución H-T con 5 mL de solución de alto-K+ para inducir la contracción durante 10 min, seguido de lavado con 5 mL de solución de H-T 3 - 4 veces.
- Desafiar la nave con 5 mL de solución de alto-K+ para inducir la contracción. Después de 5 min, Añadir 0,5 μl de la solución madre (10 mM en DMSO) neoliensinine del14 en la sala para descansar la embarcación a una concentración final de 1 μm neoliensinine.
- Cuando la fuerza es estable (generalmente esto tarda varios minutos), añadir otro 0,5 μl de la solución madre neoliensinine en la cámara para aumentar la concentración a 2 μm. Añadir 1 μl de la solución cada vez para aumentar la concentración de a 4, 6, 8 y 10 μm para generar t curva de dosis-respuesta.
Nota: Los valores y concentraciones de trabajo varían entre medicamentos.
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Representative Results
Medimos la contractilidad isométrica de arteria mesentérica de ratón utilizando un sistema de alambres múltiples miógrafo y evaluó el efecto relajante de neoliensinine purificada a partir de embriones de semilla de loto (Nelumbo nucifera Gaertn.) 14. la arteria mesentérica resistencia de ratón fue aislada, limpiar de tejidos conectivos y cortar en segmentos 1,4 mm. El segmento de la arteria fue insertado por dos alambres de acero en Ca2 +-sin solución H-T en una placa Petri, y luego se montó el segmento en dos mandíbulas de una cámara de la laringe (figura 2A). Después de montar el segmento, los dos cables se ajustaron para ser paralelo, cerca pero sin tocar a otro (figura 2B). Antes de la medida de fuerza, el segmento de buques fue normalizado y potencia dos veces High-K+ solución para estabilizar la nave. Durante el procedimiento de normalización, el buque fue estirado varias veces hasta alcanzar el valor de IC100, y cada ciclo estiramiento incluye una fuerte contracción, relajación rápida y un mantenimiento de la fuerza en 60 s (figura 3). La contracción del músculo liso vascular inducido por alta-K+ solución generalmente mostró dos fases, una fase sólida y una fase sostenida (figura 3). El segmento vascular puede ser utilizado para otros sólo si de experimentos High-K+-contracción evocada aparece normal y reproducible. Una típica medida con neoliensinine está representada en la figura 4. Cuando la tensión de la fuerza inducida por la alta-K+ llegado a una fase de sostenido, hemos añadido dosis acumulativas de neoliensinine (1, 2, 4, 6, 8 y 10 μm) a través de los agujeros en la tapa. A medida que la dosis aumentaron, la fuerza reducida en una manera dose-dependent. El resultado indicó que neoliensinine es una sustancia relajante del músculo liso vascular que potencialmente actúa como una droga anti-hipertensión candidato del14.
Figura 1: esquema de procedimiento de montaje arterial. Las líneas azules representan los cables, y el rectángulo rojo representa la arteria. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: un segmento de la arteria mesentérica de ratón montado en la cámara del miógrafo. (A) un segmento de la arteria mesentérica de ratón montado en dos mordazas con dos alambres de acero. La barra blanca = 2 mm. (B) una microscópica imagen del segmento de la arteria mesentérica de ratón montado en Panel (A). Barra negra = 0,5 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Representante originales trazados que muestra el procedimiento de normalización y potenciación de High-K+ solución. Después de la segunda estimulación de alto-K+ , se puede realizar el experimento regular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: trazo representativo de arteria mesentérica de ratón que es contratada por el alto-solución de K + y entonces agregando dosis acumulativas de neoliensinine. A medida que la dosis aumentaron, la fuerza reducida en una manera dose-dependent haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La hipertensión es un reto de salud pública generalizado debido a sus graves complicaciones, incluyendo la cardiovascular y renal enfermedades16. Comprensión de la patogenesia de la hipertensión arterial y explorar más los medicamentos antihipertensivos se ha convertido en una tarea urgente en este campo. La presión arterial es generada y mantenida por la resistencia periférica de la circulación. Conforme a la ley de Poiseuille, las relativamente pequeñas arterias generan una gran proporción de la resistencia circulatoria y sirven como el productor dominante de la presión arterial3,10. Por lo tanto, medición de resistencia de pequeñas arterias en lugar de las grandes arterias es más adecuado para estudios de la presión arterial. La tecnología del miógrafo de alambre es una de las mejores modalidades para estudiar las funciones fisiológicas de la resistencia de pequeñas arterias y de la patogenesia de enfermedades vasculares.
El sistema de vaso pequeño alambre miógrafo ha sido documentado en otros informes y se utilizó para medir la contracción de rata arterias mesentéricas8 y ratón las arterias como la aorta9. Tomando ventaja de la manipulación genética, una variedad de modelos de la enfermedad y los modelos de detección de drogas, el ratón se ha convertido en un animal modelo ampliamente utilizado en muchos campos. Por lo tanto, aquí, nos proporcionó un protocolo modificado de este método para la medición de la contracción de la arteria mesentérica de ratón. En este informe, se evaluó con éxito la contractilidad de las arterias mesentéricas de ratón con modificaciones de los almacenadores intermediarios fundamentales y pasos para el montaje. Muchos estudios en vivo ex vasocontractility medición utilizan soluciones que contienen NaHCO3, tales como soluciones de Krebs, para imitar la solución salina fisiológica. Sin embargo, estos buffers necesitan CO2 para ajustar el pH a lo largo de la medición, dando por resultado la producción de CaCO3. Seleccionamos solución H-T como el sistema de tampón y encontrado funcionó bien. Puesto que la temperatura tiene poco efecto en el pun valorKde HEPES, el valor del pH de la solución se ajusta muy bien a temperatura ambiente y es igual a 37 ° C 17. Además, utilizamos Ca2 +-libre solución H-T cuando guíe los cables a través del lumen del vaso para evitar la constricción de los vasos de Ca2 +. Otra modificación de este protocolo es el procedimiento de montaje. Algunos informes8,9 y el manual del dispositivo5 recomiendan el segundo alambre de guía después de fijar el primer hilo en la mandíbula. Encontramos funciona mejor cuando dos cables se guían a través del lumen del vaso antes de montar el barco, porque este método puede reducir el peligro de dañar el transductor debido a su limitado espacio.
A pesar de la alta reproducibilidad de este método, debemos prestar más atención a algunos pasos clave. Es el más importante evitar daño a los vasos causada por pinzas y tijeras. Durante la disección del vaso, el operador debe utilizar el fórceps suavemente al estirar el tejido adiposo y utilizar las tijeras con cuidado al cortar los tejidos conectivos. Además, el recipiente para la fijación de la sujeción debe hacerse suavemente, y daños al endotelio deben evitarse cuando guíe los cables porque el endotelio dañado buque dará lugar a respuestas anormales, por ejemplo. , el vaso dañado muestra aparente fuerza tensión después de la estimulación con acetilcolina, mientras que el vaso normal muestra un efecto relajante. La explicación de este fenómeno es que el endotelio dañado no puede producir óxido nítrico correctamente. Tenga en cuenta que en el experimento que implica contracción del endotelio, el estado del endotelio debe probarse antes de la medida de fuerza. Además, debemos también cuidadosamente montamos el barco en las mandíbulas ya que el transductor se daña fácilmente si se aplica con una fuerza difícil. Por último, no utilizamos generalmente un valor de incremento constante en el micrómetro al realizar la normalización. El valor del incremento es inicialmente 30 o 20 μm y 10 μm después de la presión efectiva alcanza kPa 11-12. Este método puede reducir el tiempo de normalización y puede evitar estirar demasiado, tal modo atenuando el daño a los vasos.
Aunque nuestra investigación se centró en arterias mesentéricas de ratón, este método puede también usarse para aorta, bronquios y otros pequeños vasos como renal, cerebro y arterias pulmonares. Este sistema incluye cuatro canales, es conveniente para la medición de cuatro muestras paralelas al mismo tiempo. Además, un todo lecho vascular mesentérico puede proporcionar por lo menos cuatro segmentos de la arteria, por lo tanto es muy fácil de diseñar diferentes grupos experimentales. Según nuestra experiencia, cada segmento de la arteria sobrevive menos de 4 horas y mantiene buenas respuestas a la solución de alto-K+ durante al menos 6 repeticiones. Esta propiedad es extremadamente útil para la medición de los efectos de varias adiciones de varios fármacos candidatos. Sin embargo, también existen limitaciones al sistema wire miógrafo. El ex vivo alambre miógrafo experimento sólo es capaz de medir vasocontractility isométrico, pero generalmente se deben combinar con otras medidas para el análisis complejo de la embarcación.
En Resumen, hemos descrito un método para la medición de la contractilidad isomérica de la arteria mesentérica de ratón utilizando un sistema de alambres múltiples miógrafo. Este método puede utilizarse para evaluar las funciones del músculo liso vascular y los relajantes del músculo liso de pantalla.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos al Dr. Wei Qi He (Universidad de Suzhou, Suzhou, China) y el Dr. Yan Ning Qiao (Universidad Normal de Shaanxi, Xi ' an, China) para la asistencia técnica. Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (Grant 31272311, 81373295 y 81473420) y el proyecto financiado por la prioridad académica programa de desarrollo de Jiangsu instituciones de educación superior (Grant no. ysxk-2016).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi wire myograph system | DMT | 610-M | |
| Stainless steel wire | DMT | 400447 | |
| Geuder dissection scissor | DMT | 400431 | |
| Dumont forceps | DMT | 300413 | |
| PowerLab/8SP | ADInstruments | ML785 | |
| Software | ADInstruments | LabChart 5 | |
| NaCl | SigmaAldrich | S5886 | |
| KCl | SigmaAldrich | P5405 | |
| CaCl2 | SigmaAldrich | C4901 | |
| MgCl2·6H2O | SigmaAldrich | M2393 | |
| D-Glucose | SigmaAldrich | G6152 | |
| HEPES | Sangon Biotech | A100511-0250 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045 | |
| DMSO | SigmaAldrich | D2650 |
References
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