Summary
線第 1 報技術を使用して、血管平滑筋機能や画面の新しい薬を調査します。今回はマウスの腸間膜動脈の等尺性収縮を測定して血管平滑筋の弛緩を新しいスクリーニングのための詳しいプロトコル。
Abstract
ワイヤー第 1 報技術を使用して脱分極の応答、GPCR アゴニスト/阻害薬.での血管平滑筋の収縮性を評価するには血管平滑筋の生理学的機能、高血圧など血管系の疾患の病態解明と平滑筋弛緩薬の開発に関する多くの研究で広く使用されます。マウス疾患モデル、遺伝子組み換え系統の大きなプールで広く使用されているモデル動物であります。詳細にマウスの腸間膜動脈の等尺性収縮を測定する方法を紹介します。マウス腸間膜動脈の 1.4 mm のセグメントは分離され、内腔を通して 2 つの鋼線を渡すことによって第 1 報室にマウントされています。平衡と正規化の手順の後、血管収縮アッセイの前に 2 回高 K+ソリューションによってし。医薬品開発におけるこのメソッドのアプリケーションの例としてマウスの腸間膜の新規天然物質の neoliensinine、中国のハーブ、ハスの実 (ハス春まき。) の胚から分離した弛緩効果を測定動脈。第 1 報室に取り付けられた容器セグメント高 K+溶液で刺激を受けました。力の張力が安定した持続的な段階に達したら、neoliensinine の累積線量は商工会議所に追加されました。それは高血圧に対する潜在的な活性をクマが示唆その neoliensinine 平滑筋収縮に対する用量依存性弛緩効果があったとわかりました。さらに、血管できます取り付け後、少なくとも 4 時間を生き残るため、何回も、我々 はお勧めの高 K+ソリューションによる収縮性が維持された、創薬スクリーニングの時間のかかるプロセスの線第 1 報システムを使用すること。
Introduction
ここで使用される小型船舶の第 1 報システムだった測定の内部直径 100 から 400 μ m 分離小型船舶 (約 2 mm 長い) に至るまでの小さな抵抗血管の等尺性収縮直径 40 μ m 2 本のワイヤーによって挿入されたし、順番にマイクロメータ側と探触子側の顎にマウントされています。この第 1 報手法だった 1972年1で最初に提案したし、Mulvany と彼の同僚2,3,の4,5,6が主に開発しました。今、安定装置、簡単なパフォーマンス標準正規化手順7,8,9と成熟した技術です。我々 はマウスの腸間膜動脈で測定にいくつかの変更でこのメソッドが利用されています。
血管平滑筋は、ほとんどすべての血管の壁を行します。その基本的な機能は、様々 な刺激に対する応答の収縮力を生成します。通常血管平滑筋収縮は血圧調節に欠かせない、栄養補完10。様々 な病気、高血圧、心不全、虚血.などの血圧測定結果の異常な規制いくつかの研究では、異常な血圧が血管平滑筋機能不全収縮7,11,12,13に関連付けられて常にことを示唆しています。第 1 報の方法では、血管収縮薬、阻害薬など様々 な刺激によるマウス血管の等尺性収縮の調査をことができます。収縮の成功の測定は、血圧維持と血管平滑筋疾患の新規治療アプローチを模索する病態のメカニズムを理解するのに役立ちます。
多くの中国のハーブは、血管疾患の臨床治療のため広く使用されています。ただし、その有効成分は通常不明のままに。したがって、有効成分の分離・同定は、新規治療薬の開発のため非常に重要です。第 1 報マルチ ワイヤ技術では、ハーブの有効成分をスクリーニングするための単純なアプローチを提供しています。小型船舶の第 1 報システムを使用してマウスの腸間膜動脈の収縮を調査するいくつかの研究を報告し、抗高血圧活動12,13,14天然化合物を識別しました。ここでは、詳細な説明第 1 報の方法のためのプロトコルし、ロータス (ハス春まき) 種子の胚から分離した neoliensinine の弛緩効果を評価14。
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Protocol
動物操作機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) モデル動物研究センターの南京大学によって承認されました。
1. ソリューションの準備
- HEPES Tyrode ソリューション (H-T) 137.0 mM NaCl、KCl 2.7 mM、1.8 mM CaCl2、1 mM MgCl2∙6H2O、5.6 mM D-グルコースおよび 10 mM HEPES、使用準備 pH 7.3 7.4。
- カルシウムなし HEPES Tyrode ソリューションを準備 (Ca2 +-無料の H T) 140.6 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mM MgCl2∙6H2O、5.6 mM D-グルコース 10 mM HEPES、pH 7.3 7.4 を使用します。
- 124 mM KCl (高 K+) 15.7 mM の NaCl、KCl、124.0 mM 1.8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2∙6H2O, 5.6 mM D-グルコースと 10 mM HEPES、pH を使用してを使用して HEPES Tyrode ソリューション準備 7.3 7.4。
2. 実験準備
- 予熱時間 T と 37 ° C の水浴を使用した高 K+ソリューション。
- 第 1 報システム、データ集録ハードウェアとコンピューターを入れます。
- 慎重に各 H T 溶液 5 mL ですべて第 1 報室を埋めます。
- 20 ml の 4 ° C H T と Ca2 +の 2 つのペトリ皿を埋める-H T ソリューションをそれぞれ、無料、氷の上を格納します。
- H T 溶液 20 mL でコーティング 10 cm シャーレを入力し、部屋の温度でそれを維持します。
3. マウスの腸間膜動脈解離
- 頚部転位によって 8-12 週齢の c57bl/6 j 女性または男性マウスを安楽死させます。上向きの腹部とマウスを突き止めます。
- 70% エタノールで腹部を湿らせます。鼠径部から腹側正中線に沿ってはさみで皮膚を切って、両側の脚に下方の最初の切開開始から切開を加えます。両面に皮膚を引っ張ってください。腹膜を開く同じような切開を行います。
- 食道、大腸、体内から血管を餌と消化管を完全に隔離する他の結合組織を切るはさみを使用しています。
- 鉗子、血液を洗浄する冷 H T ステップ 2.4 に用意され、数回 H T ソリューションで組織を優しくすすぎを含む皿に分離セグメントを移動します。
- 2.5、準備したコーティングのシャーレにセグメントを分離を転送し、室温で上腸間膜動脈解離を行います。
- 胃、腸、回腸、盲腸、時計回りの方向を滑らかにし、胃と盲腸の左側と右側の側では、それぞれピンします。
- 腸間膜血管ベッドをストレッチし、公開解剖した腸間膜動脈にピンと腸を修正します。
注: これらの条件の下で、動脈は静脈の上にです。 - 実体顕微鏡の伝送光源をオンにし、顕微鏡下で動脈を切り裂きます。全体の組織がソリューションに没頭していることを確認します。
- 動脈周囲の脂肪組織を鉗子でクランプし、解剖はさみですべての結合組織を遮断し、動脈を分離します。避けるために、動脈を負傷します。
4. 動脈取付
- 転送し、冷たい Ca2 +に上腸間膜動脈樹を浸す-余分な動脈を鉗子でクランプによって H T ソリューション (2.4 の手順で準備) を無料します。
- 腸間膜のアーケードの腸の壁に近位動脈の 1.4 mm 部分を切断し、この動脈セグメントの両方の側面を慎重に開く 2 つの鉗子を使用します。
- ステンレス鋼ワイヤの長さ 2.5 cm の 2 つのセグメントを準備し、同じ皿にそれらを置きます。
- 優しく、鉗子を用いた動脈の片方の端をクランプし、慎重に別の鉗子の助けを借りて 1 つずつ動脈の内腔に 2 本のワイヤを挿入します。ワイヤーがまっすぐに保持されますおよび血管内皮細胞には触れないでを確認します。
- 2 つの鉗子を使用すると、スレッドの容器の外 2 つのスチール ワイヤを同時にクランプし、慎重に H T ソリューション (ステップ 2.3) で以前満ちていた第 1 報区域にシャーレから船を転送します。
- 顎を離れてのネジ取り付け用のスペースを作る。2 つの鉗子を使用して 2 つの挿入された線のいずれかの両方の側面をクランプし、顎の隙間 (図 1 a) に容器を置きます。
- マイクロメータ (図 1 b) に接続されている顎のネジに固定線の両側を折り返します。
- 左側のネジを時計回りにねじることによって修正します。右手の鉗子を使用してワイヤーをまっすぐにし、右側のネジを時計回りに (図 1) をねじることによって修正します。船は常に顎ギャップ内のことを確認してくださいが、損傷を避けるために顎を触れないでください。
- マイクロメータ (図 1) を使用して 2 つの顎を閉じる。2 つの顎が十分に近い彼らに触れないでお互い、固定線の上部に固定されていない線であるが、ことを確認します。
- 右手の鉗子を使用して、慎重に探触子を強制的に接続されている顎の角でフロントレンズアセンブリのワイヤーを折り、右側にネジ (図 1E) 周りを時計回りに包んでください。ネジを固定します。線の左側にこの手順を繰り返し、左側にあるネジ (図 1 f) を修正します。
- 慎重にマイクロメータ (図 1) を回転させることにより少し離れての顎を移動します。船のストレッチを避けます。鉗子を使用すると、探触子側でワイヤーの水平方向の平面にマイクロメータ側でワイヤーを移動します。2 つの顎の間のギャップはちょうど 2 つのワイヤを適応できるように、慎重にマイクロメータを回転します。
- 他のチャンバーに動脈をマウントする手順 4.2-4.11.すべての部屋を装置に接続、チャンバー カバー、100% 酸素供給・温度プローブを接続、37 ° C に加熱を開始グラフ作成ソフトウェアを開き、録音を開始する、グラフ ビューウィンドウの開始ボタンを押します。
- 約 20 分を平衡します。
5. 正規化
注: 実験条件を標準化するために、血管の生理学的応答性信頼性の高いを取得する、正規化手順は必要な15です。アクティブな力と容器の内部の円周の関係, によると線第 1 報システムはマウントされた容器5,8の内部の円周 (IC) を評価するために標準の正規化プログラム 9。簡潔に、マイクロメータの IC (μ m) の計算、読み取って、トランスデューサーと X の値として値を入力するには、Y の値として力、すなわち、壁張力 (mN/mm)、休憩を出力します。プログラムは (X, Y) の曲線を戻り、100 mmHg (IC100) の経壁圧に対応する IC を計算します。船が正規化された内部の円周 (IC の1) に設定されているアクティブな応答性が最大。
- デバイス上の力をすべてのチャネル 0 に設定し、別の 1-2 分の平衡します。
- 正規化の設定から選択、「DMT メニュー、および次ようパラメーターを設定。
接眼レンズ校正 (mm/div): 0.36;圧 (kPa) をターゲット: 13.3;IC1/IC100: 0.9。オンライン平均時間 (秒): 2;遅延時間 (秒): 60。DMT 正規化の設定ウィンドウを閉じるに[ok]ボタンをクリックします。 - 対応するチャネルの DMT の正規化] ウィンドウを開くには、 DMT メニューから目的のチャンネルを選択します。ウィンドウに定数値を入力すると、次のように: 組織エンドポイント a1: 0.1;組織エンドポイント a2: 4;線径 (μ m): 40。ウィンドウには、1.40 mm として計算される容器の長さが表示されます。
- 適切な組織の部屋のマイクロメータをお読みください。マイクロメータの読みのボックスに値を入力し、ポイントの追加] ボタンをクリックします。この値 (X0) X の初期値です。60 秒遅延時間後力とこのメーターの値に対応する効果的な圧力 (ERTP) がウィンドウに表示されます。同時に、マイクロメータを読むボックスがアクティブになります。
- 反時計回りの方向でマイクロメータを回すことによって正規化されている容器をストレッチします。マイクロメータを読むボックスにマイクロメータ値を入力し、ポイントの追加] ボタンをクリックします。60 の遅延時間を待ち再度 s。
- ステップ 5.5 を繰り返し、続行船をストレッチし、「マイクロメータ X1」、その IC1容器を伸ばすために必要な計算されたマイクロ メーター設定である値が表示されるまで、マイクロメータの値を追加します。
- 1の値を X にマイクロ メーターを設定します。
注: 正規化された張力は通常 1-2 mN です。
6. 動脈収縮記録
注: H T とこのセクションで使用される高 K+ソリューションを含む、すべてのソリューションは、手順 2.1 で調製しました。
- 正規化の後、15 〜 20 分のために部屋に容器を平衡します。
注: これらはこの手順では、ソリューションを変更する必要はありません。 - 高 K+ソリューションの容器に 2 回挑戦します。
- 船に挑戦、3-4 回 H T 溶液 5 mL で洗浄後、10 分のための収縮を誘発する高 K+溶液 5 mL と H T ソリューションを交換してください。
注: 一般的な収縮は、最大の力 3 mN および 2.5 mN12の周り一定の持続力。初挑戦 2.5 mN 以下の最大の力を生成するとともに、持続的な力を減少または 2 番目の課題は初めての用量よりもはるかに低い力を生成します、船は破棄され、さらに調査のため使用されません。
- 船に挑戦、3-4 回 H T 溶液 5 mL で洗浄後、10 分のための収縮を誘発する高 K+溶液 5 mL と H T ソリューションを交換してください。
- 収縮を誘発し高 K+溶液 5 mL の容器に挑戦します。5 分後に 1 μ M の neoliensinine の最終濃度で血管をリラックス室に neoliensinine 原液 (DMSO 10 mM)14 0.5 μ L を追加します。
- 力が安定している場合 (これは通常、いくつかの分を) 濃度を増加する 2 μ m 追加 1 μ L に原液のたびに t を生成する 4、6、8、10 μ M の濃度を増加する商工会議所に別 0.5 μ neoliensinine 原液を追加彼の用量反応曲線。
注: 在庫と作業濃度は薬によって異なります。
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Representative Results
第 1 報配線システムを使用してマウスの腸間膜動脈の等尺性収縮を測定し、, ロータス (ハス春まき) 種子の胚から精製した neoliensinine の弛緩効果を評価14. マウスの腸間膜動脈の分離、結合組織の洗浄、1.4 mm のセグメントにカットします。Ca2 +鋼のワイヤー 2 本で挿入された動脈セグメント-シャーレ、H T ソリューションを無料し、し、セグメントの第 1 報室 (図 2 a) の 2 つの顎にマウントされていた。セグメントをマウントした後 2 本のワイヤは、平行する、すぐお互い (図 2 b) に触れていないが、調整されました。力測定前に血管は正規化され船を安定させるために高 K+ソリューションによる 2 回。正規化中に、船は、IC、100の値に到達するまで数回を伸ばされ、各ストレッチ サイクルは、60 に堅牢な収縮、急速な緩和と力のメンテナンスを含まれている s (図 3)。通常高 K+ソリューションによる血管平滑筋の収縮を示した 2 つのフェーズ、堅牢なフェーズと、持続的なフェーズ (図 3)。血管をすることができる場合にのみ実験さらに高 K+を使用-通常で再現可能な誘発収縮が表示されます。Neoliensinine の代表的な測定は、図 4で表されます。力緊張誘発高 K+持続的な段階に達して、我々 はチャンバー カバーの穴を通って neoliensinine (1、2、4、6、8、10 μ M) の累積線量を追加しました。用量の増加と共に、力は用量依存的に減少。結果は、その neoliensinine は可能性がある候補者の抗高血圧薬14として作用する血管平滑筋弛緩物質示されます。
図 1: 取付動脈の模式図です。青い線を表す線を表し、動脈が赤の四角形を表す。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 第 1 報室内にマウントされているマウスの腸間膜動脈セグメント。(A)マウスの腸間膜動脈セグメントは 2 つの鋼線を使用して 2 つの顎にマウント。白いバー = 2 mm。 マウントされたマウスの腸間膜動脈セグメント パネル (A) の(B) A 顕微鏡像。黒いバー = 0.5 mm.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 代表的な元トレース高 K+ソリューションによって正規化手順と増強を示します。第二高-K+刺激後正規の実験を実行ことができます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 高で契約されているマウスの腸間膜動脈の代表的なトレース-K + ソリューション neoliensinine の累積線量を追加することにより、リラックスと。力が用量依存的に減少用量の増加と共に、この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
高血圧は、心血管などの重篤な合併症など腎臓疾患16広範な公衆衛生課題です。高血圧の病因を理解とより抗高血圧薬の探索は、この分野で緊急の課題になっています。血圧が生成され、循環の末梢血管抵抗によって維持されます。ポアズイユの法則によると比較的小さい動脈循環抵抗の大きい割合を生成し、血圧3,10の主要生産者として役立ちます。したがって、太い動脈ではなく、小さな抵抗血管の測定は血圧の研究に適しています。ワイヤー第 1 報技術は、小さな抵抗血管の生理機能や血管疾患の病因を研究する最高の様相の 1 つです。
小型船舶ワイヤー第 1 報システムは、他のレポートにも記載されているし、大動脈9などのラットの腸間膜動脈8とマウスの動脈の収縮を測定するために使用されました。遺伝子操作、様々 な疾患モデルや薬物のスクリーニング モデル、マウスを利用して多くの分野で広く使用されているモデル動物となっています。したがって、ここでは、我々 はこのマウスの腸間膜動脈の収縮の測定法の修正されたプロトコルを提供しました。このレポートでは、正常に基本的なバッファーおよび取り付け手順の変更とマウスの腸間膜動脈の収縮力を測定しました。Vasocontractility 測定前のヴィヴォに関する多くの研究は、生理的食塩水を模倣するのに NaHCO3、クレブス ソリューションなどを含む溶液を使用しました。しかし、そのようなバッファーは CaCO3の生産の結果、測定中の pH 値を調整する CO2を必要があります。バッファー システムとして H T ソリューションを選択し、それがうまく発見します。温度は、pK値 HEPES のほとんど影響があるので、溶液の pH 値は室温調整は便利なとは 37 ° C 17に変更。さらに、私たちを使用して Ca2 +-無料 H T ソリューションのときに Ca2 +によって血管の収縮を防ぐために血管内腔を通してワイヤーを誘導します。このプロトコルでもう一つの変更は、取付手順です。いくつかレポート8,9およびデバイスのマニュアル5は、あごに最初の線を修正した後第 2 線材を指導することをお勧めします。我々 は、このメソッドは、限られた室内スペースのためのトランスデューサーの損傷を減らすことができるので、容器をマウントする前に血管内腔を 2 本のワイヤが導かれている場合、それは良い作品を見つけます。
このメソッドの高再現性にもかかわらずいくつかの重要なステップにもっと注意を払う必要があります。鉗子、はさみによって引き起こされる血管への損傷を避けるために最も重要であります。血管解剖時にオペレーターは鉗子を使用して軽く、脂肪組織をストレッチすると、結合組織をカットするときに慎重にはさみを使用します。さらに、クランプ固定用容器慎重に行う必要があり、内皮損傷血管は異常な応答、例えばに上昇を与えるためにワイヤーを導くとき、血管内皮細胞への損傷を避ける必要があります。, , 破損した容器表示アセチルコリン刺激後明白な力緊張正常の血管弛緩作用を示しています。この現象の説明は、破損した血管内皮細胞は一酸化窒素を正しく作り出すことができないです。実験では収縮の内皮細胞関連事件、内皮の状態する必要があります力測定前にテストすることに注意してください。さらに、我々 も慎重に顎に容器をマウントする必要がありますハード力で適用されている場合、探触子が簡単に破損しているので。最後に、通常使いません一定の増分値、マイクロメータの正規化を実行するとき。インクリメントの値は当初 30 または 20 μ m と効果的な圧力の後で 10 μ m に達する 11 12 kPa。このメソッドは、正規化時間を減らすことができ、overstretching、血管損傷をそれにより減衰を防ぐことができます。
我々 の調査はマウスの腸間膜動脈に焦点を当てて、ただし、このメソッドは大動脈、気管支と他の腎を含む小型船舶、脳や肺動脈の使用もできます。以来、このシステムには、4 つのチャンネルが含まれています、同時に 4 つの並列サンプルの測定に便利です。さらに、全体の腸間膜血管床が少なくとも 4 つの動脈セグメントを提供できる、つまり異なる実験グループの設計は非常に簡単。私たちの経験によると、各動脈セグメントは少なくとも 4 時間を存続させ、少なくとも 6 繰り返し良いレスポンス高 K+ソリューションを維持します。このプロパティは、さまざまな候補薬のいくつかの追加の効果の測定のため非常に便利です。ただし、ワイヤー第 1 報システムの制限もあります。Ex vivo線第 1 報実験は等尺性の vasocontractility を測定することができるだけが、通常容器の複雑な分析のための他の測定と組み合わせることはする必要があります。
要約すると、第 1 報配線システムを使用してマウスの腸間膜動脈の異性体の収縮の測定法について述べる。このメソッドは、血管平滑筋と平滑筋の弛緩を画面に機能を評価するために使用することができます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
テクニカル サポート、博士魏斉彼 (東呉大学、中国・蘇州) と博士ヤン寧喬 (陝西師範大学、西安、中国) に感謝します。この作品は中国の国家自然科学基金 (グラント 31272311、81373295、81473420)、優先度学術プログラム開発の江蘇高等教育機関 (グラント号のプロジェクト資金によって支えられました。ysxk-2016)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi wire myograph system | DMT | 610-M | |
| Stainless steel wire | DMT | 400447 | |
| Geuder dissection scissor | DMT | 400431 | |
| Dumont forceps | DMT | 300413 | |
| PowerLab/8SP | ADInstruments | ML785 | |
| Software | ADInstruments | LabChart 5 | |
| NaCl | SigmaAldrich | S5886 | |
| KCl | SigmaAldrich | P5405 | |
| CaCl2 | SigmaAldrich | C4901 | |
| MgCl2·6H2O | SigmaAldrich | M2393 | |
| D-Glucose | SigmaAldrich | G6152 | |
| HEPES | Sangon Biotech | A100511-0250 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045 | |
| DMSO | SigmaAldrich | D2650 |
References
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