Summary
הטכניקה myograph החוט משמש כדי לחקור פונקציות השריר החלק בכלי הדם, תרופות חדשות מסך. אנחנו מדווחים על פרוטוקול מפורט עבור מודדים את contractility איזומטרי של עורק מצע המעי העליון העכבר, הקרנת מרפה החדש של השריר החלק בכלי הדם.
Abstract
הטכניקה myograph החוט משמש כדי להעריך את contractility של כלי הדם השרירים החלקים בתגובה depolarization, GPCR אגוניסטים/מעכבי, סמים. זה נמצא בשימוש נרחב מחקרים רבים בנושא פונקציות פיזיולוגיים של השריר החלק בכלי הדם, בפתוגנזה של כלי דם מחלות כגון יתר לחץ דם, ופיתוח של תרופות להרפיית שריר חלק. העכבר הוא חיה מודל נפוץ עם בריכה גדולה של מודלים של המחלה, זנים מהונדסים. הצגנו בשיטה זו כדי למדוד את התכווצות איזומטרי של העכבר עורק מצע המעי העליון בפירוט. קטע מ מ 1.4 של עורק מצע המעי העליון ההתנגדות העכבר היה מבודד, רכוב על תא myograph על-ידי העברת שני חוטי פלדה דרך לומן שלה. לאחר צעדים equilibration, נורמליזציה, קטע הקיבול היה potentiated על ידי פתרון גבוהה-K+ פעמיים לפני וזמינותו התכווצות. כדוגמה של היישום של שיטה זו של פיתוח תרופות, מדדנו את השפעת להרפיית הרומן חומר טבעי, neoliensinine, מבודד עשבים סיניים, העוברים של הזרע לוטוס (Nelumbo nucifera Gaertn..) על העכבר מצע המעי העליון העורקים. הקטעים כלי רכוב על תא myograph היו מגורה עם פתרון גבוהה-K+ . כאשר המתח כוח הגיעה תקופה ממושכת יציב, מינונים מצטברים של neoliensinine נוספו אל התא. מצאנו את שזה neoliensinine הייתה השפעה להרפיית למינון על התכווצות השריר החלק, ובכך רומז כי היא נושאת פעילות פוטנציאליות נגד יתר לחץ דם. בנוסף, כפי קטע הקיבול יכול לשרוד לפחות 4 שעות לאחר הרכבה ולתחזק contractility שנגזרות הפתרון גבוהה-K+ כי פעמים רבות, אנו ממליצים כי מערכת myograph תיל עשוי לשמש עבור התהליך זמן רב של והתרופות הקרנה.
Introduction
המערכת myograph כלי קטן המשמש כאן הייתה למדידת איזומטרי התכווצות של כלי התנגדות קטן עם קטרים פנימי 100 ועד 400 מיקרומטר. מבודד כלי שיט קטנים (כ-2 מ מ אורך) הוכנסו על ידי שני חוטים קוטר 40-מיקרומטר, היו אז רכוב על הלסתות מיקרומטר-צד וצד מתמר ברצף. טכניקה זו myograph היה הציע לראשונה בשנת 19721 ולאחר מכן פיתחו בעיקר על ידי Mulvany ו שלו עמיתים2,3,4,5,6. עכשיו זה טכניקה בוגרת עם ציוד יציב, ביצועים קל ו8,97,הליך סטנדרטי נורמליזציה. אנחנו מנוצל בשיטה זו עם כמה שיפורים עבור מידות עורק מצע המעי העליון העכבר.
השריר החלק בכלי הדם קווים הקירות של כמעט כל כלי הדם. הפונקציה הבסיסית שלהם היא לייצר כוחות באמצעות התכווצות בתגובה לגירויים שונים. Contractility נורמלי של השריר החלק בכלי הדם חיונית ויסות לחץ דם, תזונה תוספת של10. חריג ויסות לחץ דם תוצאות במגוון רחב של מחלות, כולל יתר לחץ דם, אי ספיקת לב, ischaemia. מספר מחקרים הראו כי לחץ דם חריג קשורה תמיד השריר החלק בכלי הדם מתפקדת contractility7,11,12,13. שיטת myograph מאפשרת חקירת contractility איזומטרי של העכבר כלי המושרה על ידי גירויים שונים כולל vasoconstrictors, מעכבי וסמים. מדידות מוצלחת של התכווצות יסייע לנו להבין את המנגנונים של לחץ דם ותחזוקה בפתוגנזה של מחלות הקשורות השריר החלק בכלי הדם, וכן לבחון גישות טיפוליות הרומן.
צמחי מרפא סיניים רבים היה בשימוש נרחב לטיפול קלינית של מחלות לב וכלי דם; עם זאת, למרכיביהם יעיל בדרך כלל נשאר לא ידוע. לפיכך, בידוד וזיהוי של הרכיבים יעיל הוא מאוד חשוב עבור פיתוח תרופות חדישות. האזנה מרובה myograph הטכנולוגיה מציעה גישה פשוטה לסינון הרכיבים הפעילים של עשבי תיבול. יש דיווח על מספר מחקרים באמצעות מערכת myograph כלי קטן לחקור התכווצות עורק מצע המעי העליון העכבר ואנו לזהות תרכובות טבעיות עם פעילות אנטי-יתר לחץ דם12,13,14. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור פעולת השירות myograph והערכת השפעת מרפה neoliensinine מבודדת מעוברים של זרע הלוטוס (GaertnNelumbo nucifera ). 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מניפולציות בעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של האוניברסיטה מודל החיה מחקר מרכז של נאנג'ינג.
1. פתרון הכנה
- להכין פתרון HEPES-Tyrode (H-T) באמצעות 137.0 מ"מ NaCl, מ מ 2.7 אשלגן כלורי, CaCl 1.8 מ מ2, 1 מ מ MgCl2∙6H2O, 5.6 מ מ D-גלוקוז ו 10 מ מ HEPES, pH 7.3-7.4.
- להכין HEPES-Tyrode פתרון ללא סידן (Ca2 +-חינם H-T) באמצעות מ"מ 140.6 NaCl, מ מ 2.7 אשלגן כלורי, 1 מ MgCl2∙6H2O, 5.6 מ מ D-גלוקוז ו- 10 מ מ HEPES, pH 7.3-7.4.
- להכין HEPES-Tyrode פתרון באמצעות 124 מ"מ אשלגן (K גבוה+) באמצעות 15.7 מ מ NaCl, 124.0 מ מ. אשלגן כלורי, מ מ 1.8 CaCl2, 1 מ MgCl2∙6H2O, 5.6 מ מ D-הגלוקוז, ו- 10 מ מ HEPES, pH 7.3-7.4.
2. ניסוי הכנה
- מחממים H-T ו פתרונות High-K+ שימוש באמבט מים 37 ° C.
- הפעל את מערכת myograph, נתוני רכישת חומרה ומחשב.
- למלא בקפידה צ'יימברס myograph כל 5 מ"ל של H-T פתרון לכל.
- למלא שתי צלחות פטרי עם 20 מ של 4 ° C H-T ו- Ca2 +-ללא פתרונות H-T, בהתאמה, ולאחסן על קרח.
- מילוי ס מ-10 מצופה פטרי עם 20 מ של H-T פתרון ולתחזק אותה בטמפרטורת החדר.
3. מצע המעי העליון העכבר עורק
- המתת חסד של 8-12-בת שבוע C57BL/6J נשית או גברית העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם. להצמיד את העכבר עם הבטן שלו פונה כלפי מעלה.
- להרטיב את הבטן עם 70% אתנול. ואז, לחתוך את העור עם מספריים לאורך הקו האמצעי הגחון מהמפשעה, ולבצע חתכים מנקודת ההתחלה של החתך הראשוני כלפי מטה הרגליים משני הצדדים. משוך את העור בחזרה משני הצדדים; לעשות חתכים דומה לפתיחה של הצפק.
- בעזרת מספריים, חותכים את לוושט, המעי הגס, אחרים ורקמות לבודד לחלוטין על מערכת העיכול עם האכלה להערכת מן הגוף.
- עם מלקחיים, להעביר את המקטע מבודד המנה המכיל את הקור H-T מוכן בשלב 2.4, ולשטוף בעדינות את הרקמה בפתרון H-T מספר פעמים כדי לשטוף את הדם.
- להעביר את המקטע מבודד לתוך הפטרי מצופה מוכן בשלב 2.5, ולבצע עורק מצע המעי העליון בטמפרטורת החדר.
- להחליק את קיבה, מעי, מעי ו caecum בכיוון השעון, להצמיד את הבטן ואת caecum בצד ימין ועל שמאל, בהתאמה.
- למתוח את המיטה להערכת מצע המעי העליון ותקן המעי עם סיכות כדי לחשוף את העורקים מצע המעי העליון גזור.
הערה: בתנאים אלה, העורקים הם מעל הורידים. - הפעל את מקור האור שידור של מיקרוסקופ סטריאוסקופי, לנתח את העורקים מתחת למיקרוסקופ. ודא כי הרקמה כולה הוא שקוע הפתרון.
- תהדק את רקמות adipose סביב העורקים עם מלקחיים, לבודד את העורקים על ידי כריתת כל אל הרקמות במספריים לנתיחה. הימנע ופצעו את העורקים.
4. עורקי הרכבה
- העברה, לטבול את העץ עורק מצע המעי העליון לתוך קר Ca2 +-חינם פתרון H-T (להכין בשלב 2.4) על ידי מחבר חובק למעקה העורקים עודף עם מלקחיים.
- לחתוך חלק מ מ 1.4 של העורק proximal לקיר המעי של ארקייד מצע המעי העליון, והשתמש מלקחיים שני כדי לפתוח את שני הצדדים של קטע עורק זה בזהירות.
- להכין שני מקטעים של פלדת אל-חלד חוט 2.5 ס מ אורך, למקם אותם לתוך אותה המנה.
- הצמד בעדינות את קצה אחד של העורק באמצעות מלקחיים והוסף בקפידה שני חוטי לתוך לומן של העורק אחד עם עזרה של מלקחיים אחר. ודא החוטים נשמרים ישר אל תיגע של אנדותל.
- בעזרת מלקחיים שני, מהדק את שני חוטי פלדה מחוץ הספינה משורשרות בו זמנית, בזהירות להעביר את כלי הקיבול הפטרי לתא myograph מילא בעבר עם פתרון H-T (שלב 2.3).
- בורג הלסתות בנפרד כדי לפנות מקום עבור הרכבה. תהדק את שני הצדדים של אחד שני החוטים שנוספו באמצעות מלקחיים שני, ולמקם את כלי הקיבול הפער הלסת (איור 1 א').
- לעטוף את שני צידי החבל בחוזקה סביב הברגים של הלסת מחובר של מיקרומטר (איור 1B).
- לתקן את הבורג השמאלי על ידי סיבוך עם כיוון השעון. ישרו את החוט בעזרת המלקחיים הימנית ולאחר מכן לתקן את הבורג הימני על ידי סיבוך עם כיוון השעון (איור 1C). ודא כי הכלי הוא תמיד בתוך הפער הלסת, אבל אל תגעו הלסת כדי למנוע נזק.
- סגירת הלסתות שני שימוש של מיקרומטר (איור 1D). ודא כי שתי הלסתות נמצאים מספיק קרוב אבל זה שלא יגעו אחד את השני, כי החוט מבולבל הוא בראש החוט קבוע.
- עם המלקחיים הימנית, מקפלים את החוט מוברגת בפינה של הלסת מחובר כדי לאלץ את מתמר, ובזהירות לעטוף את זה עם כיוון השעון מסביב הבורג צד ימין (איור 1E). לאחר מכן, לתקן את הבורג. חזור על שלב זה בצד שמאל של התיל ולתקן את הבורג מצד ימין (איור 1F).
- להעביר את הלסתות פשוקות מתחלפות בקפידה את מיקרומטר (איור 1 ג'י). הימנע מתיחה הכלי. להשתמש מלקחיים כדי להעביר את החוט שבצד מיקרומטר במישור האופקי של החוט על הצד מתמר. לסובב את מיקרומטר בקפידה כך הפער בין שתי הלסתות יכול להכיל רק את שני החוטים.
- חזור על שלבים 4.2 – 4.11 להר העורקים על גבי התאים האחרים. להתחבר כל התאים הציוד, לכסות את התאים, לצרף את אספקת חמצן 100% ובדיקה טמפרטורה, להפעיל חימום כדי 37 מעלות צלזיוס. פתח את תוכנת יצירת תרשימים, לחץ על לחצן התחל על חלון תצוגת תרשים כדי להתחיל להקליט.
- Equilibrate למשך כ 20 דקות.
5. נורמליזציה
הערה: כדי לתקנן את התנאים ניסיוני וכדי להשיג אמין תגובתיות פיזיולוגית של כלי, הליך נירמול הוא הכרחי15. לפי היחס בין כוח פעיל לבין היקף פנימי של כלי השיט, מערכת myograph חוט יש תוכנית נורמליזציה סטנדרטי כדי להעריך את היקף פנימי (IC) של כלי הנטען5,8, 9. בקצרה, כדי לחשב IC (מיקרומטר), לקרוא את מיקרומטר, קלט את הערך כמו הערך של X והמתמר פלט כוח, קרי, נח קיר מתח (mN/מ מ), כמו Y הערך. התוכנית להחזיר עיקול מצויד של (X, Y) ולחשב את IC המתאים בלחץ transmural של 100 מ מ כספית (100IC). הספינה מוגדר היקף פנימי מנורמל (IC1) כאשר התגובתיות פעיל הוא מקסימלי.
- הגדר כוחות כאפס עבור כל הערוצים במכשיר, equilibrate עוד 1-2 דקות.
- בחר הגדרות נורמליזציה של "תפריט DMT, ולהגדיר הפרמטרים כדלקמן:
עינית כיול (מ מ/div): 0.36; המטרה לחץ (kPa): 13.3; IC-1-/IC-100: 0.9; באינטרנט בממוצע זמן (בשניות): 2; לעכב את זמן (בשניות): 60. לחץ על הלחצן אישור כדי לסגור את חלון הגדרות נורמליזציה DMT . - בחר הערוץ של עניין DMT תפריט כדי לפתוח חלון נורמליזציה DMT עבור הערוץ המתאים. הזן את הערכים קבוע לתוך החלון כדלקמן: רקמת והגישור a1: 0.1; רקמות והגישור a2: 4; קוטר החוט (מיקרומטר): 40. החלון מציג את אורך הכלי מחושב 1.40 מ מ.
- קרא את מיקרומטר לשכת הרקמה המתאימה. הזן את הערך בתיבה קריאה מיקרומטר , ולחץ על לחצן הוסף נקודת . ערך זה הוא הערך ההתחלתי של X (X0). לאחר זמן השהיה s 60, החלון מציג את הכוח והלחץ יעיל (ERTP) המתאים לערך זה מיקרומטר. במקביל, תיבת מיקרומטר הקריאה הופכת לפעילה.
- למתוח את הכלי להיות מנורמל ע מיקרומטר נגד כיוון השעון. הזן את הערך מיקרומטר לתוך התיבה מיקרומטר קריאה , ולחץ על לחצן הוסף נקודת . לחכות זמן השהיה של 60 s שוב.
- חזור על שלב 5.5, להמשיך למתוח את כלי הקיבול, והוספת ערכי מיקרומטר עד החלון מציג את הערך של "מיקרומטר X1", אשר הוא ההגדרה מיקרומטר מחושב נדרש למתוח את כלי הקיבול שלו IC1.
- הגדר את מיקרומטר ל X ערך1 .
הערה: המתח מנורמל בדרך כלל 1-2 mN.
6. העורק התכווצות הקלטה
הערה: כל הפתרונות, כולל H-T ו- High-K+ פתרון להשתמש בסעיף זה, הוכנו בשלב 2.1.
- לאחר נורמליזציה, equilibrate את כלי הקיבול בבית הבליעה למשך 15-20 דקות.
הערה: אלה הוא אין צורך לשנות את הפתרון בשלב זה. - לאתגר את הכלי עם פתרון גבוהה-K+ פעמיים.
- לאתגר את כלי הקיבול, החלף פתרון H-T 5 מ של High-K+ פתרון כדי לגרום להתכווצות למשך 10 דקות, ואחריו כביסה עם 5 מ של H-T פתרון 3 - 4 פעמים.
הערה: התכווצות טיפוסי יש כוח מקסימלי 3 mN וכוח מתמשכת מתמיד סביב 2.5 mN12. אם האתגר הראשון יוצר כוח מקסימלי מתחת 2.5 mN או הכוח מתמשכת יורדת עם הזמן, או האתגר השני יוצר כוח נמוך הרבה יותר המינון בפעם הראשונה, כלי הקיבול נמחקת, לא ישמש לחקירה נוספת.
- לאתגר את כלי הקיבול, החלף פתרון H-T 5 מ של High-K+ פתרון כדי לגרום להתכווצות למשך 10 דקות, ואחריו כביסה עם 5 מ של H-T פתרון 3 - 4 פעמים.
- לאתגר את הכלי עם 5 מ של High-K+ פתרון כדי לגרום להתכווצות. לאחר 5 דקות, להוסיף 0.5 µL של מניות פתרון (10 מ מ דימתיל סולפוקסיד) neoliensinine14 אל החדר להירגע הלכנו לאכול ריכוז 1 מיקרומטר neoliensinine הסופי.
- כאשר הכוח הוא יציב (זה בדרך כלל לוקח מספר דקות), להוסיף עוד 0.5 µL של פתרון מניות neoliensinine לתוך החדר כדי להגדיל את ריכוז 2 מיקרומטר. להוסיף 1 µL של הפתרון מניות בכל פעם כדי להעלות את ריכוז 4, 6, 8 ו- 10 מיקרומטר לייצר t הוא מנה-תגובה עקומה.
הערה: המניות ואת העבודה ריכוזים משתנים בין תרופות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנו למדוד את contractility איזומטרי של עורק מצע המעי העליון העכבר באמצעות מערכת האזנה מרובה myograph, העריך את השפעת להרפיית neoliensinine מכל העוברים זרע הלוטוס (GaertnNelumbo nucifera ). 14. עורק מצע המעי העליון ההתנגדות העכבר היה מבודד, ניקה של רקמות החיבור ולחתוך לחלקים 1.4-mm. קטע עורק הוכנס על ידי שני חוטי פלדה ב Ca2 +-H-T הפתרון בצלחת פטרי החופשי ולאחר מכן הקטע היה רכוב על שתי מלתעות תא myograph (איור 2 א). לאחר הרכבה על הקטע, שני החוטים הותאמו להיות במקביל, קרוב אבל לא נוגעים אחד בשני (איור 2B). לפני המדידה כוח, קטע כלי מנורמל, potentiated פעמיים על-ידי פתרון גבוהה-K+ כדי לייצב את כלי הקיבול. במהלך ההליך נורמליזציה, הכלי היה נמתח מספר פעמים עד שהגיע הערך של IC100, וכללה בכל מחזור מתיחה התכווצות חזקה, מהירה מרגוע, תחזוקה כוח ב 60 s (איור 3). ההתכווצות של השריר החלק בכלי הדם המושרה על ידי פתרון גבוהה-K+ בדרך כלל הראה בשני שלבים, שלב חזקים, תקופה ממושכת (איור 3). קטע קיבול יכול להיות משמש עוד ניסויים רק אם את גבוהה-K+-התכווצות עורר מופיע נורמלי לשחזור. מדידה טיפוסית עם neoliensinine מיוצג באיור4. כאשר המתח כוח שנגזרות גבוהה-K+ הגיעה תקופה ממושכת, הוספנו מינון מצטבר של neoliensinine (1, 2, 4, 6, 8 ו- 10 מיקרומטר) דרך החורים במכסה קאמרית. ככל במינונים, הכוח מופחת באופן תלוי מינון. התוצאה מצוינת ש-neoliensinine הזה הוא חומר להרפיית השריר החלק בכלי הדם שפועל באופן פוטנציאלי תרופות נגד יתר לחץ דם מועמד14.
איור 1: תיאור סכמטי של עורקי הרכבה הליך. הקווים הכחולים מייצגים את החוטים, המלבן האדום מייצג את העורק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: קטע עורק מצע המעי העליון העכבר רכוב על תא myograph. (א) קטע עורק מצע המעי העליון העכבר רכוב על שתי הלסתות באמצעות שני חוטי פלדה. הבר לבן = 2 מ מ (B) A מיקרוסקופיים תמונת קטע עורק מצע המעי העליון של עכבר נטען לפי לוח (א). פס שחור = 0.5 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: לשרטוטים המקורי נציג מציג את תהליך הנורמליזציה ואת potentiation על-ידי פתרון גבוהה-K+ . לאחר הגירוי גבוהה-K+ השנייה, ניתן לבצע את הניסוי רגיל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: מעקב נציג של עורק מצע המעי העליון עכבר כי הוא מזמין גבוהה-K + פתרון ומשוחרר ואז על-ידי הוספת מינון מצטבר של neoliensinine. ככל במינונים, הכוח מופחת באופן תלוי מינון אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יתר לחץ דם הוא אתגר בריאות הציבור נפוצה בשל סיבוכים חמורים, כולל הלב וכלי הדם שלה מחלות כליה16. להבנת בפתוגנזה של יתר לחץ דם, לחקור יותר תרופות נגד יתר לחץ דם הפך להיות משימה דחופה בתחום זה. לחץ דם הוא נוצר ומתוחזק על ידי התנגדות היקפית של מחזור הדם. על פי החוק של Poiseuille, העורקים קטן יחסית לייצר חלק גדול של התנגדות הדם ולשמש המפיק הדומיננטי של לחץ דם3,10. לפיכך, מדידה של עורקים קטנים-התנגדות ולא עורקים גדולים מתאימה יותר מחקרים של לחץ הדם. הטכנולוגיה myograph חוט היא לאחד שיטות הטובה ביותר ללמוד את הפונקציות הפיזיולוגיות קטן-התנגדות העורקים ו בפתוגנזה של מחלות לב וכלי דם.
מערכת כלי קטן תיל myograph תועד טוב בדוחות אחרים, שימש כדי למדוד את ההתכווצות של עכברוש העורקים מצע המעי העליון העורקים8 ו העכבר כגון האאורטה9. ניצול של הנדסה גנטית, מגוון רחב של מחלות מודלים ודגמים ההקרנה סמים, העכבר הפך חיית מודל בשימוש נרחב בתחומים רבים. לכן, כאן, סיפקנו פרוטוקול שונה של שיטה זו למדידת התכווצות עורק מצע המעי העליון העכבר. בדו ח זה, מדדנו בהצלחה את contractility עורקי מצע המעי העליון עכבר עם שינויים של מאגרי יסוד וצעדים הרכבה. מחקרים רבים בנושא שמחוץ vasocontractility מדידה המשמשים פתרונות המכיל NaHCO3, כגון פתרונות קרבס, לחקות תמיסת מלח פיזיולוגית. אולם, מאגרים כאלה צריך CO2 כדי להתאים את ערך ה-pH במהלך המדידה, וכתוצאה מכך הייצור של קאקו3. אנחנו נבחר H-T פתרון מערכת מאגר ומצא שזה עבד טוב. מאז טמפרטורה יש השפעה מועטה על pK הערך של HEPES, ערך ה-pH של התמיסה בנוחות מותאם בטמפרטורת החדר והוא ללא שינוי בגיל 37 ° C 17. בנוסף, אנו משתמשים Ca2 +-H-T הפתרון החופשי כאשר המנחה את החוטים דרך לומן כלי על מנת למנוע כלי לתעוקה על ידי Ca2 +. שינוי נוסף בפרוטוקול זה הוא ההליך הרכבה. 8,כמה דוחות9 ומכשיר ידני5 ממליצים המנחה את החוט השני לאחר תיקון את החוט הראשון על הלסת. אנו מוצאים שזה עובד טוב יותר כאשר שני חוטי מודרכים דרך לומן כלי לפני הרכבה הספינה כי שיטה זו עשוי להפחית נזק אפשרי של המתמר בשל המרחב קאמרית מוגבלת.
למרות הפארמצבטית גבוהה של שיטה זו, אנחנו צריכים לשים יותר לב. כמה צעדים מרכזיים. החשוב ביותר הוא כדי למנוע נזק לכלי הנגרמת על ידי מלקחיים ומספריים. במהלך כלי ניתוח, המפעיל צריך להשתמש המלקחיים בעדינות בעת מתיחה של רקמת שומן, להשתמש בזהירות את המספריים, כאשר אתה מבתר את רקמות החיבור. בנוסף, מחבר חובק למעקה הספינה עבור קיבעון נעשה בעדינות, נזק אנדותל להימנע בעת המנחה את החוטים כי הספינה אנדותל פגום יהיה להצמיח תגובות חריגות, למשל. , הספינה פגומות מציג כוח ניכר המתח לאחר גירוי עם אצטילכולין, בעוד הספינה רגיל מראה אפקט מרפה. ההסבר לתופעה זו הוא כי אנדותל פגום לא יכול לייצר תחמוצת החנקן כראוי. שימו לב כי בניסוי מעורבים התכווצות הקשורות אנדותל, המצב אנדותל צריך להיבדק לפני המדידה כוח. בנוסף, אנחנו צריכים גם בזהירות הר הספינה על הלסתות כי המתמר פגום בקלות אם להחיל עם כוח חזק. לבסוף, אנו בדרך כלל תשתמש ערך תוספת קבועה מיקרומטר בעת ביצוע נורמליזציה. הערך של התוספת הוא 30 או 20 מיקרומטר בתחילה ומגיעה 10 מיקרומטר לאחר הלחץ יעיל kPa 11-12. שיטה זו עשויה להפחית נחסך זמן, עשויה למנוע מתיחת, ובכך attenuating כלי נזק.
למרות החקירה שלנו התמקדו העורקים מצע המעי העליון העכבר, שיטה זו יכולה לשמש גם אבי העורקים, הסמפונות, ואת אחרים כלי שיט קטנים, כולל כליות, מוח ובעורקי הריאות. מאז מערכת זו כוללת ארבעה ערוצים, זה נוח למדידה של הארבעה מקבילים בו זמנית. בנוסף, מיטה כל כלי הדם מצע המעי העליון יכול לספק לפחות ארבעה מקטעים עורק, ולכן קל מאוד לעצב קבוצות ניסוי שונות. הניסיון שלנו שכל קטע עורק שורד לפחות 4 שעות ושומר טוב התגובות הפתרון גבוהה-K+ במשך לפחות 6 חזרות. מאפיין זה הוא מאוד שימושי עבור מדידות של ההשפעות של מספר תוספות של תרופות שונות. עם זאת, יש גם מגבלות על המערכת myograph תיל. הניסוי של myograph חוט לשעבר vivo רק הוא מסוגל למדוד vasocontractility איזומטרי, אבל זה בדרך כלל צריך להיות משולב עם אחרים מידות עבור ניתוח מורכב של כלי השיט.
לסיכום, אנו תיאר שיטה למדידת contractility isomeric בעורק מצע המעי העליון העכבר באמצעות מערכת myograph האזנה מרובה. בשיטה זו ניתן להעריך את הפונקציות של השריר החלק בכלי הדם, מרפה מסך של שריר חלק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים ד ר Wei Qi הוא (אוניברסיטת שבחיים, סאזהאו, סין), ד ר יאן נינג קיאו (מחוזית האוניברסיטה, שיאן, סין) לסיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי את נבחרת מדעי הטבע קרן סין (גרנט 31272311, 81373295 ו- 81473420), את הפרוייקט ממומן על ידי עדיפות תוכנית הפיתוח של ג'יאנגסו להשכלה גבוהה המוסדות האקדמיים (מענק מס ' ysxk-2016).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi wire myograph system | DMT | 610-M | |
| Stainless steel wire | DMT | 400447 | |
| Geuder dissection scissor | DMT | 400431 | |
| Dumont forceps | DMT | 300413 | |
| PowerLab/8SP | ADInstruments | ML785 | |
| Software | ADInstruments | LabChart 5 | |
| NaCl | SigmaAldrich | S5886 | |
| KCl | SigmaAldrich | P5405 | |
| CaCl2 | SigmaAldrich | C4901 | |
| MgCl2·6H2O | SigmaAldrich | M2393 | |
| D-Glucose | SigmaAldrich | G6152 | |
| HEPES | Sangon Biotech | A100511-0250 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045 | |
| DMSO | SigmaAldrich | D2650 |
References
- Bevan, J. A., Osher, J. V. A direct method for recording tension changes in the wall of small blood vessels in vitro. Agents and Actions. 2 (5), 257-260 (1972).
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260 (5552), 617-619 (1976).
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile Properties of Small Arterial Resistance Vessels in Spontaneously Hypertensive and Normotensive Rats. Circulation Research. 41 (1), 19-26 (1977).
- Mulvany, M. J., Nyborg, N. An increased calcium sensitivity of mesenteric resistance vessels in young and adult spontaneously hypertensive rats. British Journal of Pharmacology. 71 (2), 585-596 (1980).
- Mulvany, M. J. Procedures for investigation of small vessels using small vessel myograph. , Danish Myo Technology. Denmark. (2004).
- Halpern, W., Mulvany, M. J., Warshaw, D. M. Mechanical properties of smooth muscle cells in the walls of arterial resistance vessels. The Journal of Physiology. 275, 88-101 (1978).
- Michael, S. K., et al. High blood pressure arising from a defect in vascular function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (18), 6702-6707 (2008).
- Bridges, L. E., Williams, C. L., Pointer, M. A., Awumey, E. M. Mesenteric artery contraction and relaxation studies using automated wire myography. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- del Campo, L., Ferrer, M. Wire Myography to Study Vascular Tone and Vascular Structure of Isolated Mouse Arteries. , Springer. New York. (2015).
- Fisher, S. A. Vascular smooth muscle phenotypic diversity and function. Physiological Genomics. 42 (3), 169-187 (2010).
- Crowley, S. D., et al. Distinct roles for the kidney and systemic tissues in blood pressure regulation by the renin-angiotensin system. The Journal of Clinical Investigation. 115 (4), 1092-1099 (2005).
- Qiao, Y. N., et al. Myosin phosphatase target subunit 1 (MYPT1) regulates the contraction and relaxation of vascular smooth muscle and maintains blood pressure. The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22512-22523 (2014).
- He, W. Q., et al. Role of myosin light chain kinase in regulation of basal blood pressure and maintenance of salt-induced hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (2), H584-H591 (2011).
- Yang, G. M., et al. Isolation and identification of a tribenzylisoquinoline alkaloid from Nelumbo nucifera Gaertn, a novel potential smooth muscle relaxant. Fitoterapia. 124, 58-65 (2018).
- Slezák, P., Waczulíková, I., Bališ, P., Púzserová, A. Accurate Normalization Factor for Wire Myography of Rat Femoral Artery. Physiological Research. 59 (6), 1033-1036 (2010).
- Kearney, P. M., et al. Global burden of hypertension: analysis of worldwide data. The Lancet. 365 (9455), 217-223 (2005).
- Good, N. E., et al. Hydrogen Ion Buffers for Biological Research. Biochemistry. 5 (2), 467-477 (1966).
