Summary
तार myograph तकनीक संवहनी चिकनी मांसपेशी कार्यों और स्क्रीन नई दवाओं की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है । हम माउस mesenteric धमनी के isometric सिकुड़ना को मापने के लिए और संवहनी चिकनी मांसपेशी के नए ढीला स्क्रीनिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल की रिपोर्ट ।
Abstract
तार myograph तकनीक के लिए ध्रुवीकरण, GPCR एगोनिस्ट/अवरोधकों और दवाओं के जवाब में संवहनी चिकनी मांसपेशियों के सिकुड़ना का आकलन किया जाता है। यह व्यापक रूप से संवहनी चिकनी मांसपेशियों के शारीरिक कार्यों पर कई अध्ययनों में प्रयोग किया जाता है, उच्च रक्तचाप के रूप में संवहनी रोगों के रोगजनन, और चिकनी मांसपेशियों को आराम दवाओं के विकास । माउस रोग मॉडल और आनुवंशिक रूप से संशोधित उपभेदों का एक बड़ा पूल के साथ एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया मॉडल जानवर है । हम विस्तार में माउस mesenteric धमनी के isometric संकुचन को मापने के लिए इस विधि की शुरुआत की । माउस mesenteric प्रतिरोध धमनी के एक १.४ मिमी खंड अलग और अपने लुमेन के माध्यम से दो इस्पात तारों गुजर द्वारा एक myograph चैंबर पर बढ़ गया था । equilibration और सामान्यीकरण कदम के बाद, पोत खंड एक उच्च कश्मीर से potentiated था+ समाधान दो बार संकुचन परख करने के लिए पहले । दवा के विकास में इस पद्धति के आवेदन का एक उदाहरण के रूप में, हम एक उपंयास प्राकृतिक पदार्थ, neoliensinine, एक चीनी जड़ी बूटी से पृथक, कमल बीज (Nelumbo nucifera Gaertn.) माउस mesenteric पर भ्रूण से अलग के आराम प्रभाव मापा धमनियों. पोत myograph चैंबर पर घुड़सवार खंडों एक उच्च कश्मीर समाधान के साथ प्रेरित किया गया । जब बल तनाव एक स्थिर निरंतर चरण तक पहुंच गया, neoliensinine की संचई खुराक कक्ष में जोड़े गए । हमने पाया है कि neoliensinine चिकनी मांसपेशी संकुचन पर एक खुराक पर निर्भर आराम प्रभाव था, इस प्रकार यह सुझाव है कि यह उच्च रक्तचाप के खिलाफ संभावित गतिविधि भालू. इसके अलावा, के रूप में पोत खंड बढ़ते और बनाए रखने के सिकुड़ना उच्च K+ समाधान कई बार के लिए द्वारा प्रेरित के बाद कम से कम 4 घंटे जीवित रह सकते हैं, हम सुझाव है कि तार myograph प्रणाली दवा स्क्रीनिंग की समय लेने वाली प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Introduction
छोटे पोत myograph प्रणाली यहां इस्तेमाल किया १०० से लेकर आंतरिक व्यास के साथ छोटे प्रतिरोध वाहिकाओं के isometric संकुचन को मापने के लिए था ४०० µm. पृथक छोटे जहाजों (के बारे में 2 मिमी लंबे) २ ४०-µm व्यास तारों द्वारा डाला गया था और फिर थे माइक्रोमीटर पक्ष और transducer-पक्ष जबड़े क्रमिक रूप से पर घुड़सवार । इसmyograph तकनीक पहले १९७२ में सुझाव दिया गया था1 और फिर Mulvany और उनके सहयोगियों द्वारा मुख्य रूप से विकसित2,3,4,5,6। अब यह स्थिर उपकरण, आसान प्रदर्शन और एक मानक सामांय प्रक्रिया7,8,9के साथ एक परिपक्व तकनीक है । हम माउस mesenteric धमनी में माप के लिए कुछ संशोधनों के साथ इस विधि का उपयोग किया ।
संवहनी चिकनी मांसपेशी लाइनों लगभग सभी रक्त वाहिकाओं की दीवारों । उनके मौलिक कार्य के लिए विभिंन उत्तेजनाओं के जवाब में संकुचन के माध्यम से सेना उत्पंन है । संवहनी चिकनी मांसपेशी के सामान्य सिकुड़ना रक्तचाप विनियमन और पोषण अनुपूरक10के लिए आवश्यक है । उच्च रक्तचाप, हृदय की विफलता और ischaemia सहित कई प्रकार के रोगों में रक्तचाप के असामान्य नियमन। कई अध्ययनों से सुझाव दिया है कि असामान्य रक्तचाप हमेशा बेकार संवहनी चिकनी मांसपेशी सिकुड़ना7,11,12,13के साथ जुड़ा हुआ है । myograph विधि vasoconstrictors, अवरोधकों और दवाओं सहित विभिन्न उत्तेजनाओं द्वारा प्रेरित माउस वाहिकाओं के isometric सिकुड़ना की जांच की अनुमति देता है । संकुचन के सफल माप हमें रक्तचाप के रखरखाव और संवहनी चिकनी मांसपेशियों से जुड़े रोगों के रोगजनन को समझने में मदद मिलेगी और उपंयास चिकित्सकीय दृष्टिकोण का पता लगाने के लिए ।
कई चीनी जड़ी बूटियों संवहनी रोगों के नैदानिक उपचार के लिए व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है; हालांकि, उनके प्रभावी सामग्री आमतौर पर अज्ञात रहते हैं । इस प्रकार, अलगाव और प्रभावी घटकों की पहचान उपंयास दवाओं के विकास के लिए बहुत महत्वपूर्ण है । मल्टी वायर myograph प्रौद्योगिकी जड़ी बूटियों में सक्रिय घटकों को परखने के लिए एक सरल दृष्टिकोण प्रदान करता है । हम कई छोटे पोत myograph प्रणाली का उपयोग करने के लिए माउस mesenteric धमनी संकुचन की जांच और विरोधी उच्च रक्तचाप गतिविधि12,13,14के साथ प्राकृतिक यौगिकों की पहचान की अध्ययन की सूचना दी है । यहां, हम myograph विधि के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन और कमल के बीज (Nelumbo nucifera Gaertn.) के भ्रूण से पृथक neoliensinine के आराम प्रभाव का आकलन 14.
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Protocol
पशु जोड़तोड़ की मंजूरी दी गई संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के नानजिंग विश्वविद्यालय के मॉडल पशु अनुसंधान केंद्र ।
1. समाधान तैयारी
- १३७.० mm NaCl, २.७ mm KCl, १.८ mm CaCl2, 1 mm MgCl2∙ 6H2हे, ५.६ mm D-ग्लूकोज, और 10 mm HEPES, पीएच 7.3-7.4 का उपयोग कर HEPES-Tyrode सॉल्यूशन (H-T) तैयार करें ।
- कैल्शियम के बिना HEPES-Tyrode समाधान तैयार (Ca2 +-free H-T) १४०.६ mm NaCl, २.७ mm KCl, 1 mm MgCl2∙ 6H2हे, ५.६ mm D-ग्लूकोज का उपयोग कर, और 10 मिमी HEPES, पीएच 7.3-7.4 ।
- १२४ mm KCl (हाई K+) का उपयोग करते हुए HEPES-Tyrode समाधान तैयार करें १५.७ mm NaCl, १२४.० mm KCl, १.८ mm CaCl2, 1 mm MgCl2∙ 6H2हे, ५.६ mm D-ग्लूकोज, और 10 mm HEPES, पीएच 7.3-7.4 का उपयोग कर ।
2. प्रयोग की तैयारी
- कचौरी एच टी और हाई-कश्मीर+ एक ३७ ° c पानी स्नान का उपयोग कर समाधान.
- myograph सिस्टम, डेटा प्राप्ति हार्डवेयर और कंप्यूटर चालू करें ।
- ध्यान से सभी myograph कक्षों को भरने के साथ 5 मिलीलीटर के एच टी समाधान प्रत्येक ।
- 4 डिग्री सेल्सियस एच टी और सीए2 +-नि: शुल्क एच टी समाधान, क्रमशः, और बर्फ पर स्टोर के 20 मिलीलीटर के साथ दो पेट्री व्यंजन भरें ।
- H-T समाधान के 20 मिलीलीटर के साथ एक 10 सेमी लेपित पेट्री डिश भरें, और कमरे के तापमान पर इसे बनाए रखने ।
3. माउस Mesenteric धमनी विच्छेदन
- Euthanize एक 8-12-सप्ताहीय C57BL/6J मादा या पुरुष माउस ग्रीवा विस्थापन द्वारा । अपने पेट के ऊपर का सामना करना पड़ के साथ नीचे माउस पिन ।
- ७०% इथेनॉल के साथ पेट गीला । फिर, कमर से ventral midline के साथ कैंची के साथ त्वचा में कटौती, और पहले चीरा के शुरू से ही दोनों पक्षों पर पैरों के नीचे चीरा. त्वचा वापस दोनों पक्षों पर खींचो; इसी तरह के चीरा करने के लिए आँख खोलना ।
- कैंची का प्रयोग, oesophagus, बृहदांत्र और अन्य संयोजी ऊतकों को पूरी तरह से शरीर से खिला vasculature के साथ जठरांत्र संबंधी मार्ग को अलग करने के लिए काट दिया ।
- संदंश के साथ, चरण २.४ में तैयार ठंड एच टी युक्त पकवान में अलग खंड हटो, और धीरे से रक्त को धोने के लिए कई बार एच टी समाधान में ऊतक कुल्ला ।
- कदम २.५ में तैयार लेपित पेट्री डिश में अलग खंड हस्तांतरण, और कमरे के तापमान पर mesenteric धमनी विच्छेदन प्रदर्शन ।
- पेट, jejunum, लघ्वान्त्र और caecum को दक्षिणावर्ती दिशा में चिकना करें, और बाएं और दाएं हाथ की ओर, क्रमशः पेट और caecum को पिन करें ।
- mesenteric vasculature बिस्तर खिंचाव और कीड़ों mesenteric धमनियों को बेनकाब करने के लिए पिन के साथ आंत को ठीक.
नोट: इन शर्तों के तहत धमनियों की नसों के ऊपर होते हैं । - एक त्रिविम माइक्रोस्कोप के संचरण प्रकाश स्रोत पर बारी, और माइक्रोस्कोप के तहत काटना धमनियों. सुनिश्चित करें कि पूरे ऊतक हल में डूब गया है ।
- संदंश के साथ धमनियों के आसपास वसा ऊतकों दबाना, और विच्छेदन कैंची के साथ सभी संयोजी ऊतकों को काटने से धमनियों को अलग । धमनियों को घायल करने से बचें ।
4. धमनी बढ़ते
- स्थानांतरण और शीत Ca में mesenteric धमनी पेड़ विसर्जित2 +-नि: शुल्क एच टी समाधान (२.४ कदम में तैयार) संदंश के साथ अतिरिक्त धमनियों दबाना द्वारा ।
- एक mesenteric आर्केड के आंतों की दीवार को धमनी के समीपस्थ के एक १.४ मिमी भाग कट, और दो संदंश का उपयोग करने के लिए इस धमनी खंड के दोनों पक्षों को ध्यान से खोलने के लिए ।
- लंबाई में स्टेनलेस स्टील वायर २.५ cm के दो क्षेत्रों तैयार है, और उंहें एक ही डिश में जगह है ।
- धीरे संदंश का उपयोग कर धमनी के एक छोर दबाना, और ध्यान से एक और संदंश की मदद से एक के बाद एक धमनी के लुमेन में दो तारों डालें । यह सुनिश्चित करें कि तारों को सीधा रखा जाए और endothelium को स्पर्श न करें ।
- दो संदंश का प्रयोग, एक साथ लड़ी पिरोया पोत के बाहर दो इस्पात तारों दबाना, और ध्यान से एक myograph पहले एच के साथ भरा कक्ष को पेट्री पकवान से पोत-टी समाधान (२.३ कदम) हस्तांतरण ।
- पेंच जबड़े के अलावा बढ़ते के लिए जगह बनाने के लिए । दो डाली दो संदंश का उपयोग कर तारों में से एक के दोनों पक्षों दबाना, और जबड़े की खाई (आंकड़ा 1a) में पोत जगह है ।
- माइक्रोमीटर से जुड़े जबड़े के शिकंजा के आसपास clamped तार के दोनों पक्षों लपेटें (आंकड़ा 1b) ।
- दक्षिणावर्त घुमा द्वारा बाएं हाथ के पेंच को ठीक करें । दाएं हाथ के संदंश का उपयोग करके वायर को सीधा करें, फिर दक्षिणावर्त (figure 1C) को घुमाकर दाएं हाथ के पेंच को ठीक करें । सुनिश्चित करें कि पोत जबड़े की खाई के अंदर हमेशा है, लेकिन नुकसान से बचने के लिए जबड़े को छूने नहीं है ।
- माइक्रोमीटर (चित्रा 1 डी) का उपयोग कर दो जबड़े बंद करो । सुनिश्चित करें कि दो जबड़े काफी करीब हैं, लेकिन है कि वे एक दूसरे को छूने और नहीं है कि अनिश्चित तार तय तार के ऊपर है ।
- दाएँ हाथ संदंश का उपयोग करना, ध्यान से transducer बल से जुड़े जबड़े के कोने पर unscrew तार गुना, और यह दाईं ओर पेंच (चित्रा 1E) के आसपास दक्षिणावर्त लपेटो. फिर, पेंच ठीक । तार के बायीं ओर इस कदम को दोहराएं और लेफ्ट साइड स्क्रू (figure 1F) को ठीक करें ।
- ध्यान से माइक्रोमीटर (चित्रा 1G) घूर्णन द्वारा जबड़े थोड़ा अलग हटो । पोत खींचने से बचें । माइक्रोमीटर ओर तार के क्षैतिज विमान को transducer साइड पर वायर ले जाने के लिए संदंश का प्रयोग करें । ध्यान से माइक्रोमीटर इतना है कि दो जबड़े के बीच अंतर बस दो तारों को समायोजित कर सकते है घुमाएं ।
- दोहराएँ कदम ४.२ – ४.११ अन्य कक्षों पर धमनियों माउंट करने के लिए. उपकरणों के लिए सभी मंडलों कनेक्ट, कक्षों को कवर, १००% ऑक्सीजन की आपूर्ति और एक तापमान की जांच देते हैं, और ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए हीटिंग शुरू करते हैं । चार्टिंग सॉफ़्टवेयर खोलें और रिकॉर्डिंग प्रारंभ करने के लिए चार्ट दृश्य विंडो पर प्रारंभ बटन दबाएँ.
- के बारे में 20 मिनट के लिए Equilibrate ।
5. सामान्यीकरण
नोट: आदेश में प्रयोगात्मक शर्तों का मानकीकरण करने के लिए और जहाजों की विश्वसनीय शारीरिक जवाबदेही प्राप्त करने के लिए, एक सामान्यीकरण प्रक्रिया15आवश्यक है. सक्रिय बल और पोत की आंतरिक परिधि के बीच संबंध के अनुसार, तार myograph प्रणाली एक मानक सामान्यीकरण कार्यक्रम घुड़सवार पोत की आंतरिक परिधि (आईसी) का आकलन करने के लिए है5,8, 9. संक्षेप में, आईसी (µm) की गणना करने के लिए, माइक्रोमीटर और इनपुट के रूप में मान X मान और transducer आउटपुट बल, यानी, दीवार तनाव आराम (mN/mm), Y मान के रूप में पढ़ें । कार्यक्रम (एक्स, वाई) के एक फिट वक्र वापस और १०० mmHg (आईसी१००) के एक transmural दबाव इसी आईसी की गणना करेगा । पोत सामान्यीकृत आंतरिक परिधि (आईसी1) के लिए सेट है जब सक्रिय जवाबदेही अधिक से अधिक है ।
- सेट बलों डिवाइस पर सभी चैनलों के लिए शूंय करने के लिए, और एक और 1-2 मिनट के लिए equilibrate ।
- "DMT मेनूसे सामांयीकरण सेटिंग्स का चयन करें, और पैरामीटर निम्नानुसार सेट करें:
ऐपिस अंशांकन (mm/div): ०.३६; लक्ष्य दबाव (केपीए): १३.३; आईसी1/IC१००: ०.९; ऑनलाइन औसत समय (सेकंड): 2; विलंब समय (सेकंड्स): ६०. DMT सामांयीकरण सेटिंग्स विंडो को बंद करने के लिए ठीक ' बटन क्लिक करें । - संबंधित चैनल के लिए DMT सामांयीकरण विंडो खोलने के लिए DMT मेनू से रुचि के चैनल का चयन करें । विंडो में स्थिर मान निम्नानुसार दर्ज करें: ऊतक अंत-अंक a1:०.१; ऊतक अंत अंक a2:4; तार व्यास (µm): ४० । विंडो परिकलित पोत लंबाई १.४० mm के रूप में प्रदर्शित करता है ।
- उपयुक्त ऊतक चैंबर के माइक्रोमीटर पढ़ें । माइक्रोमीटर पठन बॉक्स में मान दर्ज करें, और पॉइंट बटन जोड़ें पर क्लिक करे. यह मान X (X0) का प्रारंभिक मान है । एक ६० s देरी समय के बाद, विंडो बल और प्रभावी दबाव (ERTP) इस माइक्रोमीटर मान के लिए इसी प्रदर्शित करता है । इसके साथ ही माइक्रोमीटर रीडिंग बॉक्स एक्टिव हो जाता है ।
- एक काउंटर दक्षिणावर्त दिशा में माइक्रोमीटर मोड़ द्वारा सामान्यीकृत किया जा रहा पोत खिंचाव. माइक्रोमीटर पठन बॉक्स में माइक्रोमीटर मान दर्ज करें, और पॉइंट जोड़ें बटन क्लिक करे । ६० s के एक विलंब समय के लिए फिर से प्रतीक्षा करें ।
- दोहराएँ चरण ५.५, पोत खिंचाव करने के लिए जारी रखें, और विंडो के मान प्रदर्शित करता है जब तक कि माइक्रोमीटर मान जोड़ें "माइक्रोमीटर X1", जो इसकी आईसी1करने के लिए पोत खिंचाव के लिए आवश्यक परिकलित माइक्रोमीटर सेटिंग है ।
- माइक्रोमीटर को X1 मान पर सेट करें ।
नोट: सामान्यीकृत तनाव आमतौर पर 1-2 mN है ।
6. धमनी संकुचन रिकॉर्डिंग
नोट: इस अनुभाग में उपयोग किए गए H-T और उच्च-K+ समाधान सहित सभी समाधान, चरण २.१ में तैयार किए गए थे ।
- सामान्यीकरण के बाद, 15-20 मिनट के लिए चैंबर में पोत equilibrate.
नोट: ये इस चरण में समाधान परिवर्तित करने के लिए कोई आवश्यकता नहीं है । - उच्च कश्मीर के साथ पोत+ समाधान दो बार चुनौती ।
- पोत को चुनौती देने के लिए, के साथ एच टी समाधान की जगह उच्च कश्मीर के 5 मिलीलीटर+ समाधान 10 मिनट के लिए संकुचन प्रेरित करने के लिए, एच के 5 मिलीलीटर समाधान 3-4 बार के साथ धोने के बाद ।
नोट: ठेठ संकुचन 3 mn और २.५ mn12के आसपास एक निरंतर निरंतर बल पर एक अधिक से अधिक बल है । यदि पहली चुनौती २.५ mN या निरंतर बल के नीचे समय के साथ एक अधिक से अधिक बल उत्पंन करता है या दूसरी चुनौती पहली बार खुराक की तुलना में एक बहुत कम बल उत्पंन करता है, पोत छोड़ दिया है और आगे की जांच के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाएगा ।
- पोत को चुनौती देने के लिए, के साथ एच टी समाधान की जगह उच्च कश्मीर के 5 मिलीलीटर+ समाधान 10 मिनट के लिए संकुचन प्रेरित करने के लिए, एच के 5 मिलीलीटर समाधान 3-4 बार के साथ धोने के बाद ।
- उच्च-कश्मीर के 5 मिलीलीटर के साथ पोत को चुनौती+ समाधान संकुचन प्रेरित करने के लिए । 5 मिनट के बाद, neoliensinine स्टॉक समाधान के ०.५ µ l जोड़ें (DMSO में 10 मिमी)14 चैंबर में 1 µ एम neoliensinine के एक अंतिम एकाग्रता पर पोत आराम करने के लिए.
- जब बल स्थिर है (यह आमतौर पर कई मिनट लगते हैं), चैंबर में neoliensinine शेयर समाधान के एक और ०.५ µ एल जोड़ें 2 µ एम के लिए एकाग्रता बढ़ाने के लिए. 1 µ l जोड़ें स्टॉक समाधान के लिए एकाग्रता बढ़ाने के लिए 4, 6, 8 और 10 µ m टी उत्पन्न करने के लिए वह खुराक-प्रतिक्रिया वक्र ।
नोट: शेयर और काम सांद्रता दवाओं के बीच बदलती हैं ।
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Representative Results
हम एक बहु तार myograph प्रणाली का उपयोग माउस mesenteric धमनी के isometric सिकुड़ना मापा और कमल के बीज (neoliensinine Nelumbo nucifera.) के भ्रूण से शुद्ध Gaertn के प्रभाव का आकलन किया. 14. माउस mesenteric प्रतिरोध धमनी अलग था, संयोजी ऊतकों की सफाई और १.४ मिमी क्षेत्रों में कटौती । धमनी खंड में दो इस्पात तारों द्वारा डाला गया था सीए2 +-नि: शुल्क एच टी समाधान एक पेट्री डिश में, और फिर इस खंड एक myograph चैंबर के दो जबड़े पर बढ़ गया था (चित्रा 2a). खंड बढ़ते के बाद, दो तारों के समानांतर हो समायोजित किया गया, बंद लेकिन एक दूसरे को छू नहीं (चित्रा बी) । बल मापन से पहले, पोत खंड को सामान्यीकृत किया गया था और उच्च-कश्मीर से दो बार potentiated+ समाधान ताकि पोत को स्थिर कर सके । सामान्यीकरण प्रक्रिया के दौरान, पोत आईसी १०० के मूल्य तक पहुँचने तक कई बार फैला था, और प्रत्येक खिंचाव चक्र एक मजबूत संकुचन, तेजी से छूट और ६० s (चित्रा 3) में एक बल रखरखाव शामिल थे. संवहनी चिकनी उच्च कश्मीर द्वारा प्रेरित मांसपेशी का संकुचन+ समाधान आमतौर पर दो चरणों, एक मजबूत चरण और एक निरंतर चरण (चित्रा 3) दिखाया । पोत खंड अधिक प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है तभी उच्च-K+पैदा हुआ संकुचन सामांय और reproducible दिखाई देता है । neoliensinine के साथ एक ठेठ माप चित्रा 4में प्रतिनिधित्व किया है. जब बल तनाव उच्च-K+ द्वारा प्रेरित एक निरंतर चरण तक पहुंच, हम neoliensinine की संचई खुराक जोड़ा (1, 2, 4, 6, 8 और 10 µ एम) चैंबर कवर में छेद के माध्यम से । खुराक के रूप में वृद्धि हुई, एक खुराक पर निर्भर तरीके से बल कम । परिणाम संकेत दिया कि neoliensinine एक संवहनी चिकनी मांसपेशी आराम पदार्थ है कि संभावित रूप से एक उंमीदवार विरोधी उच्च रक्तचाप दवा14के रूप में कार्य करता है ।
चित्रा 1: धमनी बढ़ते प्रक्रिया की एक योजनाबद्ध । नीली रेखाओं के तारों का प्रतिनिधित्व करते हैं, और लाल आयत धमनी का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: एक माउस mesenteric धमनी खंड myograph चैंबर पर मुहिम शुरू की । (क) एक माउस mesenteric धमनी खंड दो इस्पात तारों का उपयोग कर के जबड़े पर चढ़कर । सफेद पट्टी = 2 मिमी. (ख) पैनल में घुड़सवार माउस mesenteric धमनी खंड की एक सूक्ष्म छवि (क). काली पट्टी = ०.५ मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: साधारणता प्रक्रिया को दिखा प्रतिनिधि मूल अनुरेखण और उच्च-K+ समाधान द्वारा potentiation. दूसरा उच्च-K+ उत्तेजना के बाद, नियमित प्रयोग किया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 4: माउस mesenteric धमनी के प्रतिनिधि अनुरेखण कि उच्च कश्मीर द्वारा अनुबंधित है + समाधान और फिर neoliensinine के संचय खुराक जोड़कर आराम । खुराक के रूप में वृद्धि हुई, एक खुराक पर निर्भर तरीके से कम बल इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें कृपया ।
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Discussion
उच्च रक्तचाप एक बड़े पैमाने पर सार्वजनिक स्वास्थ्य अपनी गंभीर जटिलताओं के कारण चुनौती है, हृदय और गुर्दे की बीमारियों सहित16. उच्च रक्तचाप के रोगजनन को समझना और अधिक एंटी-ग्रस्त दवाओं की खोज करना इस क्षेत्र में एक अत्यावश्यक कार्य बन गया है. रक्त दबाव उत्पंन होता है और परिसंचरण के परिधीय प्रतिरोध द्वारा बनाए रखा । है Poiseuille कानून के अनुसार, अपेक्षाकृत छोटे धमनियों संचार प्रतिरोध का एक बड़ा अनुपात उत्पंन और रक्तचाप3,10के प्रमुख निर्माता के रूप में काम करते हैं । इस प्रकार बड़ी धमनियों की अपेक्षा छोटी-प्रतिरोधक धमनियों का माप रक्तचाप के अध्ययन के लिए अधिक उपयुक्त होता है. तार myograph प्रौद्योगिकी छोटे प्रतिरोध धमनियों और संवहनी रोगों के रोगजनन के शारीरिक कार्यों का अध्ययन करने के लिए सबसे अच्छा तरीकों में से एक है ।
छोटे पोत तार myograph प्रणाली अच्छी तरह से अन्य रिपोर्टों में प्रलेखित किया गया है और महाधमनी9जैसे चूहे mesenteric धमनियों8 और माउस धमनियों के संकुचन को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था । आनुवंशिक हेरफेर, रोग मॉडल और दवा स्क्रीनिंग मॉडल की एक किस्म का लाभ उठाते हुए, माउस कई क्षेत्रों में एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया मॉडल जानवर बन गया है । इसलिए, यहां, हम माउस mesenteric धमनी संकुचन की माप के लिए इस विधि का एक संशोधित प्रोटोकॉल प्रदान की है । इस रिपोर्ट में, हम मौलिक बफ़र्स और बढ़ते कदम के संशोधनों के साथ माउस mesenteric धमनियों की सिकुड़ना सफलतापूर्वक मापा । पूर्व vivo vasocontractility माप पर कई अध्ययनों से NaHCO3युक्त समाधान इस्तेमाल किया, जैसे Krebs समाधान, शारीरिक नमक समाधान की नकल करने के लिए. हालांकि, ऐसे बफ़र्स2 कएको छैन के उत्पादन में जिसके परिणामस्वरूप माप भर पीएच मान को समायोजित करने के लिए सह कीआवश्यकता है । हम चयन बफर प्रणाली के रूप में एच टी समाधान और पाया यह अच्छी तरह से काम किया । के बाद से तापमान HEPES के पीकश्मीर मूल्य पर थोड़ा प्रभाव है, समाधान के पीएच मूल्य आसानी से कमरे के तापमान पर समायोजित है और ३७ डिग्री सेल्सियस 17पर अपरिवर्तित है । इसके अलावा, हम ca 2+-मुक्त H-T समाधान का उपयोग करें जब पोत लुमेन के माध्यम से तारों का मार्गदर्शन इतना के रूप में 2 सीए द्वारा पोत कसना को रोकने के लिए+। इस प्रोटोकॉल में एक और संशोधन बढ़ते प्रक्रिया है । कुछ रिपोर्ट8,9 और डिवाइस मैनुअल5 जबड़े पर पहले तार फिक्सिंग के बाद दूसरा तार मार्गदर्शक सलाह देते हैं । हम पाते है यह बेहतर काम करता है जब दो तार पोत लुमेन के माध्यम से पोत बढ़ते से पहले निर्देशित कर रहे है क्योंकि इस विधि सीमित चैंबर अंतरिक्ष के कारण transducer के संभावित नुकसान को कम कर सकते हैं ।
इस विधि के उच्च reproducibility के बावजूद हमें कुछ महत्वपूर्ण कदमों पर अधिक ध्यान देना चाहिए । सबसे महत्वपूर्ण संदंश और कैंची की वजह से जहाजों को नुकसान से बचने के लिए है । पोत विच्छेदन के दौरान, ऑपरेटर धीरे संदंश का उपयोग करें जब वसा ऊतक खींच और कैंची का उपयोग सावधानी से जब संयोजी ऊतक काटने चाहिए । इसके अलावा, निर्धारण के लिए पोत clamping धीरे किया जाना चाहिए, और endothelium को नुकसान से बचा जाना चाहिए जब तारों मार्गदर्शक क्योंकि endothelium-क्षतिग्रस्त पोत असामांय प्रतिक्रियाओं को जंम देना होगा, उदा। , क्षतिग्रस्त पोत acetylcholine के साथ उत्तेजना के बाद स्पष्ट बल तनाव से पता चलता है, जबकि सामांय पोत एक आराम प्रभाव से पता चलता है । इस घटना के लिए विवरण है कि क्षतिग्रस्त endothelium नाइट्रिक ऑक्साइड ठीक से उत्पादन नहीं कर सकते । ध्यान दें कि endothelium-संबंधित संकुचन में शामिल प्रयोग में, endothelium स्थिति माप बल से पहले परीक्षण किया जाना चाहिए । इसके अलावा, हम भी ध्यान से जबड़े पर पोत माउंट क्योंकि transducer आसानी से क्षतिग्रस्त अगर एक कठिन बल के साथ लागू किया जाना चाहिए । अंतत:, हम आम तौर पर उपयोग नहीं एक निरंतर वृद्धि मान माइक्रोमीटर पर सामांयीकरण करते समय । वेतन वृद्धि का मूल्य 30 या 20 µm शुरू में है और प्रभावी दबाव के बाद 10 µm 11-12 केपीए तक पहुंचता है । इस विधि सामान्यीकरण समय को कम कर सकते हैं और इस प्रकार क्षीणन पोत नुकसान, लगातार रोक सकता है ।
हालांकि हमारी जांच माउस mesenteric धमनियों पर ध्यान केंद्रित, इस विधि भी महाधमनी, ब्रांकाई, और गुर्दे, मस्तिष्क और फेफड़े की धमनियों सहित अंय छोटे जहाजों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । चूंकि इस प्रणाली में चार चैनल शामिल हैं, यह एक साथ चार समानांतर नमूनों के मापन के लिए सुविधाजनक है । इसके अलावा, एक पूरे mesenteric संवहनी बिस्तर कम से कम चार धमनी क्षेत्रों प्रदान कर सकते हैं, यह इस प्रकार बहुत अलग प्रयोगात्मक समूहों को डिजाइन करने के लिए आसान है । हमारे अनुभव के अनुसार, प्रत्येक धमनी खंड कम से कम 4 घंटे बचता है और उच्च-K+ समाधान के लिए अच्छी प्रतिक्रियाएं रखता है पर कम से 6 पुनरावृत्ति । यह गुण विभिन्न उम्मीदवार दवाओं के कई जोड़ के प्रभाव की माप के लिए अत्यंत उपयोगी है । हालांकि तार myograph व्यवस्था को लेकर भी सीमाएं हैं । पूर्व vivo तार myograph प्रयोग केवल isometric vasocontractility को मापने के लिए सक्षम है, लेकिन यह आमतौर पर पोत के जटिल विश्लेषण के लिए अन्य माप के साथ संयुक्त किया जाना चाहिए.
संक्षेप में, हम एक बहु तार myograph प्रणाली का उपयोग माउस mesenteric धमनी में isomeric सिकुड़ना के माप के लिए एक विधि का वर्णन किया । इस विधि संवहनी चिकनी मांसपेशियों के कार्यों का आकलन करने के लिए और चिकनी मांसपेशियों की ढीला स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
तकनीकी सहायता के लिए हम डॉ॰ वी क्वी (Soochow विश्वविद्यालय, सूज़ौ, चीन) और डॉ॰ यान निंग Qiao (शानक्सी सामान्य विश्वविद्यालय, शीआन, चीन) को धन्यवाद देते हैं । यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान ३१२७२३११, ८१३७३२९५ और ८१४७३४२०) और Jiangsu उच्चतर शिक्षा संस्थानों के प्राथमिकता अकादमिक कार्यक्रम विकास द्वारा वित्त पोषित परियोजना द्वारा समर्थित किया गया था (अनुदान सं. ysxk-२०१६) ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi wire myograph system | DMT | 610-M | |
| Stainless steel wire | DMT | 400447 | |
| Geuder dissection scissor | DMT | 400431 | |
| Dumont forceps | DMT | 300413 | |
| PowerLab/8SP | ADInstruments | ML785 | |
| Software | ADInstruments | LabChart 5 | |
| NaCl | SigmaAldrich | S5886 | |
| KCl | SigmaAldrich | P5405 | |
| CaCl2 | SigmaAldrich | C4901 | |
| MgCl2·6H2O | SigmaAldrich | M2393 | |
| D-Glucose | SigmaAldrich | G6152 | |
| HEPES | Sangon Biotech | A100511-0250 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045 | |
| DMSO | SigmaAldrich | D2650 |
References
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