Summary
De draad myograph techniek wordt gebruikt om vasculaire vlotte spier functies en de scherm nieuwe drugs te onderzoeken. Wij rapporteren een gedetailleerd protocol voor het meten van de isometrische contractility van de muis mesenterische slagader en voor het screenen van de nieuwe skeletspierrelaxantia van vasculaire glad spierweefsel.
Abstract
De techniek van de myograph draad wordt gebruikt ter beoordeling van de contractility van vasculaire gladde spieren in reactie op de depolarisatie, GPCR agonisten/remmers en drugs. Het wordt wijd gebruikt in vele studies op de fysiologische functies van vasculaire gladde spieren, de pathogenese van vasculaire ziekten zoals hypertensie, en de ontwikkeling van gladde spieren comfortabel drugs. De muis is een veelgebruikt model dier met een grote pool van ziekte modellen en genetisch gemodificeerde stammen. Introduceerden we deze methode voor het meten van de isometrische contractie van de mesenterische slagader muis in detail. Een 1.4-mm segment van muis mesenterische weerstand slagader was geïsoleerd en gemonteerd op een myograph kamer door twee stalen draden via haar lumen. Na evenwichtsinstelling en normalisatie stappen, was het schip segment Potentiation door een oplossing van de hoog-K+ tweemaal vóór de bepaling van de contractie. Als een voorbeeld van de toepassing van deze methode in Geneesmiddelenontwikkeling, we het comfortabel effect van een nieuwe natuurlijke stof, neoliensinine, geïsoleerde van een Chinees kruid, embryo's van als het zaad van de lotus (Nelumbo nucifera Gaertn.) gemeten op muis lymfklieren slagaders. De segmenten van de schip gemonteerd op de kamer van de myograph werden gestimuleerd met een high-K+ -oplossing. Wanneer de kracht spanning een stabiele duurzame fase bereikt, werden cumulatieve dosissen van neoliensinine toegevoegd aan de kamer. We vonden dat neoliensinine een dosis-afhankelijke comfortabel effect gehad op gladde spiercontractie, zo suggereert dat het draagt potentiële activiteit tegen hypertensie. Bovendien, zoals het schip segment kan ten minste 4 uur na montage overleven en onderhouden van contractility geïnduceerd door de high-K+ -oplossing voor vele malen, wij stellen voor dat kan de draad myograph systeem worden gebruikt voor het tijdrovende proces van drug screening.
Introduction
Het klein schip myograph systeem hier gebruikt was voor het meten van de isometrische contractie van kleine weerstand vaartuigen met een interne diameter variërend van 100 tot 400 µm. geïsoleerde kleine vaartuigen (ongeveer 2 mm lang) zijn ingevoegd door twee 40-µm diameter draden en waren toen gemonteerd op de micrometer-side en transducer-side kaken opeenvolgend. Deze techniek van de myograph was eerst voorgesteld in 19721 en vervolgens ontwikkeld voornamelijk door Mulvany en zijn collega's2,3,4,5,6. Het is nu een volwassen techniek met stabiele uitrusting, gemakkelijk prestaties en een standaard normalisatie procedure7,8,9. We gebruikt deze methode met een aantal wijzigingen voor metingen in de mesenterische slagader van de muis.
Vasculaire glad spierweefsel lijnen de muren van bijna alle bloedvaten. Hun fundamentele functie is het genereren van krachten door contractie in reactie op verschillende stimuli. De normale contractility van vasculaire glad spierweefsel is essentieel voor de verordening van de bloeddruk en voeding aanvullen10. Abnormale regulering van bloeddruk resultaten in een verscheidenheid van ziekten zoals hypertensie, hartfalen en ischemie. Verschillende studies hebben gesuggereerd dat abnormale bloeddruk altijd gekoppeld aan disfunctionele vasculaire gladde spieren contractility7,11,12,13 is. De methode myograph kunt onderzoek van isometrische contractility van muis vaartuigen geïnduceerd door verschillende stimuli met inbegrip van vasoconstrictors, remmers en drugs. Succesvolle metingen van contractie zal helpen ons te begrijpen van de mechanismen voor onderhoud van de bloeddruk en de pathogenese van vasculaire glad spierweefsel-geassocieerde ziekten en verkennen van nieuwe therapeutische benaderingen.
Vele Chinese kruiden hebben op grote schaal gebruikt voor de klinische behandeling van vasculaire ziekten; hun effectieve ingrediënten blijven echter meestal onbekend. Isolatie en identificatie van de effectieve componenten is dus zeer belangrijk voor de ontwikkeling van nieuwe medicijnen. Multi draad myograph-technologie biedt een eenvoudige benadering voor het screenen van actieve bestanddelen in kruiden. We hebben verschillende studies met behulp van het systeem van de myograph klein schip te onderzoeken muis mesenterische slagader contractie gemeld en natuurlijke verbindingen geïdentificeerd met anti-hypertensie activiteit12,13,14. Hier beschrijven we de gedetailleerd protocol voor de myograph-methode en beoordelen het comfortabel effect van neoliensinine geïsoleerd van embryo's van zaad van de lotus (Nelumbo nucifera Gaertn.) 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierlijke manipulaties werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Model Animal Research Center van Nanjing universiteit.
1. oplossing voorbereiding
- Bereid HEPES-Tyrode-oplossing (H-T) met behulp van 137.0 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,8 mM CaCl21 mM MgCl2∙6H2O, 5,6 mM D-glucose en 10 mM HEPES, pH 7,3-7.4.
- Bereid HEPES-Tyrode oplossing zonder calcium (Ca2 +-H-T gratis) met behulp van 140.6 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2∙6H2O, 5,6 mM D-glucose en 10 mM HEPES, pH 7,3-7.4.
- Bereid HEPES-Tyrode oplossing met behulp van 124 mM KCl (hoge K+) met behulp van 15.7 mM NaCl, 124.0 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2∙6H2O of D-glucose, en 10 mM HEPES, pH van 5,6 mM 7.3-7.4.
2. experiment voorbereiding
- Verwarm de H-T en High-K+ -oplossingen met behulp van een waterbad 37 ° C.
- Schakel het myograph systeem, data acquisitie hardware en computer.
- Zorgvuldig Vul alle myograph kamers met 5 mL van H-D oplossing.
- Vul twee petrischaaltjes met 20 mL 4 ° C H-T en Ca2 +-gratis H-T oplossingen, respectievelijk, en op te slaan op het ijs.
- Vul een 10-cm gecoat petrischaal met 20 mL H-T oplossing, en onderhouden bij kamertemperatuur.
3. muis mesenterische slagader dissectie
- Een 8-12-week-oude C57BL/6J vrouwelijke of mannelijke muis door cervicale dislocatie euthanaseren. Pins de muis naar beneden met haar buik naar boven.
- Bevochtig de buik met 70% ethanol. Knip de huid met een schaar langs de ventral midline van de lies, en vervolgens Maak insnijdingen vanaf het begin van de eerste snede naar beneden naar de benen aan beide zijden. Trek de huid terug aan beide zijden; Maak soortgelijke insnijdingen te openen het buikvlies.
- Met behulp van schaar, snij de slokdarm, de dikke darm en andere bindweefsels volledig isoleren het maag-darmkanaal met het voeden van therapieën uit het lichaam.
- Met een tang, de geïsoleerde segment naar de schotel met het koude H-T bereid in stap 2.4 en voorzichtig spoelen het weefsel in H-T oplossing meermaals te wassen uit het bloed te verplaatsen.
- Breng het geïsoleerde segment in de gecoate petrischaal bereid in stap 2.5 en uitvoeren van de mesenterische slagader dissectie bij kamertemperatuur.
- Gladstrijken van de maag, jejunum, ileum en caecum in een richting van de klok, en de maag en het caecum pin aan de linker- en rechter kant, respectievelijk.
- Rekken van de mesenterische therapieën bed en monteren van de darm met pinnen om de ontleed mesenterische slagaders bloot te stellen.
Opmerking: Onder deze omstandigheden, de slagaders zijn op de top van de aderen. - Zet de lichtbron van de transmissie van een stereoscopische Microscoop, en ontleden slagaders onder de Microscoop. Zorg ervoor dat het hele weefsel in de oplossing is ondergedompeld.
- Het vetweefsel rond de slagaders klem met pincet en isoleren van de slagaders door het afsnijden van alle het bindweefsel met een dissectie schaar. Vermijd verwonden van de slagaders.
4. arteriële montage
- Overdracht en de mesenterische slagader boom onder te dompelen in de koude Ca2 +-vrije H-T oplossing (bereid in stap 2.4) door de overtollige slagaders klemmen met een tang.
- Een 1.4-mm-deel van de slagader proximale aan de darmwand van een mesenterische arcade afgesneden, en twee pincet kunt openen van beide zijden van dit segment van de slagader zorgvuldig.
- Bereiden van twee segmenten van roestvrij staaldraad 2.5 cm in lengte, en plaats ze in de dezelfde schotel.
- Zachtjes klem één uiteinde van de slagader met behulp van Tang, en zorgvuldig steek twee draden in het lumen van de slagader één voor één met hulp van een ander pincet. Ervoor dat de draden rechtdoor blijven en raak niet het endotheel.
- Met behulp van twee pincet, de twee stalen draden tegelijk buiten het schroefdraad vaartuig klem en zorgvuldig het schip van de petrischaal overbrengen naar een kamer van de myograph eerder gevuld met H-T oplossing (stap 2.3).
- Schroef de kaken uit elkaar om ruimte voor montage te maken. Klem van beide zijden van één van de twee ingevoegde draden met behulp van twee pincet en plaats van het vaartuig in de kloof van de kaak (figuur 1A).
- Wrap van beide zijden van de geklemd draad rond schroeven van de kaak aangesloten op de micrometer (figuur 1B).
- Bevestigen de linker schroef door te draaien met de klok mee. Strek de draad die rechtse pincet gebruiken, dan oplossen van de rechtse schroef door te draaien met de klok mee (Figuur 1 c). Zorg ervoor dat het schip altijd binnen de kloof van de kaak is, maar raak niet aan de kaak om schade voorkomen.
- Sluit de twee kaken met behulp van de micrometer (Figuur 1 d). Zorg ervoor dat de twee kaken dicht genoeg zijn, maar dat ze niet raken elkaar en dat de losse draad op de bovenkant van de vaste draad.
- Met behulp van de rechter Tang, zorgvuldig vouwen van de olieaftapslang draad op de hoek van de bek aangesloten om te dwingen transducer en wikkel het rond de rechterkant schroef (figuur 1E) met de klok mee. Vervolgens de schroef vast te stellen. Herhaal deze stap aan de linkerzijde van de draad en monteren van de schroef aan de linkerkant (figuur 1F).
- Verplaats de kaken iets uit elkaar door het zorgvuldig draaien de micrometer (figuur 1G). Te voorkomen dat zich uitstrekt van het vaartuig. Pincet gebruiken om de draad aan de zijkant micrometer naar het horizontale vlak van de draad aan de kant van de omvormer. Zorgvuldig draai de micrometer zo dat de kloof tussen de twee kaken is alleen geschikt voor de twee draden.
- Herhaal stap 4.2 – 4.11 monteren van de slagaders naar de andere kamers. Sluit alle de kamers aan de apparatuur, betrekking hebben op de kamers, de zuurstoftoevoer van 100% en een temperatuursonde koppelen en start verwarming tot 37 ° C. Open de charting software en druk op de knop Start op het Diagram venster om te beginnen met opnemen.
- Equilibreer gedurende ongeveer 20 minuten.
5. normalisatie
Opmerking: Oog op de standaardisering van de experimentele omstandigheden en verkrijgen van betrouwbare fysiologische respons van vaartuigen, een normalisatie-procedure is noodzakelijk15. Volgens de relatie tussen de actieve kracht en interne omtrek van het vaartuig heeft de wire myograph systeem een standaard normalisatie-programma voor de beoordeling van de interne omtrek (IC) van de gemonteerde vaartuig5,-8, 9. Output kort, kracht, dat wil zeggen, rust muur spanning (mN/mm), als de Y-waarde te berekenen van IC (µm), lees de micrometer en invoergegevens naar de waarde als de X-waarde en de transducer. Het programma zal een ingerichte curve van (X, Y) terug en berekenen van de IC overeenkomt met een Transmurale druk van 100 mmHg (IC100). Het schip is ingesteld op de genormaliseerde interne omtrek (IC1) wanneer de actieve responsiviteit maximale is.
- Krachten ingesteld op nul voor alle kanalen op het apparaat en equilibreer gedurende een ander 1-2 min.
- Selecteer instellingen voor normalisatie van de "DMT menuen de parameters als volgt instellen:
Oculair kalibratie (mm/div): 0,36; Target druk (kPa): 13.3; IC-1/IC100: 0.9; Online gemiddeld tijd (seconden): 2; Vertraging van de tijd (seconden): 60. Klik op de knop OK om het venster van de DMT normalisatie-instellingen te sluiten. - Selecteer het kanaal van belang in het menu van de DMT een DMT normalisatie venster voor het desbetreffende kanaal te openen. De constante waarden invoeren in het venster als volgt: weefsel eindpunten a1: 0,1; Weefsel eindpunten a2: 4; Diameter van de draad (µm): 40. Het venster bevat de berekende scheepslengte als 1,40 mm.
- Lees de micrometer van de juiste weefsel kamer. Voer de waarde in het vak lezen van Micrometer en op Punt toevoegen knop. Deze waarde is de aanvankelijke waarde van X (X0). Na een 60 s vertragingstijd toont het venster de kracht en de effectieve druk (ERTP) die overeenkomt met deze waarde micrometer. Tegelijkertijd wordt het vak lezen van Micrometer actief.
- Het vaartuig wordt genormaliseerd door te draaien aan de micrometer in een tegenwijzerzin rekken. De micrometer-waarde invoeren in het vak lezen van Micrometer en op Punt toevoegen knop. Wachten op een vertraging van 60 s weer.
- Herhaal stap 5.5, blijven rekken van het vaartuig en micrometer waarden toevoegen totdat het venster wordt weergegeven de waarde van "Micrometer X1", dat de instelling van de berekende micrometer vereist is te rekken van het schip naar de IC-1.
- Stel de micrometer aan X1 waarde.
Opmerking: De genormaliseerde spanning is meestal 1-2 mN.
6. slagader contractie opname
Opmerking: Alle oplossingen, met inbegrip van H-T en High-K+ -oplossing gebruikt bij deze sectie, werden opgesteld in stap 2.1.
- Na normalisatie, equilibreer het vaartuig in de zaal gedurende 15-20 minuten.
Opmerking: Dit is geen behoefte om te veranderen van de oplossing in deze stap. - Daag het vaartuig met High-K+ oplossing tweemaal.
- Om de uitdaging van het vaartuig, door H-D oplossing te vervangen door 5 mL High-K+ -oplossing voor het opwekken van de contractie gedurende 10 minuten, gevolgd door wassen met 5 mL van de oplossing van de H-D 3 - 4 keer.
Opmerking: Typische samentrekking heeft een maximale kracht over 3 mN en een constante duurzame kracht rond 2.5 mN12. Als de aanhoudende kracht met de tijd vermindert, de eerste uitdaging een maximale kracht onder 2.5 mN genereert of de tweede uitdaging een veel lagere kracht dan de eerste dosis genereert, wordt het schip verwijderd en zal niet gebruikt worden voor verder onderzoek.
- Om de uitdaging van het vaartuig, door H-D oplossing te vervangen door 5 mL High-K+ -oplossing voor het opwekken van de contractie gedurende 10 minuten, gevolgd door wassen met 5 mL van de oplossing van de H-D 3 - 4 keer.
- Daag het vaartuig met 5 mL High-K+ -oplossing voor het opwekken van contractie. Na 5 min, voeg toe 0,5 µL van de stockoplossing (10 mM in DMSO) neoliensinine14 in de kamer om te ontspannen van het vaartuig op een eindconcentratie van 1 µM neoliensinine.
- Wanneer de kracht is stabiel (dit duurt meestal enkele minuten), een andere 0,5 µL van de stockoplossing van neoliensinine in de kamer te verhogen de concentratie tot 2 µM. Voeg 1 µL van de stockoplossing telkens tot verhoging van de concentratie op 4, 6, 8 en 10 µM voor het genereren van t toevoegen Hij dosis-responscurve.
Opmerking: De voorraad en de werkende concentraties verschillen tot drugs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wij de isometrische contractility van muis mesenterische slagader met behulp van een multi-draad myograph systeem gemeten en beoordeeld het comfortabel effect van neoliensinine gezuiverd van embryo's van zaad van de lotus (Nelumbo nucifera Gaertn.) 14. de slagader van de mesenterische weerstand muis was geïsoleerd, gezuiverd van bindweefsel en snijd in 1.4-mm segmenten. De slagader segment is ingevoegd door twee stalen draden in Ca2 +-vrije H-T oplossing in een petrischaal, en vervolgens het segment was gemonteerd op twee kaken van een myograph kamer (figuur 2A). Na het mounten van het segment, werden de twee draden aangepast om te worden parallel, dicht maar niet raken elkaar (figuur 2B). Voorafgaand aan de meting van de kracht, was het schip segment genormaliseerd en Potentiation tweemaal door High-K+ oplossing om het schip te stabiliseren. Tijdens de procedure van de normalisatie, werd het schip meerdere malen uitgerekt tot het bereiken van de waarde van100, IC en elke stretch cyclus opgenomen een robuuste contractie, snelle ontspanning en het onderhoud van een kracht in de 60 s (Figuur 3). De samentrekking van de vasculaire gladde spieren geïnduceerd door High-K+ oplossing meestal toonde twee fasen, een robuuste fase en een aanhoudende fase (Figuur 3). Het segment van het vaartuig kan worden gebruikt voor verdere experimenten alleen toe indien de High-K+-evoked contractie verschijnt normaal en reproduceerbaar. Een typische meting met de neoliensinine wordt weergegeven in Figuur 4. Wanneer de kracht spanning geïnduceerd door High-K+ een aanhoudende fase bereikt, we toegevoegd cumulatieve dosissen van neoliensinine (1, 2, 4, 6, 8 en 10 µM) door de gaten in de dekking van de kamer. Toen de doses toenam, verminderd de kracht op een dosis-afhankelijke manier. Het resultaat aangegeven dat neoliensinine is een vasculaire glad spierweefsel comfortabel stof die potentieel als een kandidaat-anti-hypertensie drug14 fungeert.
Figuur 1: een schematische voorstelling van arterial montage procedure. De blauwe lijnen vertegenwoordigen de draden en de rode rechthoek vertegenwoordigt de slagader. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: een muis mesenterische slagader segment gemonteerd op de kamer myograph. (A) een muis mesenterische slagader segment gemonteerd op twee kaken met behulp van twee stalen draden. De witte balk = 2 mm. (B) A microscopische opname van de gemonteerde muis mesenterische slagader segment in deelvenster (A). Zwarte balk = 0.5 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Vertegenwoordiger originele schetsen toont de normalisatie procedure en potentiëring door High-K+ oplossing. Na de tweede High-K+ stimulatie, de regelmatige experiment kan worden uitgevoerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: vertegenwoordiger tracering van muis mesenterische slagader die is opgelopen door High-K + oplossing en dan ontspannen door toevoeging van cumulatieve dosissen neoliensinine. Toen de doses toenam, de kracht op een dosis-afhankelijke manier verminderd Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hypertensie is een wijdverspreide volksgezondheid uitdaging vanwege de ernstige complicaties, met inbegrip van cardiovasculaire en nier-ziekten16. Begrijpen van de pathogenese van hypertensie en verkennen meer anti-hypertensieve drugs is geworden een dringende taak op dit gebied. Bloeddruk wordt gegenereerd en onderhouden door de perifere weerstand van het verkeer. Volgens Poiseuille van de wet, de relatief kleine slagaders genereren een groot deel van de bloedsomloop weerstand en dienen als de dominante producent van bloeddruk3,10. Meting van de weerstand tegen kleine slagaders in plaats van grote arteriën is dus meer geschikt voor studies van de bloeddruk. De draad myograph technologie is een van de beste modaliteiten te bestuderen van de fysiologische functies van kleine-weerstand slagaders en pathogenese van vasculaire ziekten.
De kleine schip wire myograph systeem is goed gedocumenteerd in andere verslagen en werd gebruikt voor het meten van de samentrekking van rat mesenterische slagaders8 en muis slagaders bijvoorbeeld de aorta9. Profiteren van genetische manipulatie, een scala aan ziekte en drug screening modellen, de muis is een veelgebruikt model dier op vele gebieden geworden. Derhalve hier, wij in staat gesteld een gewijzigde protocol van deze methode voor het meten van muis mesenterische slagader contractie. In dit verslag, we met succes de contractility van muis mesenterische slagaders met wijzigingen van de fundamentele buffers en montage stappen gemeten. Oplossingen met NaHCO3, zoals Krebs oplossingen, vele studies over ex vivo vasocontractility meting gebruikt om na te bootsen fysiologische zoutoplossing. Dergelijke buffers moeten echter CO2 aanpassen van de pH-waarde gedurende de meting, wat resulteert in de productie van CaCO3. We gekozen voor H-T-oplossing als de buffersysteem en vond dat het werkte goed. Aangezien temperatuur weinig effect op de pKeen waarde van HEPES heeft, de pH-waarde van de oplossing gunstig bij kamertemperatuur is aangepast en is onveranderd op 37 ° C- 17. Daarnaast gebruiken we Ca2 +-vrije H-T oplossing bij het begeleiden van de draden door het vaartuig lumen teneinde te voorkomen dat vaartuig vernauwing door Ca2 +. Een andere wijziging van dit protocol is de montage-procedure. Sommige verslagen8,9 en het apparaat handmatig5 aanbevelen de tweede draad na de vaststelling van de eerste draad op de kaak begeleiden. Wij vinden dat het werkt beter wanneer twee draden door het vaartuig lumen voor montage van het schip omdat deze methode kan het verminderen van eventuele schade van de transducer als gevolg van de beperkte kamer ruimte geleid.
Ondanks de hoge reproduceerbaarheid van deze methode, moeten wij meer aandacht besteden aan enkele belangrijke stappen. Het belangrijkste is om te voorkomen dat schade aan vaartuigen die zijn veroorzaakt door de Tang en schaar. Tijdens vaartuig dissectie, moet de exploitant gebruik van de verlostang zachtjes wanneer zich uitstrekt van het vetweefsel en gebruik de schaar zorgvuldig wanneer het snijden van het bindweefsel. Daarnaast klemmen van het vaartuig voor fixatie moet gebeuren zachtjes, en schade aan het endotheel bij het begeleiden van de draden, omdat het endotheel-beschadigde schip tot abnormale reacties, bijvoorbeeld leiden zalmoet worden vermeden. , het beschadigde schip toont duidelijk kracht spanning na stimulatie met acetylcholine, terwijl het normale schip een comfortabel effect toont. De verklaring voor dit fenomeen is dat het beschadigde endotheel stikstofmonoxide goed niet kan produceren. Merk op dat in het experiment met endotheel-gerelateerde contractie, de status van het endotheel voorafgaand aan kracht meting moet worden getest. We moeten daarnaast ook zorgvuldig het schip monteren op de kaken omdat de transducer is gemakkelijk beschadigd als toegepast met een vaste kracht. Tot slot, we meestal gebruik niet een constante increment-waarde op de micrometer bij het uitvoeren van de normalisatie. De waarde van de toename is in eerste instantie 30 of 20 µm en 10 µm na de effectieve druk bereikt 11-12 kPa. Deze methode kan verkorten van normalisatie en overstrekking, aldus verzachtende schip schade kan voorkomen.
Hoewel ons onderzoek op muis mesenterische slagaders gericht, kan deze methode ook worden gebruikt voor de aorta, de bronchiën, en andere kleine vaartuigen, met inbegrip van de renale, de hersenen en de pulmonary slagaders. Aangezien dit systeem vier kanalen omvat, is het handig voor het meten van vier parallelle monsters tegelijk. Bovendien een hele mesenterische vasculaire bed kan bieden ten minste vier slagader segmenten, het is dus heel gemakkelijk om te ontwerpen verschillende experimentele groepen. Volgens onze ervaring, elk segment slagader overleeft ten minste 4 uur en onderhoudt goede reacties op de High-K+ -oplossing over ten minste 6 herhalingen. Deze eigenschap is zeer nuttig voor metingen van de effecten van verschillende toevoegingen van verschillende kandidaat-drugs. Er zijn echter ook beperkingen aan de myograph wire systeem. De ex vivo draad myograph experiment is alleen in staat om te isometrische vasocontractility meten, maar het moet meestal worden gecombineerd met andere metingen voor complexe analyse van het schip.
Kortom beschreven we een methode voor het meten van isomere contractility in de muis mesenterische slagader met behulp van een multi-draad myograph systeem. Deze methode kan worden gebruikt ter beoordeling van de functies van vasculaire glad spierweefsel en scherm skeletspierrelaxantia van glad spierweefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Dr. Wei Qi He (Soochow Universiteit, Suzhou, China) en Dr. Yan Ning Qiao (Shaanxi Normal University, Xi'an, China) voor de technische bijstand. Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant 31272311, 81373295 en 81473420) en het Project gefinancierd door de prioriteit academische programma ontwikkeling van Jiangsu instellingen voor hogeronderwijs (Grant nr. ysxk-2016).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi wire myograph system | DMT | 610-M | |
| Stainless steel wire | DMT | 400447 | |
| Geuder dissection scissor | DMT | 400431 | |
| Dumont forceps | DMT | 300413 | |
| PowerLab/8SP | ADInstruments | ML785 | |
| Software | ADInstruments | LabChart 5 | |
| NaCl | SigmaAldrich | S5886 | |
| KCl | SigmaAldrich | P5405 | |
| CaCl2 | SigmaAldrich | C4901 | |
| MgCl2·6H2O | SigmaAldrich | M2393 | |
| D-Glucose | SigmaAldrich | G6152 | |
| HEPES | Sangon Biotech | A100511-0250 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045 | |
| DMSO | SigmaAldrich | D2650 |
References
- Bevan, J. A., Osher, J. V. A direct method for recording tension changes in the wall of small blood vessels in vitro. Agents and Actions. 2 (5), 257-260 (1972).
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260 (5552), 617-619 (1976).
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile Properties of Small Arterial Resistance Vessels in Spontaneously Hypertensive and Normotensive Rats. Circulation Research. 41 (1), 19-26 (1977).
- Mulvany, M. J., Nyborg, N. An increased calcium sensitivity of mesenteric resistance vessels in young and adult spontaneously hypertensive rats. British Journal of Pharmacology. 71 (2), 585-596 (1980).
- Mulvany, M. J. Procedures for investigation of small vessels using small vessel myograph. , Danish Myo Technology. Denmark. (2004).
- Halpern, W., Mulvany, M. J., Warshaw, D. M. Mechanical properties of smooth muscle cells in the walls of arterial resistance vessels. The Journal of Physiology. 275, 88-101 (1978).
- Michael, S. K., et al. High blood pressure arising from a defect in vascular function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (18), 6702-6707 (2008).
- Bridges, L. E., Williams, C. L., Pointer, M. A., Awumey, E. M. Mesenteric artery contraction and relaxation studies using automated wire myography. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- del Campo, L., Ferrer, M. Wire Myography to Study Vascular Tone and Vascular Structure of Isolated Mouse Arteries. , Springer. New York. (2015).
- Fisher, S. A. Vascular smooth muscle phenotypic diversity and function. Physiological Genomics. 42 (3), 169-187 (2010).
- Crowley, S. D., et al. Distinct roles for the kidney and systemic tissues in blood pressure regulation by the renin-angiotensin system. The Journal of Clinical Investigation. 115 (4), 1092-1099 (2005).
- Qiao, Y. N., et al. Myosin phosphatase target subunit 1 (MYPT1) regulates the contraction and relaxation of vascular smooth muscle and maintains blood pressure. The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22512-22523 (2014).
- He, W. Q., et al. Role of myosin light chain kinase in regulation of basal blood pressure and maintenance of salt-induced hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (2), H584-H591 (2011).
- Yang, G. M., et al. Isolation and identification of a tribenzylisoquinoline alkaloid from Nelumbo nucifera Gaertn, a novel potential smooth muscle relaxant. Fitoterapia. 124, 58-65 (2018).
- Slezák, P., Waczulíková, I., Bališ, P., Púzserová, A. Accurate Normalization Factor for Wire Myography of Rat Femoral Artery. Physiological Research. 59 (6), 1033-1036 (2010).
- Kearney, P. M., et al. Global burden of hypertension: analysis of worldwide data. The Lancet. 365 (9455), 217-223 (2005).
- Good, N. E., et al. Hydrogen Ion Buffers for Biological Research. Biochemistry. 5 (2), 467-477 (1966).
