Summary
このプロトコルは固体媒体で線虫の大規模栽培の方法をについて説明します。液体培養する代わりに、このプロトコルは、栽培プレート ベースの異なるスケールのパラメーターを取得できます。これは、液体と固体のメディア文化の形態と代謝の違いを省略することで結果の比較可能性を向上します。
Abstract
線虫(C. elegans) を寒天に大規模な方法で養殖は時間がかかり、困難にすることができます。このプロトコルでは、西部のしみ、質量分析法、またはさらにプロテオミクス解析を続行する蛋白質の分離のための動物の大規模な番号を取得する簡単で安価な方法について説明します。さらに、immunostainings の線虫の数の増加と同じ培養条件下で複数の解析の統合容易に達成します。さらに、異なる実験条件とプレート間の移動が促進されます。平板培養における一般的な技法白金線を使用して 1 つのc. の elegansの転送と住まれた寒天の転送チャンク メスします。ただし、線虫数増加に伴い、これらの技術に過度に時間がかかる。このプロトコルはc. の elegans多数の手順を含むワームの生理学的試料の影響を最小限に抑えるための大規模な文化をについて説明します。流体および剪断応力の寿命や線虫、こうして信頼性と再現性のある結果を取得するために重要な手順の詳細な説明を必要とする代謝過程を変更できます。線虫は最大 1/3 の神経細胞から成るが血管に欠けている、従って神経変化のみ血管制御の独立を検討する可能性を提供するモデル生物であります。最近では、早期の神経変性糖尿病網膜症は血管病変の前に発見されました。したがって、 c. の elegansは糖尿病合併症の一般的なメカニズムを研究するための特別な関心です。たとえばの高められた形成高度糖化最終製品 (年齢)、線虫に見られる再現性をもって、活性酸素種 (ROS) を観察しました。調査のより広いスペクトルのための適切なサイズのサンプルを処理するプロトコルは、糖尿病による生化学的変化の研究に代表されるここで、掲載されています。一般に、このプロトコルは大規模な線虫を必要とする研究に有用することができます番号とどの液体培養は適していません。
Introduction
西部のしみや質量分析法などのタンパク質解析タンパク質のミリグラムが必要です。この収量の線虫、洗濯によって液体培養または線虫を転送する固体メディア上を達成することができます何百もの大規模な養殖が必要です。流体とせん断応力は、ナトリウム、線虫の寿命を変えることと代謝解析1 に影響を与える可能性があるの増加の取り込みによる浸透圧ストレスを高めることができる上皮性ナトリウム チャネル (ENaC) の発現を誘導します。.したがって、プレート ベースのアプローチのこのプロトコルのいくつかの重要なステップは、アカウントに実験的変動に影響を与えるストレスの軽減を取る。液体培養は、他の一方で、線虫の表現型に影響を与えるし、文化と線虫2の正確な数のコレクションが複雑になります。さらに、反応生成物は、メディア コンポーネントによって変更することができ、線虫に達する前に均等に分散可能性があります。液体文化の制限については、このプロトコルはc. の elegansの大規模なサンプルを培養する方法を提供します。
線虫は 302 の神経細胞の異なるネットワークのモデル生物すべてのセル3の 3 分の 1 を構成します。多くの相同科学への導入以来オーソログ遺伝子の説明、医学研究のためのモデルとしてその値を増幅されています。最近では、糖尿病性網膜症、血管の損傷の前の神経学的な減損の証拠は4を提示されています。線虫は血管が欠けているが、血管のものから離れて神経の変化を調査するための適切なモデルを作るそれ異なる神経ネットワークが含まれています。したがって、 c. の elegansは糖尿病合併症の一般的なメカニズムを研究するための特別な関心です。糖尿病合併症の生化学的変化は、さらに高血糖5に応えて ROS の生成に及ぼす年齢の形成を含みます。年齢は線虫で発見され、神経損傷6に貢献。慢性疾患は、糖尿病合併症の評価をここで例示としてしばしば、メカニズムの評価のための多重アプローチを必要とする複雑なポリジーンのプロセスによって引き起こされます。このプロトコルは、だけでなく、その後複数のパラメーターを同時に、取得のための使用することができます。増加の比較と多重手法の再現性は、液体と固体のメディア文化の形態と代謝の違いを省略することで実現できます。
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Protocol
注: このプロトコルは、5 つのセクションに分かれています。セクション 1-3 大規模な線虫を培養する主なプロトコルが表示されます。セクション 4 と 5 は、糖尿病代謝で発生する例示代謝物の評価の追加のプロトコルを提供します。詳しくは、セクション 1 は板の一般的な大規模な文化について説明します。セクション 2 はc. の elegansの大量の転送に焦点を当てて説明 3 は、大規模なサンプルの収穫に対し。セクション 4 のサンプルの蛋白質の隔離およびセクション 5 以降の液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析 (MS/LCMS) 分析のための試料の前処理をについて説明します。
1. 大量培養プレート上
- 一般に、機能無菌フードの下にまたは汚染を避けるために開いた炎の横にあります。
-
文化にワーム若い大人の段階に達するまで次の適応を持つこの以前に発行された議定書7に従ってください。
- 生菌大腸菌OP50 を使用して線虫をフィードし、実験のため 400 μ M フルオロデオキシウリジン寒天 (アンピシリン/FUdR ではない) を準備します。
- 同期の人口の準備、未濃縮 OP50 を使用し、大人の実験が成功、上澄みの 70% を除去することによって集中 OP50 x 3.3 を使用します。
- 毎日の給餌間隔をお勧めします。酸化ストレスの評価、さまざまな間隔と授乳のためボリュームが結果と競合します。
- 接種、いくつか線虫とプレートを取り、メスで約 0.5 x 1 cm2の断片に切断します。未濃縮 OP50 を含む、直径 60 mm の線虫成長メディア (NGM) プレートの上に 2、3 個セットを転送します。
- ひずみ (野生型 N2 は 20 ° C で培養する必要があります) に適した温度で版を孵化させなさい卵が皿の上に表示されるまで。
- M9 バッファーの 2 mL で卵と大人の動物のほとんどを洗って 15 mL チューブでそれらを収集します。2 分間 800 x gの懸濁液を遠心します。一方、漂白液の準備を開始します。
- 遠心管を取り出すし、10 mL のピペットを使い、M9 バッファーを削除します。大人の線虫を分離まで渦の漂白のソリューションとミックスの 10 mL を追加します。これは通常約 5-7 分がかかりますが、15 分よりも長くしてはならない、または卵は実験後に完全に開発することはしません。
- 800 x gで 2 分間洗浄ソリューションを漂白から卵をクリアする 10 mL M9 バッファーで 3 回の懸濁液を遠心します。
- 今 OP50 プレートに卵の懸濁液の 150 μ L を追加します。200-300 卵の密度は各プレート上に達します。線虫大人の段階に達するまで待機します。
注: 描かれた実験用 M9 バッファー (pH 7.0) 以下の物質で構成されています: 22 ミリメートル KH2PO4、42 mM ナ2HPO4、および 86 mM の NaCl。オートクレーブ混合物後、1 mM MgSO4 を追加します。漂白液には 0.5 M NaOH、2.3 mM NaOCl を蒸留水で解決が含まれます。 - ワーム、およびそれらを収集するために 15 mL チューブを洗浄するカットと滅菌ピペット チップ先端不稔の M9 バッファーを準備します。
- プレートに約 1 mL の M9 バッファーを適用、プレートから線虫を振るとゆっくりピペットでバッファーを優しく配布。
- 今、管内線虫を収集します。カット ピペット チップで (OP50 でシード) プレートに直接サスペンションの 150 μ L を適用し、線虫の密度を病理組織学的評価 (推奨: 60 mm プレートごとの 50-100 線虫)。
- 密度が高すぎる場合は、目的の密度に達するまで顕微鏡で評価して M9 バッファーと懸濁液を希釈します。収量が少なすぎる場合、落ち着くか、遠心分離機の流体を削除する 800 x gで懸濁液 10 のワームをしましょう。
注: 十分な密度の例は、図 1 a (マクロスコ ピック) と 20 X 増強で (微視的) 1 bで与えられます。実証的に従って進んでください。 - ワームがすぐに落ち着くことを覚えてをおいてください。プレート間の等しい配分を確保するため、すべてのスタック プレート (4-5 版) の後チューブを反転します。
注: カット ピペットのチップとして穏やかな揺れと剪断応力を低減プレートの洗浄します。
2。転送の大量の線虫
- 年齢や板の乾燥によって、M9 はバッファーの約 500 μ L で線虫を洗浄します。同じバッファーを使用して、動物のほとんどが懸濁液で収集されるまで、線虫をデタッチを繰り返します。
- ゆっくりカット ピペット チップで線虫を取るし、OP50 でプレートに転送します。ドライ プレートができます。
注: 推奨される量よりはるかに多くを適用するないように気をつけてください。特に長期的な実験は、プレートがそれを許さない、亀裂にクロールする線虫をできるように、寒天が破ることができます。
3. 収穫大の線虫サンプル
- 選択した方法によってはc. の elegansの十分な量の実験を始めます。クロマトグラフィー-タンデム質量分析のサンプルあたり蛋白質の少なくとも 200 μ g の収量を確保するためプレートごと約 100 線虫を持つグループあたり 20 プレート (60 mm × 15 mm) を準備します。
注: プロトコルのこの部分は、線虫が収集され凍結としてはもう、無菌条件下で動作を必要ありません。 - サンプル コレクションの日に収集されたサンプルのスナップ-凍結液体窒素を準備します。マツ材線虫病の代謝を遅く氷の上の非滅菌の M9 バッファーを保持します。
- 1 mL の M9 バッファーを適用しプレートを軽く旋回プレートから線虫を洗浄します。ある場合、現在細菌や寒天を守るため故人線虫とほとんどの卵の収集を回避できます。
- ボリュームを取るし、15 の mL の管にそれを転送します。
- 完全なサンプルのコレクションの後、解決または 800 x gで簡単にチューブを遠心し、M9 バッファーの大部分を除去する線虫を待ちます。サンプル 3 を洗って約 10 ml の M9 の x (サンプル ボリューム x 10) 細菌を除去します。
注: すべての故人線虫が削除されていることを確認するには、ショ糖浮遊は別オプションです。ただし、これは表示されている実験15不向きでした。ショ糖はブドウ糖と果糖に加水分解します。描かれた実験でグルコースの役割は、持病の糖尿病の生化学的変化を促進するために評価されました。したがって、ショ糖浮遊可能性のある結果を混同できます。 - すべてのサンプルの 1 mL の M9 バッファーと 1 つの 1.5 mL チューブと 1 つの空の 1.5 mL チューブを準備します。空の 1.5 mL のチューブに 15 mL チューブからガラス ピペットを使い、ペレットを転送します。この手順は、定量的な伝達を確保することが重要です。
注: とは異なり、以前のステップの間にここで線虫より集中しています。プラスチック ピペット先端への可能な付着、によりサンプルの大きい部分の損失が予想されます。したがって、ガラス ピペットを代わりに使用します。 - 転送後、ピペットの壁から線虫をリンスに 1 mL の 2 番目の 1.5 mL のチューブから M9 バッファーを取るガラス ピペットを使用します。また、15 mL チューブから残りの線虫を洗って、サンプル チューブに転送します。
- 19,000 × gで 1 分でサンプル チューブを遠心分離機、可能な限りの上澄みを取り外します。
- パラフィルムでチューブをシールとすぐに液体窒素でスナップ-凍結するそれ。ライセート作製まで-80 ° c チューブを格納します。
4. 質量分析のため蛋白質の隔離
注: ここで説明した蛋白質の隔離を (例えば、西部のしみ) 他のアッセイに使用もできます。
- 凍結サンプル 0.5 mm ジルコニア ビーズ、少なくとも 2 倍のプロテアーゼ阻害剤のカクテルを含む溶解バッファーのボリュームの同じボリュームを追加します。
注: 描かれている線虫蛋白質に相関分析を行ったバッファーの 100 μ L を使用します。LC ・ MS/MS サンプル バッファーの 200 μ L に溶解し。 - 9 の速度で 1 分間ホモジナイザーを開始します。サンプルが完全に分離することを確認します。彼らは完全に分離していない場合は、この手順を繰り返します。
- 19,000 x gで 4 ° C で 30 分間試料を遠心します。氷の上清を新しいチューブに転送、測定をとるつもりがさらにまで-80 ° C で保存できます。
注: 描かれた実験用非変性バッファーは以下の物質で構成されています: 20 mM トリス塩酸 (pH 8)、137 mM NaCl、1% トリトン X、2 ミリメートルの EDTA。
注: は、このプロトコルの推奨スケールを適用した手順に従ったこと、約 1,000 の線虫から蛋白ペレットの収量は約 500 μ g をする必要があります。多くの比較図 2および代表の結果を参照してください。
5. 液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法による測定の前処理
注: 興味のパラメーターに応じて、サンプル準備が異なります。このプロトコルは、メチルグリオキサールや年齢の決定に焦点を当てください。
-
上記9として 1, 2-diaminobenzene (DB) 誘導体化による細胞内メチルグリオキサールを測定します。
- 冷たい 20% (重量/巻) トリクロロ酸塩化ナトリウム 0.9% (重量/巻) の 20 μ L と 1.5 mL チューブの水の 80 μ L 試料をホモジナイズしてください。
- スパイク内部標準の 5 μ L のサンプル (13C3MG; 400 nM)、ボルテックス、それらをミックスし、4 ° C で 5 分間 21,000 × gで遠心分離
- 上澄みの 35 μ L を高速液体クロマトグラフィーのサンプルのバイアル 200 μ L ガラス挿入に転送します。
- 0.5 mM DB 200 mM HCl 含む 0.5 mM ジエチレントリアミン酸 (DETAPAC) の水の 10 μ L の順に各サンプルに 3% アジ化ナトリウム (wt/巻) の 5 μ L を追加します。
- 光から保護部屋の温度で 4 時間サンプルをインキュベートします。
- 上記9LC-MS/MS による試料を分析します。
注: 年齢の測定プロトコルのセクション 4 で説明したよう、蛋白質を分離します。
-
ブラッドフォードの試金10を使用して (解凍) 溶解液のタンパク質濃度を測定します。
- ウシ血清アルブミン (BSA) リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 以下の濃度の解決とスパイク標準曲線の 30 μ L の因数を準備: 0;0.1 となります。0.2;0.3;0.4;0.6;0.8;1.0 Mg/dl。
注: 推奨されるサイズ サンプル調製した場合 (バッファーの 200 μ L でライセートの調製手順 4.1 を参照)、推定濃度は、およそ 2 – 7 mg/mL の範囲でする必要があります。この場合、希釈、サンプル 1:10 PBS で、測定前にします。
注: このメソッドを使用して最初の実験は勧め異なる希釈率のサンプルを測定する (1、1:10 と 1: 100)。線虫の数の厳密な決定は、個々 の研究者間収量できます異なります。 - 透明の 96 ウェル プレート (ポリスチレン) を使用して、各標準濃度と井戸に重複で選ばれた希釈サンプルの 10 μ L をピペットします。
- 希釈、タンパク質アッセイ色素試薬の集中 1:5 蒸留水 (aq。dest)希釈の 200 μ L をプレート上のすべてのサンプルに追加します。板室温で 10 分間、インキュベートします。
- 595 で 30 分以内で吸光度を測定プレート リーダーの nm。サンプルは、計算された標準曲線から補間することができます。メソッドの詳細については、文献10に広く記載されています。
- ウシ血清アルブミン (BSA) リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 以下の濃度の解決とスパイク標準曲線の 30 μ L の因数を準備: 0;0.1 となります。0.2;0.3;0.4;0.6;0.8;1.0 Mg/dl。
-
前述11,12として細胞年齢を測定します。
- 総蛋白抽出物 (約 200 μ g) を洗う遠心遠心ろ過単位 10 kDa によって水で 3 倍。
- 回復されたタンパク質 (約 100 μ L) を 10 μ L の 100 mM 塩酸、ペプシン (20 mM 塩酸で 2 mg/mL) の 10 μ L、チモール (2 mg/mL で 20 mM HCl) の 10 μ L を追加し、37 ° C 24 時間でサンプルをインキュベートします。
- 中和し、ph 7.4 0.5 M カリウム リン酸バッファー (pH 7.4) の 12.5 μ L を追加することによって、サンプルをバッファーと 260 mM コの 5 μ L。
- プロナーゼ E [10 mM カリウム リン酸バッファー (pH 7.4) に 2 mg/mL] の 10 μ L を追加し、ペニシリン ・ ストレプトマイシン液の 10 μ L 24 h 37 ° C でサンプルをインキュベートし、。
- アミノペプチダーゼ [10 mM カリウム リン酸バッファー (pH 7.4) に 2 mg/mL] の 10 μ L を追加し、プロリダーゼ [10 mM カリウム リン酸バッファー (pH 7.4) に 2 mg/mL] の 10 μ L 48 h の 37 ° C でサンプルをインキュベートし、。
- 上記12- MS LC/MS による、結果として得られる加水分解物を分析します。
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Representative Results
ここで大規模な線虫の作成例文化の糖尿病研究のアプリケーションに渡されます。総蛋白濃度を正常化するのではなく、パラメーターを 1 つの動物に関連する関心のことです。線虫の数が少ないを必要とする試金、これ簡単に達成できます、線虫をカウントすることによって。大規模な線虫の実験グループごと線虫の数百人を文化、この方法は便利です。図 2線虫 c. エレガンスの量とタンパク質含量との相関を示しています。ここに示されているように、このプロトコルを使用して再現性のある量的蛋白質分離を実現できます。
アマドリ フルクトシルアミノ リジンを付加体中に形成されたいくつかの年齢の前駆体である実験動物の糖尿病モデル13。図 3では、12 日古い線虫と 3 つの独立した実験からの未処理のコントロールの年齢をマッチさせたブドウ糖治療後 LC ・ MS/MS 測定が表示されます。線虫が溶解バッファーの 200 μ L 添加の均質化。フルクトシルアミノ リジン高血糖治療の提示後形成増加。
メチルグリオキサールなど反応性代謝物変動、タンパク質をすばやく変更14。そのため、それらの反応性代謝物は実際に体内蓄積か、彼らのターゲットに達する前に変更するかどうか疑問が残る。図 4は、線虫のメチルグリオキサールの蓄積物質の投与後を確認します。
高血糖6中、せん断応力中と同様、酸化ストレスが増加します。図 5には、転送プロトコルのセクション 2 のように、ブドウ糖投与群と非転送グループ酸化ストレスの形成の違いを確認なし。コントロール群にグルコース処理の両者の比較は、ブドウ糖による酸化ストレスの大幅な増加を示しています。対照的に、2 つのブドウ糖投与群間に有意差が認められなかった。これらの結果は、このプロトコルを使用して線虫の処理はない大幅形成を誘導する、酸化ストレス、老化や代謝の調査で交絡因子となることができるを示しています。また、現在の文献の調査結果は、このプロトコルを使用して再現されました。
図 1: 線虫プレート上さらに分布のための十分な密度。(A) このパネルは、巨視的なビューを示しています。(B) このパネルは、20 X 増強で顕微鏡ビューを示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: たんぱく野生型のc. の elegans N2 。これは 5 の 12 日古い線虫のプロトコル セクションの説明に従って準備パネル ライセート、蛋白質収量に線虫の数の相関関係を示しています(n = 3; 500 線虫のライセートn = 3; 1,000 線虫のライセートn 1 1,500 線虫のライセートを =)。回帰直線は、赤で示されます (r2 = 0.976、 y = 0.64)。総蛋白濃度は、ブラッドフォード法を用いて測定しました。データは、平均 ± 標準偏差 (SD) として表されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 増加線虫N2 のブドウ糖投与後におけるフルクトシルアミノ リジン。12 日古い線虫と未処理のコントロール中のブドウ糖投与後フルクトシルアミノ リジン濃度は MS LC/MS による決定され、ブラッドフォード法によるタンパク質濃度に正規化します。データは、平均 ± SD. として表されます。P-値に定められた学生のt-テスト、* *p < 0.01。結果は、3 つの独立した実験からです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 細胞内メチルグリオキサール濃度c. の elegans N2 のメチルグリオキサール治療後。メチルグリオキサールで治療 12 日古い線虫の MS LC/MS によるメチルグリオキサール濃度を測定しました。最後の治療後 2 時間未満を採取されました。データは、線虫の数に正規化された平均 ± SD として表されます。P-値に定められた学生のt-テスト、* *p < 0.01。結果は、3 つの独立した実験からです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 酸化ストレスは血糖値治療後線虫CL2166 で測定されます。遺伝子組換えCL2166 (gst4::GFP)8グルタチオン-S-トランスフェラーゼ 4 プロモーター駆動型 GFP レポーターを含むが 2 d のためのブドウ糖を含む 400 μ M FUdR プレートで培養しました。1 つのグループは、このプロトコルのセクション 2 の説明に従って 1 日目に新鮮なグルコース プレートに移されました。酸化ストレスは、蛍光プレート リーダーと [相対光単位 (RLU)] の増加として測定しました。データは、平均 ± SD. として表されます。P-値は分散分析, 定められた *p < 0.05。結果は、3 つの独立した実験からです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、定量的な結果を得るためのc. の elegansの大規模養殖のための信頼性の高い方法を示します。文献からの知見は、代表の結果に示すように、レプリケート可能性があります。にもかかわらず、 c. の elegansの大規模なサンプルのコレクションのこのプロトコルはストレート フォワード法のように思える、考慮する点があります。線虫密度の同期に関するこのプロトコルは、線虫を破壊し、もっぱら卵を収穫する亜塩素酸ナトリウムと水酸化ナトリウムと人口を漂白によるアプローチについて説明します。このアプローチはすべての実験に適したかもしれない考慮に入れなければなりません。人口規模漂白液の量との比によって漂白液の害を与える効果胚15の開発に影響します。発達過程を勉強して場合は特にこれは重要なステップ可能性があります。、線虫の取扱いに関するプロトコルを通してできるだけ小さなせん断力として適用することが重要です。注意して処理されない、線虫の数が多いが滅びる。さらに言えば、回転時間と速度を超えないように重要です。線虫を転送する際は、負傷した線虫の数を減らすためにカットのピペット チップを使用ください。線虫の転送バッファーの推奨量超えることができない、湿気が多すぎる、線虫のプレートに掘る機会を与えるなったら寒天が割れることがありますので。サンプルを収集しながら M9 バッファーはc. の elegansを劣化させる代謝物または基板を扱う場合に特に線虫の代謝を遅くように冷たい保たれなければなりません。前の餌から任意の細菌汚染を最小限に抑えるために徹底的にサンプルを洗浄することが重要です。ペレットを転送する際は、ワームの多くがプラスチックのピペット チップに固執することを覚えてください。でも低結合ピペット チップ サンプルの大規模な量を保つことができるよう、推奨されるガラス ピペットを使用ください。代わりに、M9 バッファーするトリトン X100 はかつて 0.01% 添加推奨16.故人の線虫や細菌は結果を影響しないようにショ糖浮遊線虫のコレクションをすることができます後は14を実行しました。メディアを削除する液体培養後これは通常です。この実験でショ糖はブドウ糖と果糖、我々 の結果をこうして潜在的交絡に代謝されるので、このクレンジングは省略。
通常、線虫の大量培養が液体のメディアを使用して実行されます。液体培養ただし、適していないすべての実験設定特に線虫の正確な数値を必要とするリードアウトを使用する場合。Baerman 装置の変更は並べ替えおよび液体文化17から派生した線虫を浄化する述べた。このメソッドは大きく細菌汚染を削減し、複数コンポーネント フィルター システムを介してのみ大人線虫をフィルターします。このエレガントな方法は、代謝解析を混乱させることができる、常温で長いフィルタ リング時間 (2-6 h) によって制限されます。フィルタ リングの手法としては線虫の移動活動を並べ替えられます。線虫は、する必要があります異なる材料からフィルターの細孔を介して独立していないクロールするのに十分収まります。このように、結果は、実験的治療によって弱体化、線虫を除外することによって歪め。
単一の実験的デザインで液体とプレートの文化を組み合わせることも、後の分析で交絡因子となります。線虫は、質量、蛋白質含量や体の長さと幅の2に正規化パラメーターを比較し難い液体培養で細くて長い表現を開発しています。また、反応性物質の研究は、反応物質は変更またはメディア コンポーネントによって、線虫に達する前に不活化可能性が高いので液体培養に挑戦です。線虫 c. エレガンスの大規模なサンプルは、このプロトコルで取得できる、にもかかわらず板文化そのものは液体培養よりもより労働集約的です。ただし、(例えば、寒天培地分注機を用いる) の処理を容易にする特定の方法があります。効率的に大規模な文化を促進するために別のオプションより大きな直径のペトリ皿の寒天の生産のための使用です。このオプションは、後続の分析による制約をことがあります。微視的評価またはプレート処理の概要、設備を皿の直径を小さきます。
化学物質や薬剤のスクリーニングなど、さまざまなパラメーターの評価に適した複数の高スループット方法がされている開発および検討18。マイクロ流体デバイスは、2 型糖尿病19のモデルに示すようにさまざまなパラメーターを研究に研究を許可します。寿命、脂質代謝、酸化ストレス応答同時に評価できます単一動物レベルで生化学的な情報表現を統合する高コンテンツ スクリーニングの利点を明らかに。現在の文献の再現性と信頼性評価は既に概念実証研究18を越えて行く、これらの技術の偉大な洗練されたを示しています。特に小さい所のための手頃な価格まだデバイスは多くの場合高価であることが判明することができます実験のニーズに合わせてカスタマイズすることが、問題は残ります。
線虫 c. エレガンスの年齢の定量化は線虫の不浸透性のキューティクルで複雑です。一般的に使用されるメソッドは、蛍光染色による年齢6の検出です。キューティクルのため結果の高分散を抑える大きなサンプル サイズが必要です。画像は、時間のかかる要因として考慮されます。
ここで説明した全身ライセート調製のためのプロトコル細胞年齢と線虫の他のコンポーネントにアクセスできます解析。14前にc. の elegansの LC ・ MS/MS 測定を行った。適切な培養条件、ただし、線虫の十分な数を達成するためがまだ記載されていない、詳細に。
このプロトコルで説明されているメソッド読み出し大規模ゆく成長人口c. の elegansのまたは複数読み出し実験あたりの組み合わせを必要とするため便利です。糖尿病とその合併症など複雑な多因子疾患の勉強のために特に便利です。マイクロ流体システムを用いた高スループットと高コンテンツのスクリーニングなどの代替アプローチはより高度な技術とより大きいサイズのデータを提供することができます。主な応用は、化学と創薬スクリーニングまたは変異体の実験的治療への応答の遺伝学的スクリーニングで現在見ることが。このプロトコルが容易そして安く高級現在実験的読み出しの調整を必要とせず、現在または将来のプロジェクトのサイズと研究者を助け、したがって、任意の時間の損失を最小限に抑えるために関連付けられているの確立新しいメソッド。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
本研究は、ドイツ研究振興協会 (DFG) IRTG 1874「糖尿病性血管合併症」と CRC 1118「糖尿病合併症の原因として反応性代謝物」によって支持されました。線虫株 N2 と CL2166 は、CGC、研究インフラ プログラム (P40 OD010440) の NIH のオフィスによって資金が供給されるによって提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli OP50 | CGC | n/a | |
| C. elegans N2 | CGC | n/a | |
| C. elegans CL2166 | CGC | n/a | |
| Petri dish, 60 mm x 15 mm | Greiner One | 628161 | |
| Volumetric pipet, glas, 10 mL | Neolab | E-0413 | |
| Proteinase inhibitor cocktail tablets | Roche | 04693124001 | |
| Non-denaturing lysate buffer: | |||
| Tris-HCl, pH 8 | Sigma | T3253 | |
| Sodiumchloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E5391 | |
| 96-well plates, transparent bottom | Brand | 781611 | |
| Infinite M200, plate reader | Tecan | 30017581 | |
| Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm | Next advance | ZROB05-RNA | |
| Bullet Blender, homogenizer | Next advance | BBX24 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P6887 | |
| Thymol | Sigma | T0501 | |
| Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P6911 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P43339 | |
| Prolidase from Porcine Kidney | Sigma | P6675 | |
| Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica | Sigma | A8200 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Merckmillipore | UFC501096 | |
| Basic Materials for plate culture are described in Reference 6. |
References
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