Summary
Denne protokol beskriver en metode til storstilet dyrkning af Caenorhabditis elegans på solid media. Som et alternativ til flydende kultur, giver denne protokol mulighed for at opnå parametre af forskellige skalaer under plade-baseret dyrkning. Dette øger sammenligneligheden af resultater ved at udelade de morfologiske og metaboliske forskelle mellem flydende og fast MedieKultur.
Abstract
Dyrkning Caenorhabditis elegans (C. elegans) på en omfattende måde på agar plader kan være tidskrævende og vanskelig. Denne protokol beskriver en simpel og billig metode til at opnå et stort antal dyr til isolering af proteiner til at gå videre med en vestlige skamplet, massespektrometri eller yderligere proteomics analyser. Desuden kan en stigning på nematodeprøveudtagning tal for immunostainings og integration af flere analyser på samme dyrkningsbaserede betingelser nemt opnås. Derudover er en overførsel mellem plader med forskellige forsøgsbetingelser lettet. Almindelige teknikker i plade kultur indebærer overførsel af en enkelt C. elegans med platin stålwire og overførsel af befolkede agar bidder ved hjælp af en skalpel. Men med stigende nematodeprøveudtagning, disse teknikker bliver alt for tidskrævende. Denne protokol beskriver den storstilede kultur af C. elegans herunder talrige skridt til at minimere virkningen af prøveforberedelse om fysiologi af ormen. Væske og shear stress kan ændre levetid og metaboliske processer i C. elegans, hvilket kræver en detaljeret beskrivelse af de kritiske trin for at hente pålidelige og reproducerbare resultater. C. elegans er en model organisme, bestående af neuronale celler op til en tredjedel, men mangler blodkar, hvilket giver mulighed for at undersøge udelukkende neuronale ændringer uafhængigt af vaskulære kontrol. For nylig, tidlig neurodegeneration i diabetisk retinopati blev fundet før vaskulære ændringer. Således er C. elegans af særlig interesse for at studere generel mekanismer af diabetiske komplikationer. For eksempel, en øget dannelse af avanceret glykering slutprodukter (alder) og reaktive ilt arter (ROS) er observeret, som reproducerbar findes i C. elegans. Protokoller til at håndtere prøver af passende størrelse for et bredere spektrum af undersøgelser præsenteres her, eksemplificeret ved studiet af diabetes-induceret biokemiske ændringer. Generelt denne protokol kan være nyttige for undersøgelser som kræver stor C. elegans numre og i hvilken flydende kultur er ikke egnet.
Introduction
Protein analyser, såsom en vestlige skamplet eller massespektrometri, kræver milligram af protein. Dette udbytte kræver en storstilet dyrkning af hundredvis af C. elegans, som kan ske enten ved flydende kultur eller på solid media overførsel af nematoder ved vask. Væske og shear stress inducerer udtryk af epitel natrium kanaler (ENaC), som kunne øge osmotisk stress gennem en øget udbredelse af natrium, potentielt ændre levetiden for C. elegans og påvirke metaboliske analyser1 . Derfor tage nogle vigtige skridt i denne protokol for den plade-baserede tilgang reduktion af stress påvirker eksperimentel variation i betragtning. Flydende kultur, på den anden side påvirker Fænotypen af Nematoderne og komplicerer kultur og samling af en eksakt række nematoder2. Derudover reaktive stoffer kan ændres af medier komponenter og kan distribuere ujævnt før de når nematoderne. Med hensyn til begrænsningerne af flydende kultur giver denne protokol en alternativ tilgang til dyrkning af store prøver af C. elegans.
C. elegans er en model organisme med en særskilt netværk af 302 neuronale celler, der udgør en tredjedel af alle dens celler3. Siden introduktionen i videnskab, mange homologe og orthologous gener er blevet beskrevet, forstærke dens værdi som en model for medicinsk forskning. For nylig, er blevet forelagt beviser for neurologiske værdiforringelse i diabetisk retinopati, forud vaskulære skader,4. C. elegans mangler blodkar, men indeholder en særskilt neuronal netværk, hvilket gør det en passende model til at undersøge neuronale ændringer bortset fra vaskulære ones. Således er C. elegans af særlig interesse for at studere generel mekanismer af diabetiske komplikationer. Biokemiske ændringer i diabetiske komplikationer involverer dannelsen af aldre, som yderligere indflydelse på dannelsen af ROS i svar til hyperglykæmi5. Alderen findes i C. elegans og bidrage til neuronal skade6. Kroniske sygdomme er ofte forårsaget af komplekse, polygeniske processer der kræver en multiparametric tilgang til vurdering af deres underliggende mekanismer, som eksemplificeret her vurdering af diabetiske komplikationer. Denne protokol kan være til nytte for at opnå flere parametre samtidigt, samt efterfølgende. Øget sammenlignelighed og reproducerbarhed af en multiparametric tilgang kan opnås ved at udelade de morfologiske og metaboliske forskelle mellem flydende og fast MedieKultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Denne protokol er opdelt i fem afsnit. I afsnit 1-3, præsenteres de vigtigste protokol til kultur C. elegans på en storstilet. Afsnit 4 og 5 giver tillægsprotokollerne til vurdering af eksemplificeret metabolitter forekommer i diabetisk metabolitter. Detaljeret beskrives afsnit 1 en generel omfattende kultur på plader. Afdeling 2 fokuseres på overførsel af store mængder af C. elegans, mens afsnit 3 forklarer høst af en omfattende stikprøve. Afsnit 4 forklarer protein isoleret fra prøven og afsnit 5 beskrives prøveforberedelse til efterfølgende liquid chromatography-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) analyser.
1. omfattende kultur på plader
- I almindelighed Arbejd under en steril hætte eller ved siden af en åben flamme til at undgå kontaminering.
-
Kultur orme indtil de når den unge voksne stadium, Følg denne tidligere udgivne protokol7 med følgende tilpasninger.
- Bruge levende Escherichia coli OP50 bakterier at fodre Nematoderne og forberede eksperimenter 400 µM fluorodeoxyuridine agar (ikke ampicillin/FUdR).
- Forberedelsen af en synkron befolkningen bruge ikkekoncentreret OP50, og for efterfølgende eksperimenter med voksne, bruge 3.3 x koncentreret OP50 ved at fjerne 70% af supernatanten.
- Daglige fodring intervaller er anbefalet. Ved vurderingen af oxidativt stress, kan forskellige intervaller og mængder til fodring interferere med resultaterne.
- Til podning, tage en plade med flere nematoder og skæres i stykker af ca. 0,5 x 1 cm2 med en skalpel. Overføre to til tre stykker på ødelægge vækst medier (NGM) plader på 60 mm i diameter, der indeholder ikke-koncentreret OP50.
- Inkuber plader ved den temperatur, der er egnet til stammen (vildtype N2 skal være kulturperler ved 20 ° C) indtil æggene er synlige på tallerkenen.
- Vaske af de fleste af de æg og voksne dyr med 2 mL af M9 buffer og samle dem i en 15 mL tube. Der centrifugeres suspension ved 800 x g i 2 min. I mellemtiden, begynde at forberede den blegning løsning.
- Tag centrifugeret røret og fjerne M9 buffer med en 10 mL pipette. Der tilsættes 10 mL af blegning løsning og mix på vortex indtil de voksne rundorme er mængden. Det tager normalt ca. 5-7 min, men bør ikke tage længere tid end 15 min eller æg vil ikke udvikle fuldt ud senere på i eksperimentet.
- Der centrifugeres suspension ved 800 x g i 2 min. vask 3 gange med 10 mL M9 buffer til at fjerne æg fra blegning løsning.
- Nu tilføje 150 µL af æg suspension på OP50 plader. En tæthed på 200 – 300 æg bør nås på hver plade. Vent, indtil nematoder nåede det voksne Stadium.
Bemærk: M9 buffer (pH 7,0) brugt til at afbillede eksperimenter består af følgende stoffer: 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4og 86 mM NaCl. Efter autoklavering blandingen, tilsæt 1 mM MgSO4. Blegning løsning indeholder 0,5 M NaOH, 2,3 mM NaOCl løst i destilleret vand. - Forberede sterile M9 buffer, steril pipette tips med et snit tip til at vaske af orme og 15 mL rør til at indsamle dem i.
- Anvende ca. 1 mL af M9 buffer på pladerne, forsigtigt distribuere bufferen ved at svinge og forsigtigt afpipetteres nematoder ud på pladen.
- Nu, samle nematoder i røret. Anvend 150 µL af suspension direkte på pladerne (seedet med OP50) med cut pipette tips, og evaluere mikroskopisk tætheden af Nematoderne (anbefalet: 50 – 100 nematoder pr. 60 mm plade).
- Hvis de er for tætte, fortyndes suspension med M9 buffer og evaluere det under mikroskopet, indtil den ønskede tæthed er nået. Hvis udbyttet er for lidt, lad orme slå sig ned eller centrifugeres suspension 10 s ved 800 x g til at fjerne væske.
Bemærk: Et eksempel på en tilstrækkelig tæthed gives i figur 1A (makroskopisk) og 1B (mikroskopiske) på 20 X augmentation. Fortsætte empirisk som beskrevet. - Holde inde indre at ormene bundfælde sig hurtigt. For at sikre en ligelig fordeling mellem pladerne, vend røret efter hver stak af plader (4 – 5 plader).
Bemærk: Cut afpipetteres tip, samt blid svingende og vask af pladerne, reducerer shear stress.
2. overførsel af store mængder Caenorhabditis elegans
- Vaske af nematoder med ca. 500 µL af M9 buffer, afhængigt af alder og tørhed af pladerne. Bruger den samme buffer, Gentag afmontering af nematoder, indtil de fleste af dyr, der er indsamlet i suspension.
- Langsomt tage op nematoder med cut pipette spids og overføre dem på en tallerken, tilberedt med OP50. Lad pladen tørre.
Bemærk: Vær forsigtig ikke at anvende meget mere end den anbefalede mængde. Især i langsigtet eksperimenter, pladerne kan ikke tåle det og agaren kan bryde, tillader nematoder at kravle ind i sprækkerne.
3. høst af en stor Caenorhabditis elegans prøve
- Afhængigt af den valgte metode, skal du starte eksperimenter med en tilstrækkelig mængde af C. elegans. For LC-MS/MS analyse, forberede 20 plader (60 mm x 15 mm) pr. gruppe med ca. 100 nematoder pr. plade til at sikre et udbytte på mindst 200 µg af protein pr. prøve.
Bemærk: Denne del af protokollen kræver ikke arbejder under sterile forhold mere, da Nematoderne bliver indsamlet og frosset. - På dagen for samlingen prøve, forberede flydende kvælstof til snap-fryse de indsamlede prøver. Holde ikke-sterile M9 buffer på isen for at bremse den nematode stofskifte.
- Vaske af C. elegans fra pladerne ved at anvende 1 mL af M9 buffer og forsigtigt hvirvlende pladerne. Derved undgår du indsamle afdøde nematoder og de fleste æg, hvis der er nogen til stede, fordi de holder sig til bakterier og agar.
- Tage op for lydstyrken og overføre det til en 15 mL tube.
- Efter samlingen af komplet prøven, vente på nematoder at bosætte sig eller centrifugeres tube kortvarigt på 800 x g og fjerne det meste af M9 buffer. Vaske prøve 3 x med ca. 10 mL M9 (10 x sample volumen) til at fjerne eventuelle bakterier.
Bemærk: For at sikre, at alle afdøde nematoder er fjernet, saccharose flydemidler er en anden mulighed. Dette var dog ikke egnet til de viste eksperimenter15. Saccharose er hydrolyseres til glukose og fruktose. I de afbillede eksperimenter, blev rolle af glukose vurderet til at fremme biokemiske ændringer fundet i kroniske diabetes. Således kunne saccharose flydemidler potentielt forvirre resultaterne. - Forberede en 1,5 mL rør med 1 mL af M9 buffer og en tom 1,5 mL tube for hver prøve. Overføre pellet med et glas med pipette overfoeres fra 15 mL tube til tomme 1,5 mL tube. Dette trin er afgørende for at sikre en kvantitativ overførsel.
Bemærk: I modsætning til under forrige trin, her Nematoderne er mere koncentreret. På grund af en eventuel tilslutning til plast pipette tips forventes tab af en stor del af prøven. Derfor bruge glas pipetter i stedet. - Efter overførslen, skal du bruge glas pipette til at tage op 1 mL af M9 buffer fra den anden 1,5 mL tube at skylle nematoder fra pipette væg. Også vaske de resterende nematoder fra 15 mL tube og overføre dem til prøveglas.
- Der centrifugeres prøveglas på 19.000 x g i 1 min og så meget supernatanten som muligt.
- Forsegle tube med Parafilm og straks snap-fryse det i flydende kvælstof. Gemme rør ved-80 ° C indtil lysate forberedelse.
4. protein Isolation for massespektrometri
Bemærk: Protein isolation beskrevet her kan også bruges til andre assays (f.eks., vestlige skamplet).
- Den frosne prøve, tilføje de samme mængder af 0,5 mm zirkonium oxid perler og mindst 2 x mængden af lysate buffer indeholdende en proteinase hæmmer cocktail.
Bemærk: De afbillede nematoder til protein korrelation analyser blev udført ved hjælp af 100 µL af buffer. LC-MS/MS prøver var mængden med 200 µL af buffer. - Start homogeniseringsapparat for 1 min på hastighed 9. Sikre, at prøverne er helt mængden. Gentag dette trin, hvis de ikke er fuldt mængden.
- Der centrifugeres prøver i 30 min. ved 4 ° C på 19.000 x g. Overføre supernatanten til en ny tube på is og opbevare det ved-80 ° C, indtil yderligere målinger vil blive taget.
Bemærk: Den ikke-denatureringen buffer, der bruges til de afbillede eksperimenter består af følgende stoffer: 20 mM Tris HCl (pH 8), 137 mM NaCl, 1% Triton-X og 2 mM EDTA.
Bemærk: Efter at have fulgt trinene i denne protokol og efter at have anvendt den foreslåede skala, bør udbyttet af et protein pellet fra cirka 1.000 nematoder være ca 500 µg. For flere sammenligninger, konsultere figur 2 og Repræsentative resultater.
5. prøven forberedelse for Liquid Chromatography-tandem massespektrometri målinger
Bemærk: Afhængigt af parameteren af interesse, at prøveforberedelsen vil variere. Denne protokol fokuserer på methylglyoxal og alder beslutsomhed.
-
Måle intracellulær methylglyoxal af forædling med 1,2-diaminobenzene (DB) som tidligere beskrevet9.
- Homogeniseres prøver med 20 µL iskold 20% (wt/vol) trichloreddikesyre i 0,9% (wt/vol) natriumchlorid og 80 µL vand i 1,5 mL rør.
- Spike prøver af 5 µL med den interne standard (13C3-MG, 400 nM), bland dem med vortexing, og derefter centrifugeres dem på 21.000 x g i 5 min. ved 4 ° C.
- Overføre 35 µL af supernatanten til HPLC prøve hætteglas indeholdende en 200 µL glasindsats.
- Tilføj 5 µL af 3% natriumazid (wt/vol.) til hver prøve efterfulgt af 10 µL af 0,5 mM DB i 200 mM HCl indeholdende 0,5 mM diethylenetriaminepentaacetic syre (DETAPAC) i vand.
- Inkuber prøver i 4 timer ved stuetemperatur, beskyttet mod lys.
- Analysere prøver af LC-MS/MS, som tidligere beskrevet9.
Bemærk: Måling af aldre, isolere proteiner som beskrevet i punkt 4 i protokollen.
-
Måle proteinkoncentration af den (optøede) lysates ved hjælp af en Bradford assay10.
- Forberede en standardkurve, der er tilsat bovint serumalbumin (BSA) løst i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) af følgende koncentrationen delprøver af 30 µL: 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,6; 0,8; og 1,0 mg/dL.
Bemærk: Hvis prøven blev udarbejdet på den foreslåede størrelse (Se trin 4.1 for udarbejdelse af lysate med 200 µL af buffer), den beregnede koncentration bør være inden for rækkevidde af ca. 2-7 mg/mL. I dette tilfælde fortyndes den prøver 1:10 med PBS inden målingen.
Bemærk: For de første eksperimenter ved hjælp af denne metode, anbefales det at måle prøver i forskellige fortyndinger (1, 1:10, og 1: 100). Der er ingen nøjagtige bestemmelse af antallet af nematoder, kan udbyttet variere mellem individuelle forskere. - Brug en gennemsigtig 96-brønd plade (polystyren) og tilsæt 10 µL af hver standard koncentration og af prøverne i de valgte fortyndinger i dubletter i brøndene.
- Fortynd protein assay farvestof reagens koncentrat 1:5 med destilleret vand (aq. dest.) og tilføje 200 µL af fortyndingen til hver prøve på pladen. Inkuber plade i 10 min ved stuetemperatur.
- Absorbansen måles inden for 30 min på 595 nm med en pladelæseren. Prøverne kan blive interpoleret fra den beregnede standardkurven. Flere oplysninger om metoden er blevet beskrevet udførligt i litteratur10.
- Forberede en standardkurve, der er tilsat bovint serumalbumin (BSA) løst i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) af følgende koncentrationen delprøver af 30 µL: 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,6; 0,8; og 1,0 mg/dL.
-
Måle de intracellulære aldre som tidligere beskrevet11,12.
- Vaske total protein ekstrakter (ca. 200 µg) 3 x med vand af ultracentrifugering i 10 kDa centrifugal filter enheder.
- Tilsæt 10 µL af 100 mM HCl, 10 µL af pepsin (2 mg/mL i 20 mM HCl) og 10 µL af thymol (2 mg/mL i 20 mM HCl) til den gendannede protein (ca. 100 µL) og inkuberes prøver ved 37 ° C i 24 timer.
- Neutralisere og buffer prøverne på pH 7,4 ved at tilføje 12,5 µL af 0,5 M kalium fosfat buffer (pH 7,4) og 5 µL af 260 mM KOH.
- Tilsæt 10 µL af Pronase E [2 mg/mL i 10 mM kalium fosfat buffer (pH 7,4)] og 10 µL af en penicillin-streptomycin løsning, og Inkuber prøver ved 37 ° C i 24 timer.
- Tilsæt 10 µL af aminopeptidase [2 mg/mL i 10 mM kalium fosfat buffer (pH 7,4)] og 10 µL af prolidase [2 mg/mL i 10 mM kalium fosfat buffer (pH 7,4)], og Inkuber prøver ved 37 ° C i 48 timer.
- Analysere de resulterende hydrolysat af LC-MS/MS, som tidligere beskrevet12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her kultur eksempler på at skabe en storstilet C. elegans for applikationer i diabetes forskning præsenteres. Det kan være af interesse at relatere parametrene til et enkelt dyr, snarere end at normalisere det til den samlede proteinkoncentration. I en analyse, der kræver en lille række nematoder, kan dette ske nemt ved at tælle nematoderne. For en storstilet C. elegans kultur der involverer hundredvis af nematoder pr. eksperimentelle gruppe, denne tilgang er ubelejligt. I figur 2, er sammenhæng mellem mængden af C. elegans og proteinindholdet vist. Som det fremgår her, kan reproducerbare kvantitativ protein isolation opnås ved hjælp af denne protokol.
Amadori addukt fructosyl-lysin er en af flere alder prækursorer dannet under diabetes i eksperimentelle dyr modeller13. Figur 3 viser LC-MS/MS målinger efter en glucose behandling i 12 dage gamle nematoder og alder-matchede ubehandlet kontrol fra tre uafhængige forsøg. Nematoderne blev homogeniseret med et tillæg af 200 µL af lysate buffer. En øget dannelse af fructosyl-lysin efter høj-glucose behandling er præsenteret.
Reaktive metabolitters som methylglyoxal er fluctuant og ændre proteiner hurtigt14. Derfor, spørgsmålet er, om disse reaktive metabolitters faktisk ophobes i organismen eller redigeres, før de når deres mål. Figur 4 bekræfter ophobning af methylglyoxal i C. elegans efter en behandling med stoffet.
Oxidativ stress er steget under hyperglykæmi6, samt under shear stress. Figur 5 bekræfter ingen forskel i dannelsen af oxidativt stress gruppen glukose-behandlet, overført som i punkt 2 i protokollen, og gruppen ikke overført. Sammenligning af både glukose-behandlede grupper til den ubehandlede kontrolgruppe viser en betydelig stigning i oxidativ stress induceret af glukose. Derimod blev ingen signifikant forskel mellem de to glukose-behandlede grupper observeret. Disse resultater illustrerer, håndtering af nematoder bruger denne protokol ikke væsentligt inducerer dannelsen af oxidativ stress, som kan tjene som en confounder i undersøgelser af befolkningens aldring eller stofskifte. Derudover blev resultater i den aktuelle litteratur gengivet ved hjælp af denne protokol.
Figur 1: tilstrækkelig tæthed af nematoder til en yderligere distribution på plader. (A) dette panel viser en makroskopisk visning. (B) dette panel viser mikroskopiske udsigt, på 20 X augmentation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Proteinindholdet i wild-type C. elegans N2. Dette panel viser korrelationen mellem antallet af nematoder til protein udbyttet af den lysate, forberedt som beskrevet i protokollen afsnit 5 i 12 dage gamle nematoder(n = 3 lysate af 500 nematoder; n = 3 lysate af 1.000 nematoder; og n = 1 lysate af 1.500 nematoder). Regressionslinjen er markeret med rødt (r2 = 0.976, y = 0,64). Den samlede proteinkoncentration blev målt ved hjælp af metoden Bradford. Dataene, der er udtrykt i gennemsnit ± standardafvigelse (SD). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Øget dannelse af fructosyl-lysin efter en glucose behandling af C. elegans N2. Koncentrationer af fructosyl-lysin efter en behandling med glukose i 12 dage gamle nematoder og ubehandlet kontrol blev bestemt af LC-MS/MS og normaliseres til en proteinkoncentration bestemmes af metoden Bradford. Dataene, der er udtrykt i den gennemsnit ± SD. P-værdier blev bestemt af Student's t-test, **p < 0,01. Resultaterne er fra tre uafhængige forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Intracellulære methylglyoxal koncentrationer efter en methylglyoxal behandling af C. elegans N2. Methylglyoxal koncentrationer blev målt ved LC-MS/MS i 12 dage gamle nematoder behandlet med methylglyoxal. Prøverne blev indsamlet mindre end 2 timer efter den sidste behandling. Dataene, der er udtrykt i gennemsnit ± SD normaliseret til antallet af nematoder. P-værdier blev bestemt af Student's t-test, **p < 0,01. Resultaterne er fra tre uafhængige forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Oxidativt stress målt i C. elegans CL2166 efter en glucose behandling. Transgenic CL2166 (gst4::GFP)8 indeholdende en glutathion-S-transferase 4-promotor-drevet normal god landbrugspraksis reporter var kulturperler på 400 µM FUdR plader der indeholder glucose til 2 d. Den ene gruppe blev overført til frisk glukose plader på dag 1 som beskrevet i afsnit 2 i denne protokol. Oxidativ stress blev målt som en stigning i fluorescens [relativ lys enheder (RLU)] med en pladelæseren. Dataene, der er udtrykt i den gennemsnit ± SD. P-værdier blev bestemt af ANOVA, *p < 0,05. Resultaterne er fra tre uafhængige forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol præsenterer en pålidelig tilgang til storstilet dyrkning af C. elegans kvantitative resultater. Resultaterne fra litteraturen kunne genskabes, som vist i Repræsentative resultater. Selv om denne protokol for indsamling af omfattende prøver af C. elegans virker som en ligetil metode, er der visse faldgruber for at tage hensyn til. Om synkronisering af den nematodeprøveudtagning befolkning beskriver denne protokol en tilgang af blegning befolkning med natriumhypochlorit og natriumhydroxid til at ødelægge Nematoderne og høste æggene udelukkende. Det må tages i betragtning, at denne tilgang ikke er egnet til alle eksperimenter. Afhængigt af forholdet mellem befolkningens størrelse til omfanget af de blegning løsning påvirker skader effekten af de blegning løsning udviklingen af embryoner15. Især når man studerer udviklingsprocesser, kunne dette være et afgørende skridt. Vedrørende håndtering af Nematoderne er det afgørende at anvende som lille shear kræfter som muligt i hele protokollen. Hvis det ikke håndteres med omtanke, vil en lang række nematoder omkomme. For sags skyld er det vigtigt ikke at overstige spinning tid og hastighed. Når du overfører Nematoderne, bør et snit pipette tip til at nedbringe antallet af tilskadekomne nematoder anvendes. For overførsel af Nematoderne, bør den anbefalede mængde af buffer ikke overskrides, da agaren kunne knæk når det bliver for fugtigt, giver Nematoderne mulighed for at grave i pladen. Samtidig med at indsamle prøver, skal M9 bufferen holdes iskold at bremse nematoder stofskifte, især når du arbejder med metabolitter eller substrater, der C. elegans vil nedbrydes. Det er vigtigt at vaske prøve grundigt for at minimere enhver bakteriel forurening fra forudgående fodring. Når du overfører pellet, huske på, at et stort antal orm kunne holde sig til plast pipette tips. De anbefalede glas pipette bør anvendes, da selv lav-bindende pipette tips kunne beholde en stor mængde af prøven. Som et alternativ foreslået tilsætning af 0,01% Triton-X100 til M9 buffer blev tidligere16. For at sikre, at ingen afdøde C. elegans eller bakterier vil påvirke resultaterne, udført saccharose flydemidler efter indsamling af Nematoderne kan være14. Dette sker normalt efter flydende dyrkning for at fjerne mediet. I dette eksperiment, blev denne udrensning udeladt, fordi saccharose metaboliseres til glucose og fructose, således potentielt forstyrrende vores resultater.
Typisk, en storstilet kultur af C. elegans udføres, ved hjælp af flydende medier. Flydende dyrkning, dog, er ikke egnet til alle eksperimentelle indstillinger, især når du bruger udlæsninger som kræver nøjagtige tal af nematoder. En ændring af Baerman apparatet var tidligere beskrevet for at sortere og rense nematoder afledt af flydende kultur17. Denne metode kraftigt reducerer bakteriel forurening og filtrerer kun voksen nematoder gennem et flere komponent filtersystem. Denne elegante metode er begrænset af den lange filtrering tid (2-6 h) ved stuetemperatur, der kunne forvirre metaboliske analyser. Hvad angår den filtrering teknik, er nematoder sorteret efter deres bevægende aktiviteter. Nematoder skal være egnet nok til at kravle uafhængigt gennem porerne i filtre fra forskellige materialer. Således kan resultaterne blive forvrænget af bortset fra nematoder, der er svækket af de eksperimentelle behandlinger.
Kombinere væske og plade kulturer i en enkelt eksperimentelle design kan også tjene som en confounder i senere analyser. C. elegans udvikler en tyndere og længere fænotype i flydende kultur, hvilket gør det vanskeligt at sammenligne parametre normaliseret til masse, proteinindhold, eller organ længde og bredde2. Desuden er undersøgelse af reaktive stoffer udfordrende i flydende kultur, da reaktive stoffer vil sandsynligvis ændres eller inaktiveret ved medier komponenter før de når nematoderne. Selv om omfattende prøver af C. elegans kan opnås med denne protokol, er plade kultur, selv mere arbejdskrævende end flydende kultur. Men der er visse måder at lette håndtering (f.eks.ved brug af en agar-dispensering maskine). En anden mulighed for at fremme omfattende kultur effektivt er brugen af petriskåle med en større diameter til produktion af agar plader. Denne indstilling kan være begrænsning af de efterfølgende analyser. For mikroskopiske vurdering eller plade håndtering i almindelighed, falde faciliteterne med diameteren af fadet.
Flere høj overførselshastighed tilgange egnet til vurdering af forskellige parametre, såsom kemisk eller stof screening, er blevet udviklet og undersøgt18. Mikrofluid enheder giver forskere til at studere forskellige parametre, som vist i en model af type-2 diabetes19. Levetid, lipid metabolisme og oxidativ stress svar kan samtidig vurderes på et enkelt dyr niveau, afslørende fordelene af høj-indhold screening, som integrerer fænotypiske biokemiske oplysninger. Vurdering af pålideligheden og reproducerbarhed af de aktuelle litteratur har allerede vist en stor forfinelse af disse teknikker, går ud over proof-of-concept undersøgelser18. En overkommelig pris, især for mindre laboratorier, stadig er problematisk, da enhederne ofte skal tilpasses efter eksperimentel behov, som kan vise sig for at være dyrt.
Kvantificering af aldre i C. elegans kompliceres af den vandtætte kutikula af fyrretræsnematoden. En almindeligt anvendt metode er påvisning af aldre via immunfluorescent stainings6. På grund af neglebånd, større prøver størrelser er nødvendige for at mindske den høje variansen i resultaterne. Imaging har at tages i betragtning som en tidskrævende faktor.
Protokol for hel-krops lysate forberedelse beskrevet her gør intracellulære aldre og andre komponenter af C. elegans tilgængelige for analyser. LC-MS/MS målinger af C. elegans prøver er udført før14. Passende dyrkningsbaserede betingelser, men er for at opnå en tilstrækkelig række nematoder ikke beskrevet i detaljer, endnu.
I denne protokol beskrevne metode er nyttig for udlæsninger kræver en storstilet, homogen måde vokset befolkning af C. elegans, eller en kombination af flere udlæsninger pr. eksperiment. Dette er især praktisk for at studere komplekse multifaktoriel sygdomme som diabetes og dens komplikationer. Alternative tilgange, såsom høj overførselshastighed og high-indhold screening ved hjælp af mikrofluid systemer, er teknologisk mere avancerede og er i stand til at levere større mellemstore data. Deres vigtigste anvendelse kan i øjeblikket ses i kemiske og stof screening eller genetisk screening for mutanter reagerer på de eksperimentelle behandlinger. Denne protokol hjælper forskere til nemt og billigt opskalere størrelsen af deres nuværende eller fremtidige projekter uden behov for en justering af de nuværende eksperimentelle readouts og således, at minimere tidstab forbundet med etablering af nye metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) inden for IRTG 1874 "Diabetisk mikrovaskulære komplikationer" og CRC 1118 "Reaktive metabolitters som en årsag til diabetisk sene komplikationer". C. elegans stammer N2 og CL2166 blev leveret af CGC-udvalg, som er finansieret af NIH Office for forskning infrastruktur programmer (P40 OD010440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli OP50 | CGC | n/a | |
| C. elegans N2 | CGC | n/a | |
| C. elegans CL2166 | CGC | n/a | |
| Petri dish, 60 mm x 15 mm | Greiner One | 628161 | |
| Volumetric pipet, glas, 10 mL | Neolab | E-0413 | |
| Proteinase inhibitor cocktail tablets | Roche | 04693124001 | |
| Non-denaturing lysate buffer: | |||
| Tris-HCl, pH 8 | Sigma | T3253 | |
| Sodiumchloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E5391 | |
| 96-well plates, transparent bottom | Brand | 781611 | |
| Infinite M200, plate reader | Tecan | 30017581 | |
| Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm | Next advance | ZROB05-RNA | |
| Bullet Blender, homogenizer | Next advance | BBX24 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P6887 | |
| Thymol | Sigma | T0501 | |
| Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P6911 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P43339 | |
| Prolidase from Porcine Kidney | Sigma | P6675 | |
| Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica | Sigma | A8200 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Merckmillipore | UFC501096 | |
| Basic Materials for plate culture are described in Reference 6. |
References
- Fronius, M., Clauss, W. G. Mechano-sensitivity of ENaC: may the (shear) force be with you. Pflügers Archiv. 455 (5), 775-785 (2008).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , Available from: http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html (2006).
- Altun, Z. F., Hall, D. H. Nervous system, general description. WormAtlas. , Available from: http://www.wormatlas.org/hermaphrodite/nervous/Neuroframeset.html (2011).
- Sohn, E. H., et al. Retinal neurodegeneration may precede microvascular changes characteristic of diabetic retinopathy in diabetes mellitus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (19), E2655-E2664 (2016).
- Chilelli, N. C., Burlina, S., Lapolla, A. AGEs, rather than hyperglycemia, are responsible for microvascular complications in diabetes: a "glycoxidation-centric" point of view. Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Diseases. 23 (10), 913-919 (2013).
- Schlotterer, A., et al. C. elegans as model for the study of high glucose- mediated life span reduction. Diabetes. 58 (11), 2450-2456 (2009).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Leiers, B., et al. A stress-responsive glutathione S-transferase confers resistance to oxidative stress in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology and Medicine. 34 (11), 1405-1415 (2003).
- Rabbani, N., Thornalley, P. J. Measurement of methylglyoxal by stable isotopic dilution analysis LC-MS/MS with corroborative prediction in physiological samples. Nature Protocols. 9 (8), 1969-1979 (2014).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 7 (72), 248-254 (1976).
- Ahmed, N., Argirov, O. K., Minhas, H. S., Cordeiro, C. A., Thornalley, P. J. Assay of advanced glycation endproducts (AGEs): surveying AGEs by chromatographic assay with derivatization by 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamate and application to Nepsilon-carboxymethyl-lysine- and Nepsilon-(1-carboxyethyl)lysine-modified albumin. Biochemical Journal. 364 (Pt 1), 1-14 (2002).
- Thornalley, P. J., et al. Quantitative screening of advanced glycation endproducts in cellular and extracellular proteins by tandem mass spectrometry. Biochemical Journal. 375 (Pt 3), 581-592 (2003).
- Karachalias, N., Babaei-Jadidi, R., Ahmed, N., Thornalley, P. Accumulation of fructosyllysine and advanced glycation end products in the kidney, retina and peripheral nerve of streptozotocin-induced diabetic rats. Biochemical Society Transactions. 31, 1423-1425 (2003).
- Morcos, M., et al. Glyoxalase-1 prevents mitochondrial protein modification and enhances lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 7 (2), 260-269 (2008).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Lagido, C., McLaggan, D., Glover, L. A. A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (105), e53083 (2015).
- Takamiya, S., Mita, T. Large-scale purification of active liquid-cultured Caenorhabditis elegans using a modified Baermann apparatus. Parasitology International. 65 (5 Pt B), 580-583 (2016).
- Cornaglia, M., Lehnert, T., Gijs, M. A. M. Microfluidic systems for high-throughput and high-content screening using the nematode Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 17 (22), 3736-3759 (2017).
- Zhu, G., Yin, F., Wang, L., Wei, W., Jiang, L., Qin, J. Modeling type 2 diabetes-like hyperglycemia in C. elegans on a microdevice. Integrative Biology. 8 (1), 30-38 (2016).
