Denne protokollen beskriver en metode for storskala dyrking av Caenorhabditis elegans på solid medier. Som et alternativ til flytende kultur kan denne protokollen få parametere av forskjellige skalaer under plate-baserte dyrking. Dette øker sammenlignbarheten resultater ved å utelate morfologiske og metabolske forskjellene mellom flytende og fast mediekultur.
Dyrking Caenorhabditis elegans (C. elegans) i en stor måte på agar plater kan være tidkrevende og vanskelig. Denne protokollen beskriver en enkel og rimelig metode for å få et stort antall dyr for isolering av proteiner fortsette med en western blot, massespektrometri eller ytterligere Proteomikk analyser. Videre, en økning på Rundormer tall for immunostainings og integrering av flere analyser culturing oppstiller kan lett oppnås. I tillegg er en overføring mellom plater med forskjellige eksperimentelle forhold tilrettelagt. Vanlige teknikker i plate kultur innebærer overføring av en enkelt C. elegans bruke en platina ledning og overføring av befolkede agar biter ved hjelp av en skalpell. Men med økende Rundormer tall, bli disse teknikkene altfor tidkrevende. Denne protokollen beskriver store kultur C. elegans inkludert mange skritt å minimere virkningen av prøven forberedelsen på fysiologi av ormen. Væske og skjæring stress kan forandre levetid og metabolske prosesser i C. elegans, noe som krever en detaljert beskrivelse av de avgjørende skritt for å hente pålitelig og reproduserbar. C. elegans er en modell organisme, bestående av neuronal celler for opptil en tredjedel, men mangler blodkar, noe som gir muligheten til å undersøke utelukkende nevronale endringer uavhengig av vaskulær kontroll. Nylig fant tidlig neurodegeneration i diabetisk retinopati før vaskulær endringer. Dermed er C. elegans av spesiell interesse for å studere generell mekanismer for diabetiker komplikasjoner. For eksempel en økt dannelse av avanserte glycation end produkter (alder) og reaktive oksygen arter (ROS) er observert, som reproduserbar finnes i C. elegans. Protokoller for å håndtere prøver av tilstrekkelig størrelse for et bredere spekter av undersøkelser presenteres her, eksemplifisert ved studier av diabetes-indusert biokjemiske endringer. Generelt denne protokollen kan være nyttig for studier som krever store C. elegans tall og som flytende kultur er ikke egnet.
Protein analyser, for eksempel western blot eller massespektrometri, krever milligram protein. Dette gir krever en storskala dyrking av hundrevis av C. elegans, som kan oppnås ved flytende kultur eller på solid media overføre nematoder ved vask. Væske og skjæring stress induserer uttrykk for epithelial natrium kanaler (ENaC), som kan øke osmotisk stress gjennom en økt opptak av natrium, potensielt endre levetiden C. elegans og påvirke metabolske analyser1 . Derfor ta noen viktige skritt i denne protokollen for plate-basert tilnærming reduksjonen av stress påvirker eksperimentell variasjoner hensyn. Flytende kultur, derimot, påvirker fenotypen av nematoder og kompliserer kulturen og samling av et nøyaktig antall nematoder2. Videre reaktive stoffer kan endres ved media komponentene og kan distribuere ujevnt før nematoder. Om begrensningene for flytende kultur gir denne protokollen en alternativ tilnærming til dyrking store prøver C.elegans.
C. elegans er en modell organisme med et tydelig nettverk av 302 neuronal celler, utgjør en tredjedel av alle sine celler3. Siden introduksjonen i vitenskap, mange homologe og orthologous gener er beskrevet, forsterke sin verdi som en modell for medisinsk forskning. Nylig presentert bevis for nevrologiske svekkelse i diabetisk retinopati, foregående vaskulære skader,4. C. elegans mangler blodkar, men inneholder et distinkt nevrale nettverk, gjør det en passende modell å undersøke nevronale endringer fra vaskulær seg. Dermed er C. elegans av spesiell interesse for å studere generell mekanismer for diabetiker komplikasjoner. Biokjemiske endringer i diabetiker komplikasjoner innebære dannelsen av aldre, som ytterligere påvirker dannelsen av ROS svar hyperglykemi5. Finnes i C. elegans og bidra til neuronal skade6. Kroniske sykdommer er ofte forårsaket av komplekse, polygenic prosesser som krever en multiparametric tilnærming for å vurdere deres underliggende mekanismer, som eksemplifisert her med vurdering av diabetiker komplikasjoner. Denne protokollen kan være til nytte for å få flere parametere samtidig, og senere. Økt sammenlignbarhet og reproduserbarhet multiparametric tilnærming kan oppnås ved å utelate morfologiske og metabolske forskjellene mellom flytende og fast mediekultur.
Denne protokollen presenterer en pålitelig tilnærming for storskala dyrking av C. elegans hente kvantitative resultater. Funn fra litteraturen kan replikeres som vist i Representant resultater. Selv om denne protokollen for innsamling av store prøver C. elegans virker som en rett-fram-metoden, er det visse fallgruvene ta hensyn. Om synkroniseringen av befolkningen Rundormer beskriver denne protokollen tilnærming av bleking befolkningen med natriumhypokloritt og natriumhydroksid å ?…
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) i IRTG 1874 “Diabetiker mikrovaskulær komplikasjoner” og CRC 1118 “Reaktive metabolitter som en årsak for diabetiker sent komplikasjoner”. C. elegans stammer N2 og CL2166 ble levert av CGC, som finansieres ved NIH Office of forskning infrastruktur programmer (P40 OD010440).
E. coli OP50 | CGC | n/a | |
C. elegans N2 | CGC | n/a | |
C. elegans CL2166 | CGC | n/a | |
Petri dish, 60 x 15 mm | Greiner One | 628161 | |
Volumetric pipet, glas, 10 mL | Neolab | E-0413 | |
Proteinase inhibitor cocktail tablets | Roche | 04693124001 | |
Non-denaturing lysate buffer: | |||
Tris-HCl, pH 8 | Sigma | T3253 | |
Sodiumchloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E5391 | |
96-well plates, transparent bottom | Brand | 781611 | |
Infinite M200, plate reader | Tecan | 30017581 | |
Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm | Next advance | ZROB05-RNA | |
Bullet Blender, homogenizer | Next advance | BBX24 | |
Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P6887 | |
Thymol | Sigma | T0501 | |
Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P6911 | |
Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P43339 | |
Prolidase from Porcine Kidney | Sigma | P6675 | |
Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica | Sigma | A8200 | |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Merckmillipore | UFC501096 | |
Basic Materials for plate culture are described in Reference 6. |