Summary
Det här protokollet beskriver en metod för storskalig odling av Caenorhabditis elegans på solid media. Som ett alternativ till flytande kultur tillåter detta protokoll att erhålla parametrar för olika skalor under plattan-baserade odling. Detta ökar jämförbarheten av resultaten genom att utelämna de morfologiska och metabola skillnaderna mellan flytande och fasta mediekultur.
Abstract
Odling Caenorhabditis elegans (C. elegans) på ett omfattande sätt på agarplattor kan vara tidskrävande och svårt. Det här protokollet beskriver en enkel och billig metod för att få ett stort antal djur för isolering av proteiner att gå vidare med en western blot, masspektrometri eller ytterligare proteomik analyser. Dessutom kan en ökning av nematoder siffror för immunostainings och integration av flera analyser på samma culturing villkor lätt uppnås. Dessutom underlättas en överföring mellan plattor med olika experimentella förhållanden. Vanliga tekniker i plattan kultur innebär överföring av en enda C. elegans med en platina tråd och överföring av befolkade agar bitar med en skalpell. Men med ökande nematoder, blivit dessa tekniker alltför tidskrävande. Det här protokollet beskriver den storskaliga kulturen i C. elegans inklusive många steg för att minimera effekterna av provberedningen på fysiologi av masken. Vätska och skjuvspänning kan förändra livslängd och metaboliska processer i C. elegans, vilket kräver en detaljerad beskrivning av de kritiska steg för att hämta tillförlitliga och reproducerbara resultat. C. elegans är en modellorganism, bestående av neuronala celler för upp till en tredjedel, men saknar blodkärl, vilket ger möjligheten att undersöka enbart neuronala förändringar oberoende av vaskulär kontroll. Nyligen hittades tidigt neurodegeneration i diabetesretinopati före vaskulära förändringar. Således, C. elegans är av särskilt intresse för att studera generella mekanismer av diabeteskomplikationer. Till exempel en ökad bildning av advanced glycation end produkter (åldrar) och reaktiva syreradikaler (ROS) observeras, som reproducibly finns i C. elegans. Protokoll att hantera prover av tillräcklig storlek för ett bredare spektrum av undersökningar presenteras här exemplifieras med studier av diabetes-inducerad biokemiska förändringar. I allmänhet, detta protokoll kan vara användbara för undersökningar som kräver stor C. elegans nummer och i vilket flytande kultur inte är lämplig.
Introduction
Protein analyser, såsom en western blot eller masspektrometri, kräver milligram protein. Denna avkastning kräver en storskalig odling av hundratals C. elegans, som kan utföras antingen av flytande kultur eller på solid media överföra nematoder genom tvättning. Vätska och skjuvspänning inducerar uttryck av epitelial natriumkanaler (ENaC), vilket skulle kunna öka den osmotisk stressen genom ett ökat upptag av natrium, potentiellt förändra C. elegans livslängd och påverkar metabola analyser1 . Därför ta vissa kritiska steg i detta protokoll för den platta-baserade strategin minskning av stress som påverkar experimentella variabilitet hänsyn. Flytande kultur, däremot, påverkar fenotypen av nematoder och komplicerar kultur och samling av ett exakt antal nematoder2. Dessutom reaktiva ämnen kan ändras genom media-komponenter och kan distribuera ojämnt innan den når nematoder. Om begränsningar av flytande kultur ger det här protokollet en alternativ strategi för odling storskaliga prover av C. elegans.
C. elegans är en modellorganism med ett distinkt nätverk av 302 neuronala celler, som utgör en tredjedel av alla dess celler3. Sedan introduktionen i vetenskap, många homologa och orthologous gener har beskrivits, förstärka dess värde som en modell för medicinsk forskning. Bevis för neurologisk försämring av diabetisk retinopati, föregår kärlskador, har nyligen presenterats4. C. elegans saknas blodkärl, men innehåller ett distinkt neuronala nätverk, gör det en passande modell att undersöka neuronala förändringar förutom vaskulär ettor. Således, C. elegans är av särskilt intresse för att studera generella mekanismer av diabeteskomplikationer. Biokemiska förändringar i diabeteskomplikationer innebär bildandet av åldrar, vilket ytterligare påverkar bildningen av ROS svar på hyperglykemi5. Åldrar finns i C. elegans och bidra till nervcellskador6. Kroniska sjukdomar orsakas ofta av komplexa, polygenisk processer som kräver en multiparametric metod för bedömning av deras bakomliggande mekanismer, som exemplifieras här med bedömning av diabeteskomplikationer. Detta protokoll kan vara till nytta för att erhålla flera parametrar samtidigt, samt därefter. Ökad jämförbarhet och reproducerbarhet av ett multiparametric synsätt kan uppnås genom att utelämna de morfologiska och metabola skillnaderna mellan flytande och fasta mediekultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Detta protokoll är indelad i fem sektioner. I avsnitt 1 – 3, presenteras huvudsakliga protokollet till kultur C. elegans på en storskalig. Avsnitten 4 och 5 ger ytterligare protokoll för bedömning av exemplifieras metaboliter förekommer hos diabetiker metaboliter. I detalj beskriver avsnitt 1 en storskalig allmänbildning på tallrikar. Avsnitt 2 fokuserar på överföring av stora mängder C. elegans, medan avsnitt 3 förklarar skörd av en storskalig provet. Avsnitt 4 förklarar protein isolering från provet och avsnitt 5 beskriver provpreparering för efterföljande liquid chromatography-tandem masspektrometri (LC-MS/MS) analyser.
1. storskaliga kultur på tallrikar
- I allmänhet fungera under en steril huv eller bredvid en öppen eld att undvika föroreningar.
-
Till kultur maskar tills de når unga vuxna scenen, följ denna tidigare publicerade protokoll7 med följande anpassningar.
- Använda levande Escherichia coli OP50 bakterier att mata nematoder och förbereda 400 µM fluorodeoxyuridine agar (inte ampicillin/FUdR) för experiment.
- För beredning av en synkron befolkning, använda koncentrerad OP50, och lyckas experiment med vuxna, använda 3,3 x koncentrerad OP50 genom att ta bort 70% av supernatanten.
- Daglig utfodring intervall rekommenderas. Vid bedömningen av oxidativ stress, kan olika intervaller och volymer för utfodring påverka resultaten.
- För inympning, ta en tallrik med flera nematoder och skär den i bitar ca 0,5 x 1 cm2 med en skalpell. Överföra två till tre bitar på nematoder tillväxtplattor media (NGM) 60 mm i diameter, som innehåller koncentrerad OP50.
- Inkubera plattorna vid temperaturen som lämpar sig för stammen (vildtyp N2 bör vara odlade vid 20 ° C) tills ägg syns på plattan.
- Tvätta bort de flesta ägg och vuxna djur med 2 mL M9 buffert och samla dem i en 15 mL tub. Centrifugera suspensionen vid 800 x g i 2 min. Under tiden börja förbereda blekning lösningen.
- Ta ut centrifugeras röret och ta bort M9 bufferten med en 10 mL Pipettera. Tillsätt 10 mL av blekning lösning och blandning på vortex tills de vuxna nematoder är lyserat. Detta tar vanligtvis ca 5 – 7 min, men bör inte ta längre än 15 min eller äggen kommer inte att utveckla fullt sedermera i experimentet.
- Centrifugera suspensionen vid 800 x g i 2 min. Tvätta 3 gånger med 10 mL M9 buffert att rensa ägg från blekning lösning.
- Nu lägga till 150 µL av ägg upphängning på OP50 tallrikar. En täthet på 200 – 300 ägg bör nås på varje tallrik. Vänta tills nematoder nått vuxen stadiet.
Obs: M9 bufferten (pH 7,0) används för avbildade experiment består av följande ämnen: 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4och 86 mM NaCl. Efter autoklavering blandningen, tillsätt 1 mM MgSO4. Den blekning lösningen innehåller 0,5 M NaOH, 2,3 mM NaOCl löst i destillerat vatten. - Förbereda sterila M9 buffert, sterila pipettspetsar med en skära tips att tvätta bort de maskar och 15 mL tuber att samla dem i.
- Applicera ungefär 1 mL av M9 buffert på plattorna, försiktigt distribuera bufferten av svängande och försiktigt Pipettera nematoder av plattan.
- Nu, samla nematoder i röret. Applicera 150 µL av suspensionen direkt på plattorna (seedad med OP50) med de skurna pipettspetsarna, och utvärdera mikroskopiskt tätheten av nematoder (rekommenderas: 50 – 100 nematoder per 60 mm platta).
- Om de är alltför tät, späd fjädringen med M9 buffert och utvärdera den under mikroskopet tills önskad täthet uppnås. Om avkastningen är för lite, låt maskarna bosätta sig eller Centrifugera suspension 10 s vid 800 x g att ta bort vätska.
Obs: Ett exempel på en tillräcklig täthet ges i figur 1A (makroskopisk) och 1B (mikroskopiska) på 20 X förstoring. Fortsätt empiriskt som beskrivs. - Tänk på att maskarna bosätta sig snabbt. För att säkerställa en jämn fördelning mellan plattorna, Invertera röret efter varje stack av plattor (4 – 5 tallrikar).
Obs: Snittet Pipettera spets, liksom den mjuka gungande och tvättning av pläterar, minskar skjuvspänning.
2. överföring av stora mängder Caenorhabditis elegans
- Tvätta bort nematoder med cirka 500 µL av M9 buffert, beroende på ålder och torrhet i plattorna. Använder samma bufferten, upprepa du lossar nematoder tills de flesta av djuren samlas i suspension.
- Långsamt tar upp nematoder med en skära pipettspetsen och överföra dem på en tallrik förberedd med OP50. Låt plattan torka.
Obs: Var noga med att inte tillämpa mycket mer än den rekommenderade volymen. Särskilt i långsiktiga experiment, plattorna kan inte tolerera det och ägarn kan bryta, vilket gör att nematoder att krypa in i sprickor.
3. skörden av en stor Caenorhabditis elegans prov
- Beroende på vald metod, börja experiment med en tillräcklig mängd C. elegans. För LC-MS/MS analyser, förbereda 20 plattor (60 x 15 mm) per grupp med cirka 100 nematoder per platta att säkerställa en avkastning på minst 200 µg protein per prov.
Obs: Denna del av protokollet kräver inte arbetar under sterila förhållanden längre, som nematoder samlas och fryst. - På dagen för provsamlingen, förbereda flytande kväve till snapin-frysa de insamlade proverna. Hålla icke-sterila M9 buffert på is för att sakta ner nematodens ämnesomsättning.
- Tvätta bort den C. elegans från plattorna genom att tillämpa 1 mL M9 buffert och försiktigt virvlande plattorna. Detta undviker att samla död nematoder och de flesta ägg, om det finns någon närvarande, eftersom de håller sig till bakterier och agar.
- Ta upp volymen och överföra den till en 15 mL tub.
- Efter insamlingen av komplett provet, vänta tills de nematoder att bosätta sig eller Centrifugera röret kort på 800 x g och ta bort de flesta av M9 bufferten. Tvätta provet 3 x med ca 10 mL av M9 (10 x provvolymen) att ta bort eventuella bakterier.
Obs: För att säkerställa att alla död nematoder avlägsnas, sackaros floatation är ett annat alternativ. Detta var dock inte lämplig för visade experiment15. Sackaros hydrolyseras till glukos och fruktos. I de avbildade experiment bedömdes rollen av glukos för att främja biokemiska förändringar som finns i kronisk diabetes. Sackaros floatation kunde således potentiellt blanda ihop resultaten. - Förbered ett 1,5 mL rör med 1 mL av M9 buffert och en tom 1,5 mL tub för varje prov. Överföra pelleten med ett glas Pipettera från 15 mL röret till tom 1,5 mL röret. Detta steg är avgörande för att säkerställa en kvantitativ överföring.
Obs: Till skillnad från under föregående steg, här nematoder är mer koncentrerad. På grund av en möjlig anslutning till plast Pipettera tips beräknas förlust av en stor del av provet. Använd därför glas pipetter istället. - Efter överföringen, Använd glas pipetten för att ta upp 1 mL M9 buffert från det andra röret 1,5 mL att skölja nematoder från pipett väggen. Dessutom tvätta de återstående nematoder från 15 mL röret och överföra dem till provet röret.
- Centrifugera provet röret vid 19.000 x g i 1 min och ta sedan bort så mycket supernatanten som möjligt.
- Förslut röret med Parafilm och omedelbart snapin-frysa den i flytande kväve. Förvara tuben vid-80 ° C tills lysate beredning.
4. protein isolering för masspektrometri
Obs: Protein isolering beskrivs här kan också användas för andra analyser (t.ex., western blot).
- Frusna provet, Tillsätt samma volym av 0,5 mm zirkoniumoxid pärlor och minst 2 x volymen av lysat buffert innehållande en proteinas hämmare cocktail.
Obs: De avbildade nematoder-till-protein korrelation analyserna utfördes med 100 µL buffert. LC-MS/MS prover var lyserat med 200 µL buffert. - Starta homogenisatorn för 1 min på hastighet 9. Se till att proverna är helt lyserat. Upprepa detta steg om de inte är fullt lyserat.
- Centrifugera proverna för 30 minuter vid 4 ° C vid 19.000 x g. Överför supernatanten till en ny tub på is och förvara den vid-80 ° C tills ytterligare mätningar kommer att tas.
Obs: Icke-denatureringen bufferten används för avbildade experiment består av följande ämnen: 20 mM Tris HCl (pH 8), 137 mM NaCl, 1% Triton-X och 2 mM EDTA.
Obs: Efter att ha följt stegen i detta protokoll och att ha tillämpat den föreslagna skalan, vara avkastningen av ett protein pellets från ungefärligt 1.000 nematoder cirka 500 µg. För fler jämförelser, samråda med figur 2 och Representativt resultat.
5. provberedning för Liquid Chromatography tandem Mass Spectrometry mätningar
Obs: Beroende på parametern sevärdheter, provpreparering skiljer sig åt. Detta protokoll fokuserar på methylglyoxal och åldersbestämning.
-
Mäta intracellulära methylglyoxal derivatisering med 1,2-diaminobensen (DB) som tidigare beskrivits9.
- Homogenisera proverna med 20 µL av iskall 20% (wt/vol) triklorättiksyra i natriumklorid 0,9% (wt/vol) och 80 µL av vatten i en 1,5 mL tub.
- Spike proverna av 5 µL med den interna standarden (13C3-MG; 400 nM), blanda dem genom vortexa och centrifugera dem sedan 21 000 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
- Över 35 µL av supernatanten till HPLC prov injektionsflaskan med ett 200 µL glas skär.
- Tillsätt 5 µL 3% natriumazid (wt/vol) till varje prov följt av 10 µL 0,5 mM DB i 200 mM HCl innehållande 0,5 mM diethylenetriaminepentaacetic syra (DETAPAC) i vatten.
- Inkubera proverna för 4 h i rumstemperatur, skyddas från ljus.
- Analysera proverna med LC-MS/MS, som tidigare beskrivits9.
Obs: För mätning av åldrar, isolera proteiner som beskrivs i avsnitt 4 i protokollet.
-
Mätning av protein koncentrationen av den (tinade) lysates med en Bradford assay10.
- Förbereda alikvoter av 30 µL för en standardkurva som spetsade med bovint serumalbumin (BSA) löst i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) av följande koncentrationen: 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,6; 0,8; och 1,0 mg/dL.
Obs: Om provet var beredd på föreslagna storleken (se steg 4.1 för beredning av lysat med 200 µL buffert), uppskattade koncentrationen bör vara i intervallet ca 2 – 7 mg/mL. I det här fallet Späd prover 1:10 med PBS före mätningen.
Obs: För första experiment med denna metod, det rekommenderas att mäta proverna i olika utspädningar (1, 1:10 och 1: 100). Eftersom det finns ingen exakt bestämning av antalet nematoder, avkastningen kan skilja sig mellan enskilda forskare. - Använda en transparent plattan med 96 brunnar (polystyren) och Pipettera 10 µL av varje standard koncentration och proverna i de valda utspädningarna i dubbletter i brunnarna.
- Späd protein assay dye reagens koncentrat 1:5 med destillerat vatten (aq. dest.) och tillsätt 200 µL utspädningen i varje prov på plattan. Inkubera plattan för 10 min i rumstemperatur.
- Mät absorbansen inom 30 min på 595 nm med en spektrofotometer. Proverna kan interpoleras från beräknade standardkurvan. Mer information om metoden har beskrivits utförligt i litteraturen10.
- Förbereda alikvoter av 30 µL för en standardkurva som spetsade med bovint serumalbumin (BSA) löst i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) av följande koncentrationen: 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,6; 0,8; och 1,0 mg/dL.
-
Mäta de intracellulära åldrarna som tidigare beskrivits11,12.
- Tvätta de totalprotein extrakt (cirka 200 µg) 3 x med vatten genom ultracentrifugering i 10 kDa centrifugal filterenheter.
- Tillsätt 10 µL av 100 mM HCl och pepsin (2 mg/mL i 20 mM HCl) 10 µL 10 µL av tymol (2 mg/mL i 20 mM HCl) till det återvunna proteinet (ca 100 µL) och inkubera proverna vid 37 ° C under 24 h.
- Neutralisera och buffert proverna vid pH 7,4 genom att lägga till 12,5 µL 0,5 M kalium fosfatbuffert (pH 7,4) och 5 µL 260 mM KOH.
- Tillsätt 10 µL av Pronase E [2 mg/mL i 10 mM kalium fosfatbuffert (pH 7,4)] och 10 µL av en penicillin-streptomycin lösning, och inkubera proverna vid 37 ° C under 24 h.
- Tillsätt 10 µL av aminopeptidase [2 mg/mL i 10 mM kalium fosfatbuffert (pH 7,4)] och 10 µL prolidase [2 mg/mL i 10 mM kalium fosfatbuffert (pH 7,4)], och inkubera proverna vid 37 ° C för 48 h.
- Analysera resulterande Hydrolysatet av LC-MS/MS, som tidigare beskrivits12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här kultur exempel på att skapa en storskalig C. elegans för tillämpningar inom diabetesforskning presenteras. Det kan vara av intresse att relatera parametrarna till ett enda djur, snarare än att normalisera det totalprotein koncentrationen. I ett test som kräver ett litet antal nematoder, kan detta enkelt åstadkommas genom att räkna nematoder. För en storskalig C. elegans kultur som omfattar hundratals nematoder per experimentella gruppen, detta tillvägagångssätt är obekvämt. I figur 2visas sambandet mellan mängden C. elegans och proteinhalten. Visat här, kan reproducerbara kvantitativa protein isolering uppnås med hjälp av detta protokoll.
Amadori addukt fructosyl-lysin är en av flera ålder prekursorer bildas vid diabetes i experimentella djur modeller13. Figur 3 visar LC-MS/MS mätningar efter en glukos behandling i 12 dagar gamla nematoder och åldersmatchade obehandlade kontroller från tre oberoende experiment. Nematoder var homogeniserad med ett tillägg av 200 µL lysate buffert. En ökad bildning av fructosyl-lysin efter hög-glukos behandling presenteras.
Reaktiva metaboliter såsom methylglyoxal är inavelseffekter och ändra proteiner snabbt14. Därför återstår frågan huruvida dessa reaktiva metaboliter faktiskt ackumuleras i organismen eller modifieras innan de når sina mål. Figur 4 bekräftar ansamling av methylglyoxal i C. elegans efter en behandling med ämnet.
Oxidativ stress är ökade hyperglykemi6, samt under skjuvspänning. Figur 5 bekräftar ingen skillnad i bildandet av oxidativ stress den glukos-behandlade gruppen, överförs i avsnitt 2 i protokollet, och gruppen icke-överförs. Jämförelse av både glukos-behandlade grupper att obehandlade kontrollgruppen visar en betydande ökning i oxidativ stress induceras av glukos. Däremot observerades ingen signifikant skillnad mellan de två glukos-behandlade grupperna. Dessa resultat visar att hantering av nematoder som använder detta protokoll inte avsevärt inducerar bildandet av oxidativ stress, som kan tjäna som en confounder i utredningar av åldrande eller ämnesomsättning. Dessutom återges resultaten i den aktuella litteraturen använder detta protokoll.
Figur 1: tillräcklig täthet av nematoder för en ytterligare fördelning på tallrikar. (A) denna panel visar en makroskopisk vy. (B) denna panel visar en mikroskopisk vy, på 20 X förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Proteininnehåll av vildtyp C. elegans N2. Detta panelen visar sambandet mellan antalet nematoder till protein avkastningen av den lysate, beretts enligt anvisningarna i protokollet avsnitt 5 i 12 dagar gamla nematoder(n = 3 lysate av 500 nematoder; n = 3 lysate av 1.000 nematoder; och n = 1 lysate av 1.500 nematoder). Regressionslinjen markeras i rött (r2 = 0,976, y = 0,64). Totalprotein koncentrationen mättes med hjälp av Bradford metoden. Data är uttryckta som medelvärde ± standardavvikelsen (SD). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Ökad bildning av fructosyl-lysin efter en glukos behandling av C. elegans N2. Koncentrationerna av fructosyl-lysin efter en behandling med glukos i 12 dagar gamla nematoder och obehandlade kontroller fastställdes av LC-MS/MS och normaliserade till en proteinkoncentration bestäms av Bradford metoden. Data uttrycks som den medelvärde ± SD. P-värden bestämdes av Students t-test, **p < 0,01. Resultaten är från tre oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Intracellulära methylglyoxal koncentrationer efter en methylglyoxal behandling av C. elegans N2. Methylglyoxal koncentrationer mättes av LC-MS/MS i 12 dagar gamla nematoder behandlas med methylglyoxal. Proverna samlades in mindre än 2 h efter den sista behandlingen. Data är uttryckta som medelvärde ± SD normaliserade antalet nematoder. P-värden bestämdes av Students t-test, **p < 0,01. Resultaten är från tre oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Oxidativ stress mätt i C. elegans CL2166 efter en glukos behandling. Transgenic CL2166 (gst4::GFP)8 som innehåller glutation-S-transferas 4-promotor-driven GFP reporter odlades på 400 µM FUdR plåtar som innehåller glukos för 2 d. En grupp överfördes till färska glukos plattor på dag 1 som beskrivs i avsnitt 2 i detta protokoll. Oxidativ stress mättes som en ökning i fluorescens [relativa ljus enheter (RLU)] med en spektrofotometer. Data uttrycks som den medelvärde ± SD. P-värden bestämdes av ANOVA, *p < 0,05. Resultaten är från tre oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll utgör en tillförlitlig strategi för storskalig odling av C. elegans få kvantitativa resultat. Resultaten från litteraturen kunde replikeras som visas i Representativa resultat. Även om detta protokoll för storskalig provtagning av C. elegans verkar vara en enkel metod, finns det vissa fallgropar att beakta. Om synkronisering av nematoder befolkningen beskriver det här protokollet en strategi genom blekning befolkningen med natriumhypoklorit och natriumhydroxid för att förstöra nematoder och skörda ägg enbart. Det måste beaktas inte att denna metod passar alla experiment. Beroende på förhållandet mellan storleken på populationen till volymen av blekning lösningen påverkar att skada effekten av blekning lösningen utvecklingen av embryon15. Särskilt när man studerar utvecklingsprocesser, kan detta vara ett avgörande steg. När det gäller hanteringen av nematoder är det viktigt att tillämpa som lite skeva styrkor som möjligt i hela protokollet. Om inte hanteras med omsorg, kommer att ett stort antal nematoder förgås. För övrigt är det viktigt att inte överskrida den snurrande tid och hastighet. När du överför nematoder, bör en skära pipettspetsen att minska antalet skadade nematoder användas. För överföring av nematoder, bör den rekommenderade volymen av bufferten inte överskridas, eftersom ägarn kan spricka när den blir för fuktig, ge nematoder möjlighet att gräva i plattan. Samtidigt samla prover, måste M9 bufferten hållas iskall att bromsa den nematoder metabolism, speciellt när man arbetar med metaboliter eller substrat som C. elegans kommer att försämras. Det är viktigt att tvätta provet grundligt för att minimera all bakteriell kontaminering från före utfodring. När du överför pelleten, kom ihåg att ett stort antal maskar kunde hålla sig till plast pipettspetsar. Rekommenderade glas pipetten bör användas, eftersom även låg-bindande pipettspetsar kunde behålla en stor del av provet. Alternativt kan föreslog tillägg av 0,01% Triton-X100 till M9 bufferten var tidigare16. För att säkerställa att ingen död C. elegans eller bakterier kommer att påverka resultaten, utfört sackaros floatation efter insamling av nematoder kan vara14. Detta görs vanligen efter flytande odling för att ta bort medlet. I detta experiment utelämnades denna rengöring, eftersom sackaros metaboliseras till glukos och fruktos, således potentiellt confounding våra resultat.
Vanligtvis utförs en storskalig kultur av C. elegans med flytande media. Flytande odling, dock lämpar sig inte för alla experimentella inställningar, särskilt när du använder avläsning som kräver exakta siffror av nematoder. En ändring av den Baerman apparaten beskrevs tidigare för att sortera och rena nematoder som härrör från flytande kultur17. Denna metod kraftigt minskar bakteriell kontaminering och filtrerar endast vuxna nematoder genom en flera komponent filtersystem. Detta elegant metod begränsas av den långa filtrering tid (2-6 h) vid rumstemperatur, som kunde blanda ihop metabola analyser. När det gäller filtrering tekniken, är nematoder sorterade efter deras rörliga aktiviteter. Nematoder måste passa nog krypa självständigt genom porerna i filter från olika material. Således kan resultaten snedvridas av exklusive nematoder som är försvagade av de experimentella behandlingarna.
Att kombinera vätska och plattan kulturer i en experimentell design kan också tjäna som en confounder i senare analyser. C. elegans utvecklar en tunnare och längre fenotyp i flytande kultur, vilket gör det svårt att jämföra parametrar normaliserats till massa, proteinhalt, eller kropp längd och bredd2. Dessutom är studien av reaktiva ämnen utmanande i flytande kultur, eftersom reaktiva ämnen kommer sannolikt ändras eller inaktiveras av mediekomponenter innan den når nematoder. Även om storskaliga prover av C. elegans kan erhållas med detta protokoll, är plattan kulturen själv mer arbetskrävande än flytande kultur. Dock finns det vissa sätt att underlätta hanteringen (t.ex., med användning av en agar-dispensering maskin). Ett annat alternativ att främja storskaliga kultur effektivt är användningen av petriskålar med större diameter för produktion av agarplattor. Detta alternativ kan vara begränsningen av de efterföljande analyserna. För mikroskopisk bedömning eller plattan hantering i allmänhet, minska bekvämligheter med diametern på skålen.
Flera hög genomströmning tillvägagångssätt lämpar sig för bedömning av olika parametrar, såsom kemiska eller drogkontroll, har varit utvecklade och undersökte18. Mikroflödessystem enheter tillåter forskare att studera olika parametrar, som visas i en modell av typ 2-diabetes19. Livslängd, lipidmetabolismen och oxidativ stress Svaren kan samtidigt bedömas på en singel-djur nivå, avslöjar fördelarna med hög-innehåll screening, som integrerar fenotypiska med biokemiska information. Bedömningen av tillförlitligheten och reproducerbarhet av den aktuella litteraturen har redan visat en stor förfining av dessa tekniker, utöver proof-of-concept studier18. Överkomliga priser, särskilt för mindre laboratorier, är fortfarande problematiskt, eftersom enheterna måste ofta anpassas enligt experimentella behov, som kan bli kostsamma.
Kvantifiering av åldrar i C. elegans kompliceras av ogenomtränglig nagelbanden av Nematoden. En vanligt förekommande metod är detektion av åldrar via Immunofluorescerande infärgning6. På grund av nagelband behövs större prover storlekar för att minska höga variansen av resultaten. Imaging måste beaktas som en faktor som är tidskrävande.
Protokollet för hela kroppen lysate beredning beskrivs här gör intracellulära åldrar och andra komponenter i C. elegans tillgängliga för analyser. LC-MS/MS mätningar av C. elegans prover har utförts innan14. Adekvat odling villkor, men har för att uppnå ett tillräckligt antal nematoder, inte beskrivits i detalj, ännu.
Den metod som beskrivs i detta protokoll är användbart för avläsning som kräver en storskalig, likartad vuxit befolkningen av C. elegans, eller en kombination av flera utläsningar per experiment. Detta är särskilt praktiskt för att studera komplexa multifaktoriella sjukdomar såsom diabetes och dess komplikationer. Alternativa strategier, såsom hög genomströmning och hög-innehåll screening använder mikroflödessystem system, är tekniskt mer avancerade och kan ge större och medelstora data. Deras huvudsakliga applikation kan för närvarande ses i kemiska och drogkontroll eller genetisk screening för mutanter som svarar på de experimentella behandlingarna. Detta protokoll hjälper forskare att enkelt och billigt skala upp storleken på deras nuvarande eller framtida projekt utan behov av justering av nuvarande experimentell avläsning och, därmed, att minimera förlust av tid i samband med etableringen av nya metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschafts (DFG) inom den IRTG 1874 ”mikrovaskulära diabeteskomplikationer” och CRC 1118 ”reaktiva metaboliter som en orsaka för sena diabeteskomplikationer”. C. elegans stammar N2 och CL2166 lämnades av CGC, som finansieras av NIH kontoret infrastruktur forskningsprogram (P40 OD010440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli OP50 | CGC | n/a | |
| C. elegans N2 | CGC | n/a | |
| C. elegans CL2166 | CGC | n/a | |
| Petri dish, 60 mm x 15 mm | Greiner One | 628161 | |
| Volumetric pipet, glas, 10 mL | Neolab | E-0413 | |
| Proteinase inhibitor cocktail tablets | Roche | 04693124001 | |
| Non-denaturing lysate buffer: | |||
| Tris-HCl, pH 8 | Sigma | T3253 | |
| Sodiumchloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E5391 | |
| 96-well plates, transparent bottom | Brand | 781611 | |
| Infinite M200, plate reader | Tecan | 30017581 | |
| Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm | Next advance | ZROB05-RNA | |
| Bullet Blender, homogenizer | Next advance | BBX24 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P6887 | |
| Thymol | Sigma | T0501 | |
| Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P6911 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P43339 | |
| Prolidase from Porcine Kidney | Sigma | P6675 | |
| Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica | Sigma | A8200 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Merckmillipore | UFC501096 | |
| Basic Materials for plate culture are described in Reference 6. |
References
- Fronius, M., Clauss, W. G. Mechano-sensitivity of ENaC: may the (shear) force be with you. Pflügers Archiv. 455 (5), 775-785 (2008).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , Available from: http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html (2006).
- Altun, Z. F., Hall, D. H. Nervous system, general description. WormAtlas. , Available from: http://www.wormatlas.org/hermaphrodite/nervous/Neuroframeset.html (2011).
- Sohn, E. H., et al. Retinal neurodegeneration may precede microvascular changes characteristic of diabetic retinopathy in diabetes mellitus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (19), E2655-E2664 (2016).
- Chilelli, N. C., Burlina, S., Lapolla, A. AGEs, rather than hyperglycemia, are responsible for microvascular complications in diabetes: a "glycoxidation-centric" point of view. Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Diseases. 23 (10), 913-919 (2013).
- Schlotterer, A., et al. C. elegans as model for the study of high glucose- mediated life span reduction. Diabetes. 58 (11), 2450-2456 (2009).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Leiers, B., et al. A stress-responsive glutathione S-transferase confers resistance to oxidative stress in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology and Medicine. 34 (11), 1405-1415 (2003).
- Rabbani, N., Thornalley, P. J. Measurement of methylglyoxal by stable isotopic dilution analysis LC-MS/MS with corroborative prediction in physiological samples. Nature Protocols. 9 (8), 1969-1979 (2014).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 7 (72), 248-254 (1976).
- Ahmed, N., Argirov, O. K., Minhas, H. S., Cordeiro, C. A., Thornalley, P. J. Assay of advanced glycation endproducts (AGEs): surveying AGEs by chromatographic assay with derivatization by 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamate and application to Nepsilon-carboxymethyl-lysine- and Nepsilon-(1-carboxyethyl)lysine-modified albumin. Biochemical Journal. 364 (Pt 1), 1-14 (2002).
- Thornalley, P. J., et al. Quantitative screening of advanced glycation endproducts in cellular and extracellular proteins by tandem mass spectrometry. Biochemical Journal. 375 (Pt 3), 581-592 (2003).
- Karachalias, N., Babaei-Jadidi, R., Ahmed, N., Thornalley, P. Accumulation of fructosyllysine and advanced glycation end products in the kidney, retina and peripheral nerve of streptozotocin-induced diabetic rats. Biochemical Society Transactions. 31, 1423-1425 (2003).
- Morcos, M., et al. Glyoxalase-1 prevents mitochondrial protein modification and enhances lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 7 (2), 260-269 (2008).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Lagido, C., McLaggan, D., Glover, L. A. A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (105), e53083 (2015).
- Takamiya, S., Mita, T. Large-scale purification of active liquid-cultured Caenorhabditis elegans using a modified Baermann apparatus. Parasitology International. 65 (5 Pt B), 580-583 (2016).
- Cornaglia, M., Lehnert, T., Gijs, M. A. M. Microfluidic systems for high-throughput and high-content screening using the nematode Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 17 (22), 3736-3759 (2017).
- Zhu, G., Yin, F., Wang, L., Wei, W., Jiang, L., Qin, J. Modeling type 2 diabetes-like hyperglycemia in C. elegans on a microdevice. Integrative Biology. 8 (1), 30-38 (2016).
