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Biochemistry

थाली आधारित Caenorhabditis एलिगेंसकी बड़े पैमाने पर खेती: मधुमेह में चयापचय परिवर्तन के अध्ययन के लिए नमूना तैयारी

Published: August 24, 2018 doi: 10.3791/58117
Automatic Translation
1, 2,3, 1, 1,4, *1, *1
15th Medical Department, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 2Department of Internal Medicine, Heidelberg University, 3German Center for Diabetes Research (DZD), 4European Center for Angioscience, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल ठोस मीडिया पर Caenorhabditis एलिगेंस की बड़े पैमाने पर खेती के लिए एक विधि का वर्णन । तरल संस्कृति के लिए एक विकल्प के रूप में, इस प्रोटोकॉल प्लेट आधारित खेती के तहत विभिंन तराजू के मापदंडों को प्राप्त करने की अनुमति देता है । यह तरल और ठोस मीडिया संस्कृति के बीच रूपात्मक और चयापचय मतभेदों को छोड़ कर परिणामों की तुलना बढ़ जाती है ।

Abstract

संवर्धन Caenorhabditis एलिगेंस (सी. एलिगेंस) पर बड़े पैमाने पर तरीके से आगार प्लेटों समय लेने वाली और मुश्किल हो सकता है । इस प्रोटोकॉल एक पश्चिमी दाग, जन स्पेक्ट्रोमेट्री, या आगे प्रोटियोमिक् विश्लेषण के साथ आगे बढ़ना करने के लिए प्रोटीन के अलगाव के लिए जानवरों की एक बड़ी संख्या प्राप्त करने के लिए एक सरल और सस्ती विधि का वर्णन । इसके अलावा, immunostainings और एक ही संवर्धन शर्तों के तहत कई विश्लेषण के एकीकरण के लिए निमेटोड संख्या की वृद्धि आसानी से प्राप्त किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, विभिंन प्रायोगिक शर्तों के साथ प्लेटों के बीच एक स्थानांतरण की सुविधा है । प्लेट संस्कृति में आम तकनीक एक एलिगेंस एक प्लेटिनम तार का उपयोग कर और आबादी वाले आगर एक स्केलपेल का उपयोग कर हिस्सा के हस्तांतरण का स्थानांतरण शामिल है । हालांकि, निमेटोड संख्या बढ़ाने के साथ, इन तकनीकों पीढ़ी समय लेने वाली हो जाते हैं । इस प्रोटोकॉल कई कदम कृमि के फिजियोलॉजी पर नमूना तैयारी के प्रभाव को कम करने सहित सी एलिगेंस की बड़े पैमाने पर संस्कृति का वर्णन । द्रव और कतरनी तनाव की उंर और सी एलिगेंसमें चयापचय प्रक्रियाओं को बदल सकते हैं, इस प्रकार महत्वपूर्ण कदम का एक विस्तृत वर्णन की आवश्यकता के लिए विश्वसनीय और reproducible परिणाम प्राप्त करने के लिए । C. एलिगेंस एक मॉडल जीव है, एक तिहाई तक के लिए ंयूरॉन कोशिकाओं से मिलकर, लेकिन रक्त वाहिकाओं की कमी, इस प्रकार की संभावना को पूरी तरह से संवहनी नियंत्रण के स्वतंत्र न्यूरॉन परिवर्तन की जांच प्रदान । हाल ही में, मधुमेह रेटिनोपैथी में जल्दी neurodegeneration संवहनी परिवर्तन करने से पहले पाया गया था । इस प्रकार, सी एलिगेंस मधुमेह जटिलताओं के सामान्य तंत्र का अध्ययन करने के लिए विशेष रुचि का है । उदाहरण के लिए, उन्नत glycation अंत उत्पादों (उम्र) और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) का एक बढ़ा गठन मनाया जाता है, जो reproducibly सी एलिगेंसमें पाए जाते हैं । जांच के एक व्यापक स्पेक्ट्रम के लिए पर्याप्त आकार के नमूनों को संभालने के लिए प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत कर रहे हैं, मधुमेह के अध्ययन से प्रेरित जैव रासायनिक परिवर्तन उदाहरण. सामांय में, इस प्रोटोकॉल बड़ी सी. एलिगेंस संख्या की आवश्यकता है और जिसमें तरल संस्कृति उपयुक्त नहीं है अध्ययन के लिए उपयोगी हो सकता है ।

Introduction

प्रोटीन विश्लेषण, जैसे कि एक पश्चिमी दाग या मास स्पेक्ट्रोमेट्री, प्रोटीन की मिलीग्राम की आवश्यकता होती है । इस उपज के लिए सी. एलिगेंसके सैकड़ों की एक बड़े पैमाने संवर्धन की आवश्यकता है, जो या तो तरल संस्कृति या ठोस मीडिया पर धोने से सूत्रकृमि स्थानांतरित करने के लिए पूरा किया जा सकता है । द्रव और कतरनी तनाव उपकला सोडियम चैनलों की अभिव्यक्ति लाती है (ENaC), जो सोडियम की एक वृद्धि की बढ़ी के माध्यम से आसमाटिक तनाव में वृद्धि कर सकता है, संभावित सी. एलिगेंस की उम्र में फेरबदल और चयापचय विश्लेषण को प्रभावित1 . इसलिए, प्लेट आधारित दृष्टिकोण के लिए इस प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण कदम खाते में प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता को प्रभावित करने के तनाव की कमी ले । तरल संस्कृति, दूसरी ओर, सूत्रकृमि के phenotype को प्रभावित करता है और संस्कृति और सूत्रकृमि2की एक सटीक संख्या के संग्रह पेचीदा । इसके अलावा, प्रतिक्रियाशील पदार्थ मीडिया घटकों द्वारा बदला जा सकता है और सूत्रकृमि तक पहुंचने से पहले असमान रूप से वितरित कर सकते हैं । तरल संस्कृति की सीमाओं के बारे में, इस प्रोटोकॉल सी. एलिगेंसके बड़े पैमाने पर नमूनों संवर्धन करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान करता है ।

C. एलिगेंस ३०२ न्यूरॉन कोशिकाओं के एक अलग नेटवर्क के साथ एक मॉडल जीव है, अपने सभी कोशिकाओं3में से एक तिहाई बनाने. विज्ञान में अपनी शुरूआत के बाद से, कई मुताबिक़ और orthologous जीन का वर्णन किया गया है, चिकित्सा अनुसंधान के लिए एक मॉडल के रूप में अपने मूल्य बढ़ाना । हाल ही में, मधुमेह रेटिनोपैथी में स्नायविक हानि, पूर्ववर्ती संवहनी क्षति के लिए सबूत,4प्रस्तुत किया गया है । C. एलिगेंस रक्त वाहिकाओं की कमी है, लेकिन एक विशिष्ट ंयूरॉंस नेटवर्क शामिल है, यह एक उपयुक्त मॉडल संवहनी लोगों से अलग न्यूरॉन परिवर्तन की जांच करने के लिए बना । इस प्रकार, सी एलिगेंस मधुमेह जटिलताओं के सामान्य तंत्र का अध्ययन करने के लिए विशेष रुचि का है । मधुमेह जटिलताओं में जैव रासायनिक परिवर्तन उंर के गठन, जो आगे hyperglycemia5के जवाब में ROS के गठन को प्रभावित शामिल है । आयु C. एलिगेंस में पाया जाता है और ंयूरॉन क्षति6में योगदान । पुराने रोगों अक्सर जटिल के कारण होते हैं, polygenic प्रक्रियाओं उनके अंतर्निहित तंत्र के आकलन के लिए एक multiparametric दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है, के रूप में मधुमेह जटिलताओं के आकलन के साथ यहाँ उदाहरण. इस प्रोटोकॉल का उपयोग कई मापदंडों को एक साथ प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है, साथ ही बाद में । वृद्धि की तुलना और एक multiparametric दृष्टिकोण के reproducibility तरल और ठोस मीडिया संस्कृति के बीच रूपात्मक और चयापचय मतभेदों को छोड़ कर प्राप्त किया जा सकता है ।

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Protocol

नोट: यह प्रोटोकॉल पांच अनुभागों में विभाजित है । वर्गों में 1 – 3, एक बड़े पैमाने पर संस्कृति सी. एलिगेंस करने के लिए मुख्य प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है. 4 वर्गों और 5 मधुमेह चयापचयों में होने वाली उदाहरण चयापचयों के आकलन के लिए अतिरिक्त प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । विस्तार में, खंड 1 प्लेटों पर एक सामांय बड़े पैमाने पर संस्कृति का वर्णन । धारा 2 सी. एलिगेंसकी बड़ी मात्रा के हस्तांतरण पर केंद्रित है, जबकि धारा 3 एक बड़े पैमाने पर नमूने की कटाई बताते हैं । 4 अनुभाग नमूना और 5 खंड से प्रोटीन अलगाव बताते है नमूना तैयार बाद तरल क्रोमैटोग्राफी के लिए-मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (नियंत्रण रेखा-ms/

1. प्लेटों पर बड़े पैमाने पर संस्कृति

  1. सामांय में, एक बाँझ डाकू के तहत या एक खुली लौ के लिए अगले के लिए संदूषण से बचने के लिए काम करते हैं ।
  2. संस्कृति कीड़े तक वे युवा वयस्क मंच तक पहुंचने के लिए, निंनलिखित रूपांतरों के साथ इस पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल7 का पालन करें ।
    1. उपयोग रहने वाले ई कोलाई OP50 बैक्टीरिया सूत्रकृमि को खिलाने के लिए और ४०० µ मीटर fluorodeoxyuridine आगर (एम्पीसिलीन/FUdR नहीं) प्रयोगों के लिए तैयार करते हैं ।
    2. एक तुल्यकालिक जनसंख्या की तैयारी के लिए, ध्यान केंद्रित OP50 का उपयोग करें, और वयस्कों के साथ प्रयोग सफल होने के लिए, 3.3 x केंद्रित OP50 supernatant के ७०% को हटाने के द्वारा उपयोग करें ।
    3. दैनिक खिला अंतराल की सिफारिश की है । जब ऑक्सीडेटिव तनाव का आकलन, भोजन के लिए विभिंन अंतराल और मात्रा परिणामों के साथ हस्तक्षेप हो सकता है ।
    4. टीका के लिए, कई सूत्रकृमि के साथ एक थाली ले और यह लगभग ०.५ x 1 cm2 के टुकड़ों में एक स्केलपेल के साथ कटौती । निमेटोड विकास मीडिया (NGM) के व्यास में ६० मिमी की प्लेटों पर दो से तीन टुकड़े हस्तांतरण, ध्यान केंद्रित OP50 युक्त ।
    5. तनाव के लिए उपयुक्त तापमान पर प्लेटें मशीन (जंगली प्रकार N2 20 डिग्री सेल्सियस पर कल्चरित किया जाना चाहिए) जब तक अंडे थाली पर दिखाई दे रहे हैं ।
    6. M9 बफर के 2 मिलीलीटर के साथ अंडे और वयस्क जानवरों के सबसे दूर धोने और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में उन्हें इकट्ठा । 2 मिनट के लिए ८०० x g पर निलंबन केंद्रापसारक । इस बीच ब्लीचिंग सॉल्यूशन की तैयारी शुरू ।
    7. बाहर केंद्रापसारक ट्यूब ले लो और एक 10 मिलीलीटर प्लास्टिक के साथ M9 बफर हटा दें । ब्लीचिंग सॉल्यूशन के 10 मिलीलीटर डालें और भंवर पर तब तक मिक्स करें जब तक वयस्क सूत्रकृमि लीजड ड न हो जाएं । यह आमतौर पर लगभग .5-7 मिनट लेता है, लेकिन 15 मिनट से अधिक समय नहीं लेना चाहिए या अंडे पूरी तरह से प्रयोग में पर बाद में विकसित नहीं होगा ।
    8. 2 मिनट के लिए ८०० x g पर निलंबन केंद्रापसारक 10 मिलीलीटर M9 बफर के साथ 3 बार धो ब्लीचिंग समाधान से अंडे साफ करने के लिए ।
    9. अब OP50 प्लेट्स पर अंडे के सस्पेंशन की १५० µ एल जोड़ें । प्रत्येक प्लेट पर 200-300 अंडे का घनत्व पहुंचा जाना चाहिए । जब तक सूत्रकृमि प्रौढ़ अवस्था में पहुँच जाएँ तब तक प्रतीक्षा करें.
      नोट: M9 बफ़र (pH ७.०) चित्रित प्रयोगों के लिए उपयोग निम्नलिखित पदार्थ होते हैं: 22 मिमी KH2पीओ4, ४२ मिमी ना2HPO4, और ८६ मिमी NaCl. मिश्रण को autoclaving के बाद इसमें 1 mM MgSO4 डालें । ब्लीचिंग सॉल्यूशन में ०.५ मीटर NaOH, आसुत जल में २.३ एमएम NaOCl हल होते हैं ।
    10. एक कट टिप के साथ बाँझ M9 बफर, बाँझ पिपेट युक्तियाँ तैयार कीड़े धोने के लिए, और 15 मिलीलीटर ट्यूबों में उन्हें इकट्ठा करने के लिए
    11. प्लेटों पर M9 बफर के लगभग 1 मिलीलीटर लागू करें, धीरे झूलते और धीरे प्लेट बंद सूत्रकृमि प्लास्टिक द्वारा बफर वितरित ।
    12. अब, सूत्रकृमि ट्यूब में इकट्ठा । प्लेटों पर सीधे निलंबन के १५० µ एल लागू करें (OP50 के साथ बीज) कट पिपेट युक्तियों के साथ, और सूत्रकृमि के घनत्व microscopically का मूल्यांकन (अनुशंसित: 50-100 सूत्रकृमि प्रति ६० mm प्लेट) ।
    13. यदि वे भी घने हैं, M9 बफर के साथ निलंबन पतला और यह माइक्रोस्कोप के तहत मूल्यांकन जब तक वांछित घनत्व तक पहुंच गया है । उपज बहुत कम है, तो कीड़े बसने या ८०० एक्स जी पर निलंबन 10 एस के केंद्रापसारक द्रव को दूर करने के लिए करते हैं ।
      नोट: पर्याप्त घनत्व का एक उदाहरण चित्रा 1a (macroscopic) में दिया गया है और 20X वृद्धि पर 1b (माइक्रोस्कोपिक) । बताए गए अनुसार empirically गुजार ।
    14. ध्यान रखें कि कीड़े जल्दी से नीचे बसने । प्लेटों के बीच एक समान वितरण सुनिश्चित करने के लिए, हर स्टैक प्लेट्स के बाद ट्यूब पलटना (4 – 5 प्लेट्स).
      नोट: कट पिपेट टिप, साथ ही कोमल झूलते और प्लेटों की धुलाई, कतरनी तनाव कम कर देता है ।

2. Caenorhabditis एलिगेंस की बड़ी मात्रा का अंतरण

  1. M9 बफर के लगभग ५०० µ एल के साथ सूत्रकृमि बंद धो, उंर और प्लेटों की सूखापन पर निर्भर करता है । एक ही बफर का प्रयोग, सूत्रकृमि अलग दोहराने जब तक जानवरों के अधिकांश निलंबन में एकत्र कर रहे हैं ।
  2. धीरे से एक कट पिपेट टिप के साथ सूत्रकृमि ले और उंहें एक OP50 के साथ तैयार की थाली पर स्थानांतरण । प्लेट को सूखने दें ।
    नोट: अनुशंसित वॉल्यूम से अधिक लागू नहीं करने के लिए सावधान रहें । विशेष रूप से लंबी अवधि के प्रयोगों में, प्लेटें इसे बर्दाश्त नहीं कर सकती और आगर टूट सकता है, सूत्रकृमि को दरारों में क्रॉल करने की अनुमति देता है ।

3. एक बड़े Caenorhabditis एलिगेंस नमूना की फसल

  1. चयनित विधि के आधार पर, C. एलिगेंसकी पर्याप्त मात्रा के साथ प्रयोग प्रारंभ करें । नियंत्रण रेखा के लिए, एमएस/एमएस विश्लेषण, 20 प्लेटें (६० मिमी x 15 मिमी) प्रति समूह लगभग १०० सूत्रकृमि प्रति थाली के साथ तैयार करने के लिए कम से २०० µ के प्रति प्रोटीन की एक उपज सुनिश्चित करने के लिए नमूना ।
    नोट: प्रोटोकॉल का यह हिस्सा बाँझ शर्तों के तहत काम करने की आवश्यकता नहीं है अब, के रूप में सूत्रकृमि और एकत्र किया जाएगा जमे हुए ।
  2. नमूना संग्रह के दिन पर, एकत्रित नमूनों स्नैप-फ़्रीज़ करने के लिए लिक्विड नाइट्रोजन तैयार करें । निमेटोड के चयापचय को धीमा करने के लिए बर्फ पर गैर बाँझ M9 बफर रखें.
  3. M9 बफर की 1 मिलीलीटर लगाने और धीरे प्लेटों घूमता द्वारा प्लेटों से सी. एलिगेंस से धो लें । यह मृतक सूत्रकृमि और सबसे अंडे का संग्रह से बचा जाता है, अगर कोई मौजूद हैं, क्योंकि वे बैक्टीरिया और आगर से चिपके रहते हैं ।
  4. मात्रा ले लो और यह एक 15 मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण ।
  5. पूरा नमूना के संग्रह के बाद, सूत्रकृमि बसने के लिए प्रतीक्षा करें या ८०० x g पर संक्षेप में ट्यूब केंद्रापसारक और M9 बफर के अधिकांश हटा दें । M9 के लगभग 10 मिलीलीटर के साथ नमूना 3x धो (10x नमूना मात्रा) किसी भी बैक्टीरिया को दूर करने के लिए ।
    नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी मृतक सूत्रकृमि को हटा दिया जाए, सुक्रोज फ्लोटिंग एक और विकल्प है । हालांकि, यह प्रदर्शित प्रयोगों15के लिए उपयुक्त नहीं था । सुक्रोज ग्लूकोज और फ्रुक्टोज को hydrolyzed है । चित्रित प्रयोगों में जीर्ण मधुमेह में पाए जाने वाले जैव रासायनिक परिवर्तनों को बढ़ावा देने के लिए ग्लूकोज की भूमिका का आकलन किया गया. इस प्रकार, सुक्रोज फ्लोटिंग संभावित परिणाम मिल सकता है ।
  6. एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब M9 बफर की 1 मिलीलीटर और एक खाली १.५ एमएल ट्यूब के साथ हर नमूने के लिए तैयार करें । 15 एमएल ट्यूब से खाली १.५ एमएल ट्यूब के लिए एक गिलास प्लास्टिक के साथ गोली स्थानांतरण । यह कदम एक मात्रात्मक स्थानांतरण सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
    नोट: पिछले कदम के दौरान विपरीत, यहां सूत्रकृमि अधिक ध्यान केंद्रित कर रहे हैं । प्लास्टिक प्लास्टिक सुझावों के लिए एक संभव पालन की वजह से, नमूना का एक बड़ा हिस्सा की हानि की उम्मीद है. इसलिए, इसके बजाय ग्लास पिपेट का उपयोग करें ।
  7. हस्तांतरण के बाद, ग्लास पिपेट का उपयोग करने के लिए 1 मिलीलीटर M9 बफर से दूसरी १.५ मिलीलीटर ट्यूब से कुल्ला करने के लिए सूत्रकृमि पिपेट दीवार । साथ ही, बचे हुए सूत्रकृमि को 15 एमएल ट्यूब से धो लें और उन्हें सैंपल ट्यूब पर ट्रांसफर कर दें ।
  8. 1 मिनट के लिए १९,००० x g पर नमूना ट्यूब केंद्रापसारक और फिर जितना संभव हो उतना supernatant निकालें ।
  9. Parafilm के साथ ट्यूब सील और तुरंत स्नैप-यह तरल नाइट्रोजन में फ्रीज । lysate तैयारी तक-८० ° c पर ट्यूब की दुकान ।

4. जन स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए प्रोटीन अलगाव

नोट: प्रोटीन अलगाव यहां वर्णित भी अंय परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (जैसे, पश्चिमी दाग) ।

  1. जमे हुए नमूने के लिए, ०.५ mm zirconium ऑक्साइड मोतियों की एक ही मात्रा में जोड़ने के लिए और एक proteinase अवरोध करनेवाला कॉकटेल युक्त lysate बफर की मात्रा कम 2x ।
    नोट: चित्रित सूत्रकृमि-प्रोटीन सहसंबंध विश्लेषण बफ़र के १०० µ l का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया । LC-ms/एमएस नमूने बफर के २०० µ एल के साथ लीजड ड थे ।
  2. 9 गति पर 1 मिनट के लिए homogenizer प्रारंभ करें । सुनिश्चित करें कि नमूने पूरी तरह से लीजड ड हैं । यदि वे पूरी तरह लीजड ड नहीं हैं, तो इस चरण को दोहराएँ ।
  3. १९,००० x gपर 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए नमूने केंद्रापसारक बर्फ पर एक नई ट्यूब के लिए supernatant स्थानांतरण और यह दुकान पर-८० ° c जब तक आगे माप लिया जा करने के लिए जा रहे हैं ।
    नोट: चित्रित प्रयोगों के लिए उपयोग किए गए गैर-denaturing बफ़र निम्न पदार्थ होते हैं: 20 मिमी Tris एचसीएल (पीएच 8), १३७ मिमी NaCl, 1% ट्राइटन-एक्स, और 2 मिमी EDTA.
    नोट: इस प्रोटोकॉल के चरणों का पालन करने और होने का सुझाव दिया पैमाने पर लागू किया, लगभग १,००० सूत्रकृमि से एक प्रोटीन गोली की उपज लगभग ५०० µ जी होना चाहिए अधिक तुलना के लिए, चित्रा 2 और प्रतिनिधि परिणामसे परामर्श करें ।

5. तरल क्रोमैटोग्राफी के लिए नमूना तैयारी-मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री माप

नोट: ब्याज के पैरामीटर के आधार पर, नमूना तैयारी अलग होगा । यह प्रोटोकॉल methylglyoxal और आयु निर्धारण पर केंद्रित है ।

  1. उपाय intracellular methylglyoxal के साथ derivatization द्वारा 1, 2-diaminobenzene (DB) के रूप में पहले वर्णित9।
    1. Homogenize के 20 µ एल के साथ नमूनों को ठंडा 20% (wt/vol) trichloroacetic एसिड में ०.९% (wt/vol) सोडियम क्लोराइड और ८० µ एल के एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में पानी ।
    2. आंतरिक मानक (13सी3-MG; ४०० एनएम) के साथ 5 µ l के नमूनों को स्पाइक, उन्हें भंवर द्वारा मिश्रण, और फिर उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए २१,००० x g पर केंद्रापसारक ।
    3. स्थानांतरण ३५ µ l का supernatant के लिए एक २०० µ एल ग्लास insert युक्त HPLC नमूना शीशी ।
    4. 3% सोडियम azide के 5 µ एल जोड़ें (wt/vol) प्रत्येक नमूने के लिए २०० mm एचसीएल में ०.५ mm DB के 10 µ l के बाद ०.५ mm diethylenetriaminepentaacetic एसिड (DETAPAC) पानी में शामिल है ।
    5. कमरे के तापमान पर 4 एच के लिए नमूनों की मशीन, प्रकाश से सुरक्षित ।
    6. द्वारा नमूनों का विश्लेषण LC-ms/ms, के रूप में पहले9वर्णित है ।
      नोट: उम्र के माप के लिए, प्रोटोकॉल के खंड 4 में वर्णित के रूप में प्रोटीन को अलग.
  2. मापने के प्रोटीन एकाग्रता (गल) एक ब्रैडफोर्ड परख10का उपयोग lysates ।
    1. एक मानक वक्र के लिए 30 µ l के aliquots तैयार गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) के साथ नुकीला फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पंजाब) निम्नलिखित एकाग्रता में हल: 0; ०.१; ०.२; ०.३; ०.४; ०.६; ०.८; और १.० मिलीग्राम/डीएल ।
      नोट: नमूना सुझाया गया आकार पर तैयार किया गया था (देखें चरण ४.१ २०० µ l के साथ lysate की तैयारी के लिए बफ़र की), अनुमानित एकाग्रता की श्रेणी में होना चाहिए लगभग 2 – 7 मिलीग्राम/एमएल. इस मामले में, पंजाबियों के साथ 1:10 नमूनों को माप से पहले पतला करें ।
      नोट: पहले इस विधि का उपयोग प्रयोगों के लिए, यह अलग कमजोर पड़ने में नमूनों को मापने के लिए सिफारिश की है (1, 1:10, और 1:100). के रूप में वहां सूत्रकृमि की संख्या का कोई सटीक दृढ़ संकल्प है, उपज व्यक्तिगत शोधकर्ताओं के बीच अलग कर सकते हैं ।
    2. एक पारदर्शी ९६-well प्लेट (polystyrene) और प्रत्येक मानक एकाग्रता के पिपेट 10 µ एल का उपयोग करें और कुओं में डुप्लिकेट में चुना कमजोर पड़ने वाले नमूनों में ।
    3. पतला प्रोटीन परख डाई एजेंट आसुत जल (वायुके साथ 1:5 ध्यान केंद्रित । लक्ष्य.) और प्लेट पर हर नमूने के लिए कमजोर पड़ने के २०० µ एल जोड़ें । कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए थाली मशीन ।
    4. एक प्लेट रीडर के साथ ५९५ एनएम पर 30 मिनट के भीतर अवशोषक उपाय । नमूनों को परिकलित मानक वक्र से दुओं किया जा सकता है । विधि का अधिक विवरण साहित्य10में बड़े पैमाने पर वर्णित किया गया है ।
  3. intracellular उंर के रूप में पहले11,12वर्णित उपाय ।
    1. धो कुल प्रोटीन अर्क (लगभग २०० µ छ) 3x में ultracentrifugation द्वारा पानी के साथ 10 केडीए केंद्रापसारक फ़िल्टर इकाइयों ।
    2. १०० mM HCl के 10 µ l जोडे, पेप्सिन के 10 µ एल (20 मिमी एचसीएल में 2 मिलीग्राम/एमएल), और थाइमॉल के 10 µ एल (20 मिमी एचसीएल में 2 मिलीग्राम/एमएल) के लिए बरामद प्रोटीन (लगभग १०० µ एल) और ३७ डिग्री सेल्सियस पर नमूनों में गर्मी के लिए 24 ज ।
    3. बेअसर और बफर के नमूने पीएच ७.४ पर जोड़कर १२.५ µ एल के ०.५ एम पोटेशियम फॉस्फेट बफर (पीएच ७.४) और 5 µ एल के २६० mM KOH.
    4. Pronase E के 10 µ l जोड़ें [2 मिलीग्राम/एमएल 10 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट बफर (पीएच ७.४)] और एक पेनिसिलिन-streptomycin समाधान के 10 µ l, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए नमूनों की मशीन ।
    5. aminopeptidase के 10 µ l जोड़ें [2 मिलीग्राम/10 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट बफर (पीएच ७.४)] में और 10 µ l prolidase के एल [2 मिलीग्राम/एमएल में 10 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट बफर (पीएच ७.४)], और के लिए ३७ ° c पर नमूनों की मशीन ४८ एच.
    6. नियंत्रण रेखा से परिणामी hydrolysate-ms/ms, के रूप में पहले वर्णित12विश्लेषण ।

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Representative Results

यहाँ मधुमेह अनुसंधान में आवेदनों के लिए बड़े पैमाने पर सी. एलिगेंस कल्चर बनाने के उदाहरण प्रस्तुत किए गए हैं. यह ब्याज की हो सकता है एक ही जानवर के लिए मापदंडों से संबंधित है, बजाय यह कुल प्रोटीन एकाग्रता को सामान्य करने के लिए । सूत्रकृमि की एक छोटी संख्या की आवश्यकता होती है परख में, यह आसानी से सूत्रकृमि गिनती द्वारा पूरा किया जा सकता है । एक बड़े पैमाने पर सी. एलिगेंस प्रयोगात्मक समूह के प्रति सूत्रकृमि के सैकड़ों शामिल संस्कृति के लिए, इस दृष्टिकोण असुविधाजनक है । चित्रा 2में, सी. एलिगेंस और प्रोटीन सामग्री की मात्रा के बीच सहसंबंध दिखाया गया है । जैसा कि यहां का प्रदर्शन किया, reproducible मात्रात्मक प्रोटीन अलगाव इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है ।

Amadori adduct fructosyl-lysine प्रयोगात्मक पशु मॉडल13में मधुमेह के दौरान गठित कई उम्र के अग्रदूतों में से एक है । चित्रा 3 तीन स्वतंत्र प्रयोगों से 12 दिन पुराने सूत्रकृमि और उंर से अलग अनुपचारित नियंत्रण में एक ग्लूकोज उपचार के बाद नियंत्रण रेखा-ms/ सूत्रकृमि lysate बफर के २०० µ एल के एक अतिरिक्त के साथ homogenized थे । उच्च ग्लूकोज के उपचार के बाद fructosyl-lysine का एक बढ़ा गठन प्रस्तुत किया है ।

प्रतिक्रियाशील चयापचयों जैसे methylglyoxal fluctuant हैं और प्रोटीन को शीघ्रता से संशोधित कर14. इसलिए, सवाल रहता है कि क्या उन प्रतिक्रियाशील चयापचयों वास्तव में जीव में संचित या अपने लक्ष्य तक पहुंचने से पहले संशोधित कर रहे हैं । चित्रा 4 पदार्थ के साथ एक इलाज के बाद सी एलिगेंस में methylglyoxal के संचय की पुष्टि करता है ।

ऑक्सीडेटिव तनाव6hyperglycemia के दौरान वृद्धि हुई है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में कतरनी तनाव के दौरान । चित्रा 5 ग्लूकोज का इलाज किया समूह के बीच ऑक्सीडेटिव तनाव के गठन में कोई अंतर नहीं की पुष्टि, प्रोटोकॉल के खंड 2 में के रूप में स्थानांतरित कर दिया, और गैर हस्तांतरित समूह । दोनों का इलाज नियंत्रण समूह में ग्लूकोज-इलाज समूहों की तुलना ऑक्सीडेटिव ग्लूकोज द्वारा प्रेरित तनाव में एक महत्वपूर्ण वृद्धि से पता चलता है । इसके विपरीत, दो ग्लूकोज-व्यवहार समूहों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर देखा गया था । इन परिणामों से वर्णन है कि हैंडलिंग सूत्रकृमि इस प्रोटोकॉल का उपयोग काफी ऑक्सीडेटिव तनाव है, जो उंर बढ़ने या चयापचय की जांच में एक संस्थापक के रूप में सेवा सकता है के गठन को प्रेरित नहीं करता है । इसके अलावा, वर्तमान साहित्य में निष्कर्षों इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर reproduced थे ।

Figure 1
चित्रा 1: प्लेटों पर एक आगे वितरण के लिए सूत्रकृमि का पर्याप्त घनत्व । (क) यह पैनल एक macroscopic दृश्य दिखाता है. (ख) इस पैनल के एक सूक्ष्म दृष्टि से पता चलता है, 20X वृद्धि पर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: वन्य-प्रकार की प्रोटीन सामग्री-type C. एलिगेंस N2. यह पैनल lysate के प्रोटीन यील्ड के लिए सूत्रकृमि की संख्या के सहसंबंध को दिखाता है, के रूप में तैयार प्रोटोकॉल अनुभाग 5 में 12 दिन पुराने सूत्रकृमि में वर्णित(n = 3 lysate of ५०० सूत्रकृमि; n = 3 lysate of १,००० सूत्रकृमि; और n = 1 lysate of १,५०० सूत्रकृमि). प्रतीपगमन रेखा लाल (r2 = ०.९७६, y = ०.६४) में चिह्नित किया गया है । कुल प्रोटीन एकाग्रता ब्रैडफोर्ड विधि का उपयोग कर मापा गया था । डेटा अर्थ ± मानक विचलन (एसडी) के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: C. एलिगेंस N2 के एक ग्लूकोज उपचार के बाद fructosyl-lysine के गठन में वृद्धि हुई है । 12 दिन पुराने सूत्रकृमि और अनुपचारित नियंत्रण में ग्लूकोज के साथ एक इलाज के बाद fructosyl-lysine की सांद्रता LC-ms द्वारा निर्धारित किया गया था/एमएस और ब्रैडफोर्ड विधि द्वारा निर्धारित एक प्रोटीन एकाग्रता के लिए सामान्यीकृत. डेटा मतलब ± एसडी के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । p-मान विद्यार्थी के t-परीक्षण, * *p < ०.०१ द्वारा निर्धारित किए गए थे । परिणाम तीन स्वतंत्र प्रयोगों से हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: सी. एलिगेंस N2 के एक methylglyoxal उपचार के बाद Intracellular methylglyoxal सांद्रता । Methylglyoxal सांद्रता नियंत्रण रेखा से मापा गया-ms/Methylglyoxal के साथ इलाज किया 12 दिन पुराने सूत्रकृमि में ms । नमूने अंतिम उपचार के बाद 2 ज से कम एकत्र किए गए । डेटा सूत्रकृमि की संख्या को सामान्यीकृत मतलब ± एसडी के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । p-मान विद्यार्थी के t-परीक्षण, * *p < ०.०१ द्वारा निर्धारित किए गए थे । परिणाम तीन स्वतंत्र प्रयोगों से हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: ऑक्सीडेटिव तनाव एक ग्लूकोज उपचार के बाद सी. एलिगेंस CL2166 में मापा. ट्रांसजेनिक CL2166 (gst4:: GFP)8 युक्त एक glutathione-एस-ट्रांस्फ़्रेज़ 4-मोटर चालित GFP रिपोर्टर 2 डी के लिए ग्लूकोज युक्त ४०० µ मीटर FUdR प्लेट्स पर कल्चर्ड थे । एक समूह इस प्रोटोकॉल के खंड 2 में वर्णित के रूप में दिन 1 पर ताजा ग्लूकोज प्लेटों को हस्तांतरित किया गया था । ऑक्सीडेटिव तनाव प्रतिदीप्ति में वृद्धि के रूप में मापा गया [सापेक्ष प्रकाश इकाइयों (RLU)] एक प्लेट रीडर के साथ । डेटा मतलब ± एसडी के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । p-मान ANOVA, *p < ०.०५ द्वारा निर्धारित किए गए थे । परिणाम तीन स्वतंत्र प्रयोगों से हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल C. एलिगेंस के बड़े पैमाने संवर्धन के लिए एक विश्वसनीय दृष्टिकोण को मात्रात्मक परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रस्तुत करता है । प्रतिनिधि परिणामोंमें दर्शाए अनुसार साहित्य से निष्कर्षों को दोहराया जा सकता है । हालांकि एलिगेंस के बड़े पैमाने पर नमूनों के संग्रह के लिए इस प्रोटोकॉल एक सीधे आगे विधि की तरह लगता है, वहां कुछ नुकसान के लिए खाते में ले रहे हैं । निमेटोड जनसंख्या के तुल्यकालन के बारे में, इस प्रोटोकॉल सोडियम हाइपोक्लोराइट और सोडियम हीड्राकसीड के साथ जनसंख्या ब्लीचिंग द्वारा एक दृष्टिकोण का वर्णन सूत्रकृमि को नष्ट करने और अंडे पूरी तरह फसल । यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि यह दृष्टिकोण सभी प्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है । ब्लीचिंग समाधान की मात्रा को जनसंख्या आकार के अनुपात के आधार पर, ब्लीचिंग समाधान के नुकसान प्रभाव15भ्रूण के विकास को प्रभावित करता है । विशेष रूप से जब विकासात्मक प्रक्रियाओं का अध्ययन, यह एक महत्वपूर्ण कदम हो सकता है । सूत्रकृमि की हैंडलिंग के विषय में, यह प्रोटोकॉल भर में संभव के रूप में छोटे कतरनी बलों के रूप में लागू करने के लिए महत्वपूर्ण है । अगर देखभाल के साथ नहीं संभाला, सूत्रकृमि की एक बड़ी संख्या में नाश होगा । उस बात के लिए, यह महत्वपूर्ण है कताई समय और गति से अधिक नहीं है । सूत्रकृमि को स्थानांतरित करते समय, घायल सूत्रकृमि की संख्या को कम करने के लिए एक कट पिपेट टिप का उपयोग किया जाना चाहिए । सूत्रकृमि के हस्तांतरण के लिए, बफ़र की सिफारिश की मात्रा से अधिक नहीं होना चाहिए, के रूप में आगर दरार हो सकता है जब यह बहुत नम हो जाता है, सूत्रकृमि को थाली में खुदाई का अवसर दे रही है । जबकि नमूनों का संग्रह, M9 बफर रखा जाना चाहिए बर्फ ठंडा करने के लिए नीचे सूत्रकृमि ' चयापचय धीमी है, खासकर जब चयापचयों या सब्सट्रेट है कि सी एलिगेंस के साथ काम करना होगा नीचा । यह नमूना अच्छी तरह से धोने के लिए महत्वपूर्ण है पूर्व खिला से किसी भी जीवाणु संक्रमण को कम करने के लिए । जब गोली स्थानांतरित, याद है कि कीड़े की एक बड़ी संख्या में प्लास्टिक पिपेट युक्तियों के लिए छड़ी सकता है । अनुशंसित ग्लास पिपेट उपयोग किया जाना चाहिए, के रूप में भी कम बाध्यकारी पिपेट युक्तियां नमूना की एक बड़ी राशि को बनाए रखने सकता है । एक विकल्प के रूप में, ०.०१% ट्राइटन-X100 M9 बफर के अलावा पहले16सुझाव दिया गया था। कोई मृतक सी एलिगेंस या बैक्टीरिया परिणामों को प्रभावित करेगा कि यह सुनिश्चित करने के लिए, सूत्रकृमि के संग्रह के बाद सुक्रोज फ्लोटिंग14प्रदर्शन किया जा सकता है । यह आमतौर पर तरल संवर्धन माध्यम को दूर करने के बाद किया जाता है । इस प्रयोग में, इस सफाई छोड़ दिया गया था, क्योंकि सुक्रोज ग्लूकोज और फ्रुक्टोज में metabolized है, इस प्रकार संभावित हमारे परिणामों को मिला ।

आमतौर पर, सी एलिगेंस के एक बड़े पैमाने पर संस्कृति तरल मीडिया का उपयोग किया जाता है । तरल संवर्धन, तथापि, सभी प्रयोगात्मक सेटिंग्स के लिए उपयुक्त नहीं है, खासकर जब readouts का उपयोग कर जो सूत्रकृमि की सही संख्या की आवश्यकता होती है । Baerman तंत्र के एक संशोधन पहले तरह और शुद्ध सूत्रकृमि तरल संस्कृति17से व्युत्पंन करने के लिए वर्णित किया गया था । इस विधि बहुत जीवाणु संक्रमण कम कर देता है और एक कई घटक फिल्टर प्रणाली के माध्यम से केवल वयस्क सूत्रकृमि फिल्टर । इस सुरुचिपूर्ण विधि लंबे समय फ़िल्टरिंग कमरे के तापमान पर (2-6 ज) द्वारा सीमित है, जो चयापचय विश्लेषण पाया जा सकता है । फ़िल्टरिंग तकनीक के लिए के रूप में, सूत्रकृमि उनके चलती गतिविधियों के द्वारा हल कर रहे हैं । सूत्रकृमि करने के लिए पर्याप्त विभिंन सामग्रियों से फिल्टर के pores के माध्यम से स्वतंत्र रूप से क्रॉल फिट होना चाहिए । इस प्रकार, परिणाम सूत्रकृमि कि प्रयोगात्मक उपचार द्वारा कमजोर कर रहे है को छोड़कर द्वारा विकृत किया जा सकता है ।

एक प्रयोगात्मक डिजाइन में तरल और प्लेट संस्कृतियों के संयोजन भी बाद में विश्लेषण में एक संस्थापक के रूप में सेवा कर सकता है । C. एलिगेंस तरल संस्कृति में एक पतले और लंबे समय तक phenotype विकसित, यह मुश्किल द्रव्यमान, प्रोटीन सामग्री, या शरीर की लंबाई और चौड़ाई2के लिए सामान्यीकृत मानकों की तुलना करने के लिए बना । इसके अलावा, प्रतिक्रियाशील पदार्थों के अध्ययन तरल संस्कृति में चुनौती दे रहा है, के बाद से प्रतिक्रियाशील पदार्थों की संभावना संशोधित या सूत्रकृमि तक पहुँचने से पहले मीडिया घटकों द्वारा निष्क्रिय किया जाएगा. हालांकि सी. एलिगेंस के बड़े पैमाने पर नमूने इस प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त किया जा सकता है, थाली संस्कृति ही अधिक श्रम तरल संस्कृति की तुलना में गहन है । हालांकि, हैंडलिंग की सुविधा के लिए कुछ तरीके हैं (उदा., एक आगार औषधालय मशीन के उपयोग के साथ) । एक अंय विकल्प बड़े पैमाने पर संस्कृति को बढ़ावा देने के लिए कुशलतापूर्वक पेट्री बर्तन के उत्पादन के लिए एक बड़ा व्यास के साथ प्रयोग है प्लेटें । यह विकल्प सफल विश्लेषण द्वारा बाधा हो सकती है । सूक्ष्म मूल्यांकन या सामांय में थाली हैंडलिंग के लिए, सुविधाओं पकवान के व्यास के साथ कम है ।

रासायनिक या ड्रग स्क्रीनिंग के रूप में विभिन्न मापदंडों के आकलन के लिए उपयुक्त एकाधिक उच्च प्रवाह दृष्टिकोण, विकसित किया गया है और18की जांच की । Microfluidic उपकरणों शोधकर्ताओं विभिन्न मापदंडों का अध्ययन करने के लिए अनुमति देते हैं, प्रकार के एक मॉडल में दिखाया गया के रूप में-2 मधुमेह19. उंर, लिपिड चयापचय, और ऑक्सीडेटिव तनाव प्रतिक्रियाओं एक साथ एक ही पशु स्तर पर मूल्यांकन किया जा सकता है, उच्च सामग्री स्क्रीनिंग, जो जैव रासायनिक जानकारी के साथ phenotypic एकीकृत के लाभों का खुलासा । वर्तमान साहित्य की विश्वसनीयता और reproducibility का आकलन पहले से ही इन तकनीकों का एक महान शोधन दिखाया गया है, सबूत के परे जा अवधारणा अध्ययन18। विशेष रूप से छोटी प्रयोगशालाओं के लिए सामर्थ्य, अभी भी समस्याग्रस्त है, के रूप में उपकरणों अक्सर प्रयोगात्मक जरूरतों के अनुसार अनुकूलित किया जाना है, जो महंगा साबित हो सकता है ।

सी. एलिगेंस में युगों का ठहराव निमेटोड के अभेद्य छल्ली से जटिल है. एक सामांय रूप से इस्तेमाल किया विधि immunofluorescent दाग6के माध्यम से उंर का पता लगाने है । छल्ली के कारण, बड़े नमूनों के आकार परिणामों के उच्च प्रसरण को कम करने के लिए आवश्यक हैं । इमेजिंग एक समय लेने वाला कारक के रूप में ध्यान में रखा जाना है ।

पूरे शरीर lysate तैयारी के लिए प्रोटोकॉल यहां वर्णित intracellular उंर और सी एलिगेंस के अंय घटकों के विश्लेषण के लिए सुलभ बनाता है । LC-ms/ एलिगेंस नमूनों की एमएस माप14से पहले प्रदर्शन कर चुके हैं । पर्याप्त संवर्धन की स्थिति, तथापि, पर्याप्त संख्या में सूत्रकृमि प्राप्त करने के लिए, अभी तक विस्तार से वर्णित नहीं किया गया है ।

विधि इस प्रोटोकॉल में वर्णित readouts के लिए उपयोगी है एक बड़े पैमाने पर की आवश्यकता होती है, सी एलिगेंस की homogenously उगी आबादी, या प्रयोग प्रति एकाधिक readouts के संयोजन के लिए । इस तरह के मधुमेह और इसकी जटिलताओं के रूप में जटिल multifactorial रोगों का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से सुविधाजनक है । वैकल्पिक दृष्टिकोण, जैसे उच्च प्रवाह और उच्च सामग्री microfluidic प्रणालियों का उपयोग कर स्क्रीनिंग, तकनीकी रूप से अधिक उंनत कर रहे है और बड़े आकार के डेटा प्रदान करने में सक्षम हैं । उनके मुख्य आवेदन वर्तमान में रासायनिक और दवा स्क्रीनिंग या प्रयोगात्मक उपचार के लिए प्रतिक्रिया म्यूटेंट के लिए आनुवंशिक स्क्रीनिंग में देखा जा सकता है । इस प्रोटोकॉल में मदद करता है शोधकर्ताओं को आसानी से और सस्ते में वर्तमान प्रयोगात्मक readouts के एक समायोजन के लिए आवश्यकता के बिना अपने वर्तमान या भविष्य की परियोजनाओं के आकार को कम करने के लिए, इस प्रकार, नए की स्थापना के साथ जुड़े किसी भी समय नुकसान को ंयूनतम करने के लिए विधियों.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन IRTG १८७४ के भीतर ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) द्वारा समर्थित किया गया था "मधुमेह microvascular जटिलताओं" और सीआरसी १११८ "मधुमेह देर से जटिलताओं के लिए एक कारण के रूप में प्रतिक्रियाशील चयापचयों". C. एलिगेंस उपभेदों N2 और CL2166 CGC द्वारा प्रदान किए गए, जो अनुसंधान अवसंरचना कार्यक्रम (NIH P40) के OD010440 कार्यालय द्वारा वित्तपोषित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E. coli OP50 CGC n/a
C. elegans N2 CGC n/a
C. elegans CL2166 CGC n/a
Petri dish, 60 mm x 15 mm Greiner One 628161
Volumetric pipet, glas, 10 mL Neolab E-0413
Proteinase inhibitor cocktail tablets Roche 04693124001
Non-denaturing lysate buffer:
Tris-HCl, pH 8 Sigma T3253
Sodiumchloride (NaCl) Sigma S7653
Triton X-100 Sigma X-100
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma E5391
96-well plates, transparent bottom Brand 781611
Infinite M200, plate reader Tecan 30017581
Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm Next advance ZROB05-RNA
Bullet Blender, homogenizer Next advance BBX24
Pepsin from porcine gastric mucosa Sigma P6887
Thymol Sigma T0501
Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus Sigma P6911
Penicillin-Streptomycin solution Sigma P43339
Prolidase from Porcine Kidney Sigma P6675
Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica Sigma A8200
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Merckmillipore UFC501096
Basic Materials for plate culture are described in Reference 6.

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References

  1. Fronius, M., Clauss, W. G. Mechano-sensitivity of ENaC: may the (shear) force be with you. Pflügers Archiv. 455 (5), 775-785 (2008).
  2. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , Available from: http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html (2006).
  3. Altun, Z. F., Hall, D. H. Nervous system, general description. WormAtlas. , Available from: http://www.wormatlas.org/hermaphrodite/nervous/Neuroframeset.html (2011).
  4. Sohn, E. H., et al. Retinal neurodegeneration may precede microvascular changes characteristic of diabetic retinopathy in diabetes mellitus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (19), E2655-E2664 (2016).
  5. Chilelli, N. C., Burlina, S., Lapolla, A. AGEs, rather than hyperglycemia, are responsible for microvascular complications in diabetes: a "glycoxidation-centric" point of view. Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Diseases. 23 (10), 913-919 (2013).
  6. Schlotterer, A., et al. C. elegans as model for the study of high glucose- mediated life span reduction. Diabetes. 58 (11), 2450-2456 (2009).
  7. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
  8. Leiers, B., et al. A stress-responsive glutathione S-transferase confers resistance to oxidative stress in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology and Medicine. 34 (11), 1405-1415 (2003).
  9. Rabbani, N., Thornalley, P. J. Measurement of methylglyoxal by stable isotopic dilution analysis LC-MS/MS with corroborative prediction in physiological samples. Nature Protocols. 9 (8), 1969-1979 (2014).
  10. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 7 (72), 248-254 (1976).
  11. Ahmed, N., Argirov, O. K., Minhas, H. S., Cordeiro, C. A., Thornalley, P. J. Assay of advanced glycation endproducts (AGEs): surveying AGEs by chromatographic assay with derivatization by 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamate and application to Nepsilon-carboxymethyl-lysine- and Nepsilon-(1-carboxyethyl)lysine-modified albumin. Biochemical Journal. 364 (Pt 1), 1-14 (2002).
  12. Thornalley, P. J., et al. Quantitative screening of advanced glycation endproducts in cellular and extracellular proteins by tandem mass spectrometry. Biochemical Journal. 375 (Pt 3), 581-592 (2003).
  13. Karachalias, N., Babaei-Jadidi, R., Ahmed, N., Thornalley, P. Accumulation of fructosyllysine and advanced glycation end products in the kidney, retina and peripheral nerve of streptozotocin-induced diabetic rats. Biochemical Society Transactions. 31, 1423-1425 (2003).
  14. Morcos, M., et al. Glyoxalase-1 prevents mitochondrial protein modification and enhances lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 7 (2), 260-269 (2008).
  15. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  16. Lagido, C., McLaggan, D., Glover, L. A. A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (105), e53083 (2015).
  17. Takamiya, S., Mita, T. Large-scale purification of active liquid-cultured Caenorhabditis elegans using a modified Baermann apparatus. Parasitology International. 65 (5 Pt B), 580-583 (2016).
  18. Cornaglia, M., Lehnert, T., Gijs, M. A. M. Microfluidic systems for high-throughput and high-content screening using the nematode Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 17 (22), 3736-3759 (2017).
  19. Zhu, G., Yin, F., Wang, L., Wei, W., Jiang, L., Qin, J. Modeling type 2 diabetes-like hyperglycemia in C. elegans on a microdevice. Integrative Biology. 8 (1), 30-38 (2016).

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Kohl, K., Fleming, T., Acunman, K., Hammes, H. P., Morcos, M., Schlotterer, A. Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes. J. Vis. Exp. (138), e58117, doi:10.3791/58117 (2018).

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