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Biochemistry

Base de placa de cultivo a gran escala de elegans de Caenorhabditis: preparación de muestras para el estudio de alteraciones metabólicas en la Diabetes

Published: August 24, 2018 doi: 10.3791/58117
Automatic Translation
1, 2,3, 1, 1,4, *1, *1
15th Medical Department, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 2Department of Internal Medicine, Heidelberg University, 3German Center for Diabetes Research (DZD), 4European Center for Angioscience, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo describe un método para el cultivo a gran escala de Caenorhabditis elegans en medios sólidos. Como alternativa a la cultura líquida, este protocolo permite la obtención de parámetros de diferentes escalas basadas en la placa de cultivo. Esto incrementa la comparabilidad de los resultados, omitiendo las diferencias morfológicas y metabólicas entre la cultura de los medios líquidos y sólidos.

Abstract

Cultivo de Caenorhabditis elegans (C. elegans) de manera a gran escala en placas de agar puede ser desperdiciador de tiempo y difícil. Este protocolo describe un método sencillo y económico para obtener un gran número de animales para el aislamiento de proteínas para proceder con una mancha blanca /negra occidental, espectrometría de masas o análisis de proteómica más. Además, un aumento del número de nematodos para immunostainings y la integración de múltiples análisis en las mismas condiciones de cultivo pueden fácilmente lograrse. Además, se facilita una transferencia entre placas con diferentes condiciones experimentales. Técnicas comunes en la cultura de la placa implican a la transferencia de un solo C. elegans mediante un alambre de platino y la transferencia de agar poblada trozos con un bisturí. Sin embargo, con el aumento del número de nematodos, estas técnicas se convierten en demasiado tiempo. Este protocolo describe el cultivo a gran escala de C. elegans incluyendo numerosas medidas para minimizar el impacto de la preparación de la muestra sobre la fisiología de la lombriz. Líquido y la tensión de esquileo pueden alterar la duración de los procesos metabólicos en C. elegans, así requiriendo una descripción detallada de los pasos críticos para obtener resultados confiables y reproducibles. C. elegans es un organismo modelo, consistiendo en las células neuronales hasta la tercera, pero carece de vasos sanguíneos, proporcionando así la posibilidad de investigar únicamente neuronales alteraciones independientes de control vascular. Recientemente, neurodegeneración precoz en la retinopatía diabética fue encontrada antes de alteraciones vasculares. Así, C. elegans es de especial interés para el estudio de los mecanismos generales de las complicaciones diabéticas. Por ejemplo, una formación creciente de había avanzada glicación final (edades) y especies reactivas del oxígeno (ROS) se observaron, que se encuentran reproducible en C. elegans. Protocolos para manejar las muestras de tamaño adecuado para un espectro más amplio de investigaciones se presentan aquí, ejemplificado por el estudio de la diabetes inducida por alteraciones bioquímicas. En general, este protocolo puede ser útil para estudios que requieren gran C. elegans números y en que cultivos líquidos no es conveniente.

Introduction

Análisis de proteína, como un western blot o espectrometría de masas, requieren miligramos de proteína. Esta producción requiere de un cultivo a gran escala de cientos de C. elegans, que se pueden lograr cultivos líquidos o en medios sólidos transferencia de los nematodos por lavado. Líquido y la tensión de esquileo induce la expresión de canales de sodio epitelial (ENaC), que puede aumentar el estrés osmótico a través de una mayor absorción de sodio, potencialmente alterar la vida de C. elegans y afectar los análisis metabólicos1 . Por lo tanto, algunos pasos críticos en este protocolo para el enfoque basado en la placa toman la reducción de estrés que afectan a la variabilidad experimental en cuenta. Cultivo líquido, por otro lado, influye en el fenotipo de los nematodos y complica la cultura y la colección de un número exacto de nematodos2. Por otra parte, sustancias reactivas pueden modificarse por los componentes de los medios de comunicación y pueden distribuir irregularmente antes de llegar a los nematodos. Con respecto a las limitaciones de cultivo líquido, este protocolo proporciona un acercamiento alternativo al cultivo de las muestras a gran escala de C. elegans.

C. elegans es un organismo modelo con una red distinta de 302 células neuronales, que constituyen un tercio de sus células3. Desde su introducción en la ciencia, muchos homólogos y orthologous genes se han descrito, amplificando su valor como modelo para la investigación médica. Recientemente, se han presentado pruebas de deterioro neurológico en la retinopatía diabética, anterior a daño vascular,4. C. elegans carece de vasos sanguíneos, pero contiene una red neuronal distinta, lo que es un modelo conveniente para investigar alteraciones neuronales además de vascular. Así, C. elegans es de especial interés para el estudio de los mecanismos generales de las complicaciones diabéticas. Alteraciones bioquímicas en las complicaciones diabéticas implican la formación de las edades, que más influyen en la formación de ROS en respuesta a la hiperglucemia5. Las edades se encuentran en C. elegans y contribuyen al daño neuronal6. Enfermedades crónicas son causadas a menudo por procesos complejo, poligénicos, que requieren un enfoque multiparamétrico para la evaluación de sus mecanismos subyacentes, ejemplificado aquí con la evaluación de las complicaciones diabéticas. Este protocolo puede ser de utilidad para la obtención de múltiples parámetros simultáneamente, así como posteriormente. Se logra mayor comparabilidad y reproducibilidad de un enfoque multiparamétrico omitiendo las diferencias morfológicas y metabólicas entre la cultura de los medios líquidos y sólidos.

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Protocol

Nota: Este protocolo se divide en cinco secciones. En las secciones 1-3, se presenta el protocolo principal de cultura C. elegans en un a gran escala. Las secciones 4 y 5 proporcionan protocolos adicionales para la evaluación de metabolitos ejemplificadas en metabolitos diabéticas. En detalle, sección 1 describe una cultura general a gran escala en las placas. Sección 2 se centra en la transferencia de grandes cantidades de C. elegans, considerando que la sección 3 explica la recolección de una muestra a gran escala. Sección 4 explica el aislamiento de la proteína de la muestra y sección 5 describe la preparación de muestras para los análisis siguientes líquido cromatografía-espectrometría total en tándem (LC-MS/MS).

1. gran cultivo en placas

  1. En general, trabajar bajo una campana estéril o junto a una llama abierta para evitar contaminaciones.
  2. A cultura de gusanos hasta que alcanzan la etapa adulta joven, seguir este protocolo previamente publicados7 con las siguientes adaptaciones.
    1. Uso de bacterias vivas OP50 Escherichia coli para alimentar a los nematodos y preparar agar de fluorodeoxyuridine de 400 μm (no ampicilina/FUdR) para los experimentos.
    2. Para la preparación de una población sincrónica, utilizar OP50 no concentrado y para posteriores experimentos con los adultos, utilizar 3.3 x OP50 concentrado quitando el 70% del sobrenadante.
    3. Se recomiendan intervalos de alimentación diarias. Al evaluar el estrés oxidativo, diferentes intervalos y volúmenes de alimentación pueden interferir con los resultados.
    4. Para la inoculación, tome un plato con varios nematodos y corte en trozos de aproximadamente 0,5 x 1 cm2 con un bisturí. La transferencia de dos a tres piezas en placas de medios (NGM) nematodos crecimiento de 60 mm de diámetro, que contiene OP50 no concentrada.
    5. Incubar las placas a la temperatura adecuada para la cepa (tipo N2 debe ser cultivado a 20 ° C) hasta que los huevos son visibles en la placa.
    6. Lave la mayoría de los huevos y animales adultos con 2 mL de buffer M9 y recoger en un tubo de 15 mL. Centrifugar la suspensión a 800 x g durante 2 minutos. Mientras tanto, empezar a preparar la solución de blanqueaba.
    7. Saque el tubo centrifugado y eliminar el buffer M9 con una pipeta de 10 mL. Añadir 10 mL de la solución y la mezcla decolorante en el vortex hasta que los nemátodos adultos son lisis. Esto toma generalmente unos 5 – 7 minutos, pero no debe tardar más de 15 minutos o los huevos no se desarrollarán completamente en el experimento.
    8. Centrifugar la suspensión a 800 x g durante 2 min lavado 3 veces con buffer M9 de 10 mL para eliminar los huevos de solución del blanqueo.
    9. Ahora agregar 150 μL de la suspensión de huevos en las placas OP50. Debe alcanzarse una densidad de 200-300 huevos en cada plato. Espere hasta nematodos alcanzaron la etapa adulta.
      Nota: El buffer M9 (pH 7.0) utilizado para los experimentos representados consta de las siguientes sustancias: 22 m m KH2PO4, 42 m m de Na2HPO4y 86 mM de NaCl. Después de la esterilización en autoclave la mezcla, añadir 1 mM MgSO4. La solución de blanqueaba contiene 0.5 M NaOH, 2,3 mM NaOCl solucionado en agua destilada.
    10. Preparar estéril buffer M9, puntas de pipeta estériles con un corte punta salen los gusanos y tubos de 15 mL a recogerlas en.
    11. Aplicar aproximadamente 1 mL de buffer M9 sobre las placas, distribuir suavemente el búfer por balanceo y suavemente la pipeta los nematodos de la placa.
    12. Ahora, recoger los nematodos en el tubo. Aplicar 150 μL de la suspensión directamente en las placas (sembrado con OP50) con las puntas de pipeta corte y evaluar microscópicamente la densidad de los nematodos (recomendado: 50 – 100 nemátodos por placa de 60 mm).
    13. Si son demasiado densos, diluir la suspensión con buffer M9 y evaluarlo al microscopio hasta alcanzar la densidad deseada. Si el rendimiento es muy poco, que los gusanos establecerse o centrifugar la suspensión 10 s x 800 g para extraer el líquido.
      Nota: Se da un ejemplo de una suficiente densidad en la figura 1A (macroscópico) y 1B (microscópica) en aumento de X 20. Proceder empírico como se ha descrito.
    14. Tenga en cuenta que los gusanos se establecen rápidamente. Para asegurar una distribución equitativa entre las placas, invertir el tubo después de cada pila de placas (placas de 4 – 5).
      Nota: El corte pipeta de punta, así como el suave balanceo y lavado de las placas, reduce la tensión de esquileo.

2. la transferencia de grandes cantidades de Caenorhabditis elegans

  1. Lavar los nematodos con aproximadamente 500 μl de buffer M9, dependiendo de la edad y sequedad de las placas. Con el mismo buffer, repita extraer los nematodos hasta que la mayoría de los animales se recoge en suspensión.
  2. Poco a poco toman los nematodos con una punta de pipeta corte y transferir a un plato preparado con OP50. Deje que la placa se seque.
    Nota: Tenga cuidado de no aplicar mucho más que el volumen recomendado. Especialmente en experimentos a largo plazo, las placas no podrían tolerarlo y el agar puede romperse, permitiendo que los nematodos se arrastren en las grietas.

3. la cosecha de una gran muestra de Caenorhabditis elegans

  1. Dependiendo del método seleccionado, comienzan los experimentos con una cantidad suficiente de C. elegans. Para LC-MS/MS análisis, preparar 20 platos (60 x 15 mm) por grupo con aproximadamente 100 nemátodos por placa para asegurar un rendimiento de al menos 200 μg de proteína por muestra.
    Nota: Esta parte del Protocolo no requiere trabajar en condiciones estériles, como los nematodos serán recogidos y congelados.
  2. En el día de la recogida de muestras, preparar nitrógeno líquido para rápido-congele las muestras recolectadas. Mantener no estéril buffer M9 sobre hielo a ralentizar el metabolismo de los nematodos.
  3. Lavar el C. elegans de las placas aplicando 1 mL de buffer M9 y suavemente girando las placas. Esto evita recoger nematodos fallecidos y la mayoría de los huevos, si hay cualquier presente, porque se adhieren a las bacterias y agar.
  4. Tomar el volumen y transferirlo a un tubo de 15 mL.
  5. Después de la recolección de la muestra completa, espere a que los nematodos se asiente o centrifugar el tubo brevemente a 800 x g y eliminar la mayor parte del buffer M9. Lavar la muestra 3 x con aproximadamente 10 mL de M9 (10 veces el volumen de muestra) para eliminar cualquier bacteria.
    Nota: Para asegurarse de que se hayan retirado todos los nematodos fallecidos, flotación de sacarosa es otra opción. Sin embargo, esto no era conveniente para los experimentos muestra15. Sacarosa es hidrolizada a glucosa y fructosa. En los experimentos representados, se evaluó el papel de la glucosa para promover cambios bioquímicos encontrados la diabetes crónica. Así, la flotación de sacarosa potencialmente podría confundir los resultados.
  6. Preparar un tubo de 1,5 mL con 1 mL de buffer M9 y un tubo de vacío 1,5 mL para cada muestra. Transferir el sedimento con una pipeta de cristal del tubo de 15 mL al tubo de vacío 1.5 mL. Este paso es crucial para asegurar a una transferencia cuantitativa.
    Nota: A diferencia de durante los pasos anteriores, aquí los nematodos son más concentrados. Debido a una posible adhesión a puntas de pipeta de plástico, se espera que la pérdida de gran parte de la muestra. Por lo tanto, utilizar pipetas de vidrio.
  7. Después de la transferencia, utilice la pipeta de cristal para tomar 1 mL de buffer M9 del segundo tubo de 1,5 mL para enjuagar los nematodos de la pared de la pipeta. También, lavar los nematodos restantes del tubo de 15 mL y transferir al tubo de muestras.
  8. Centrifugar el tubo de muestra a 19.000 x g durante 1 minuto y retire tanto sobrenadante como sea posible.
  9. Cierre el tubo con Parafilm e inmediatamente rápido-congele lo en nitrógeno líquido. Guarde el tubo a-80 ° C hasta que la preparación lisada.

4. proteína aislamiento para espectrometría de masas

Nota: El aislamiento de proteínas descrito aquí puede utilizarse también para otros ensayos (por ejemplo, western blot).

  1. Añadir a la muestra congelada, los mismos volúmenes de granos de óxido de circonio de 0,5 mm y al menos 2 x el volumen de tampón lisado que contiene un cóctel de inhibidores de proteinasa.
    Nota: Los análisis de correlación de nematodos a proteína representado se realizaron utilizando 100 μl de buffer. LC-MS/MS muestras fueron sometidas a lisis con 200 μL de tampón.
  2. Empezar el homogenizador durante 1 minuto en velocidad 9. Asegurar que las muestras son completamente lisadas. Repita este paso si ellos no son completamente lisadas.
  3. Centrifugar las muestras durante 30 min a 4 ° C a 19.000 x g. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo en hielo y almacenarlo a-80 ° C hasta que otras medidas van a tomar.
    Nota: El búfer no desnaturalizantes utilizado para los experimentos representados consta de las siguientes sustancias: 20 mM Tris HCl (pH 8), 137 mM NaCl, 1% Triton-X y 2 mM de EDTA.
    Nota: Después de haber seguido los pasos de este protocolo y haber aplicado la escala sugerida, el rendimiento de una pelotilla de proteína de aproximadamente 1.000 nematodos debe ser aproximadamente de 500 μg. Para comparaciones más, consulte figura 2 y los Resultados de representante.

5. preparación para la medición de espectrometría de masas tándem cromatografía líquida

Nota: Dependiendo del parámetro de interés, la preparación de la muestra será diferente. Este protocolo se centra en metilglioxal y determinación de la edad.

  1. Medir intracelular metilglioxal por derivatización con 1, 2-diaminobenzene (DB) como se describió previamente9.
    1. Homogeneizar las muestras con 20 μl de ácido tricloroacético de helado 20% (peso/vol) en cloruro de sodio 0,9% (peso/vol) y 80 μl de agua en un tubo de 1,5 mL.
    2. Las muestras de 5 microlitros con estándar interno de la espiga (13C3-MG; 400 nM), mezclar por Vortex y les centrifugar luego a 21.000 x g durante 5 min a 4 ° C.
    3. Transferencia 35 μl del sobrenadante para el vial de muestra HPLC que contiene un inserto de vidrio de 200 μl.
    4. Añadir 5 μl de azida de sodio 3% (peso/vol) a cada muestra seguido de 10 μl de 0,5 mM DB 200 mM HCl conteniendo 0,5 mM ácido dietilentriaminopentaacético (DETAPAC) en agua.
    5. Incubar las muestras durante 4 h a temperatura ambiente, protegido de la luz.
    6. Analizar las muestras por LC-MS/MS, como se describió previamente9.
      Nota: Para la medida de las edades, aislar las proteínas como se describe en la sección 4 del protocolo.
  2. Medir la concentración de proteína de los lisados (descongelados) utilizando un ensayo de Bradford10.
    1. Preparar alícuotas de 30 μl de una curva estándar con albúmina de suero bovino (BSA) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) de la siguiente concentración: 0; 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0,6; 0,8; y 1,0 mg/dL.
      Nota: Si la muestra se preparó en el tamaño sugerido (ver paso 4.1 para la preparación de lisado con 200 μL de tampón), debe ser la concentración estimada en el rango de aproximadamente 2 a 7 mg/mL. En este caso, diluya las muestras 1:10 con PBS antes de la medición.
      Nota: Para los primeros experimentos con este método, se recomienda medir las muestras en diferentes diluciones (1, 1:10 y 1: 100). Como no hay ninguna determinación exacta del número de nematodos, el rendimiento puede variar entre investigadores individuales.
    2. Utilice una placa de 96 pocillos transparente (poliestireno) y Pipetear 10 μl de cada concentración estándar y de las muestras en las diluciones solicitadas por duplicado en los pocillos.
    3. Diluir la proteína análisis tinte reactivo concentrado 1:5 con agua destilada (aq. dest.) y añadir 200 μL de la dilución para cada muestra en la placa. Incubar la placa por 10 min a temperatura ambiente.
    4. Medir la absorbancia dentro de 30 min a 595 nm con un lector de placas. Las muestras pueden ser interpoladas de la curva estándar calculada. Más detalles del método se han descrito ampliamente en la literatura10.
  3. Medir las edades intracelulares como anteriormente descrito11,12.
    1. Lavar los extractos de proteína total (200 μg) 3 x con agua por ultracentrifugación en unidades de filtro centrífugo de 10 kDa.
    2. Añadir 10 μl de HCl de 100 mM, 10 μl de pepsina (2 mg/mL de ácido clorhídrico de 20 mM) y 10 μl de timol (2 mg/mL en 20 mM HCl) a la proteína recuperada (aproximadamente 100 μL) e incubar las muestras a 37 ° C durante 24 h.
    3. Neutralizar y tampón las muestras a pH 7.4 mediante la adición de 12.5 μl de tampón de fosfato de potasio de 0,5 M (pH 7,4) y 5 μl de 260 mM KOH.
    4. Añadir 10 μl de pronasa E [2 mg/mL en tampón de fosfato de potasio de 10 mM (pH 7,4)] y 10 μl de una solución de penicilina-estreptomicina e incubar las muestras a 37 ° C durante 24 h.
    5. Añadir 10 μl de aminopeptidasa [2 mg/mL en tampón de fosfato de potasio de 10 mM (pH 7,4)] y 10 μl del prolidase [2 mg/mL en tampón de fosfato de potasio de 10 mM (pH 7,4)] e incubar las muestras a 37 ° C durante 48 h.
    6. Analizar el hidrolizado resultante por LC-MS/MS, como se describió anteriormente12.

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Representative Results

Aquí ejemplos de creación de una gran escala C. elegans cultura para aplicaciones en la investigación de la diabetes se presentan. Puede ser de interés para relacionarse con los parámetros de un solo animal, en lugar de normalizar la concentración de proteína total. En un análisis que requiere un pequeño número de nematodos, esto puede lograrse fácilmente por conteo de los nematodos. Para un a gran escala C. elegans la cultura que implican cientos de nematodos por grupo experimental, este enfoque es inconveniente. En la figura 2, se muestra la correlación entre la cantidad de C. elegans y el contenido de proteína. Como se demuestra aquí, aislamiento de proteína cuantitativa reproducible puede lograrse utilizando este protocolo.

El Amadori aducción fructosyl-lisina es uno de varios precursores de edad formados en modelos de diabetes experimental animal13. Figura 3 muestra las mediciones de LC-MS/MS después de un tratamiento glucosa en nematodos de 12 días de edad y controles de edad comparable no tratados de tres experimentos independientes. Los nematodos se homogeneizaron con una adición de 200 μL de tampón de lisado. Una formación creciente de fructosyl-lisina después se presenta el tratamiento de alta glucosa.

Metabolitos reactivos como metilglioxal es fluctuante y modificar proteínas rápidamente14. Por lo tanto, la pregunta sigue siendo si los metabolitos reactivos realmente se acumulan en el organismo o se modifican antes de llegar a su destino. Figura 4 confirma la acumulación de metilglioxal en C. elegans después de un tratamiento con la sustancia.

El estrés oxidativo se aumenta durante la hiperglucemia6, así como durante la tensión de esquileo. Figura 5 no confirma ninguna diferencia en la formación de estrés oxidativo entre el grupo tratado con glucosa, transferido al igual que en la sección 2 del protocolo y el grupo no transferido. Comparación de ambos grupos tratados con glucosa para el grupo control no tratado muestra un aumento significativo en el estrés oxidativo inducido por la glucosa. En contraste, no se observó ninguna diferencia significativa entre los dos grupos tratados con glucosa. Estos resultados ilustran que manejo de nematodos mediante este protocolo significativamente no inducen la formación de estrés oxidativo, que podría servir como una confusión en las investigaciones de envejecimiento o el metabolismo. Por otra parte, los resultados en la literatura actual se reprodujeron mediante este protocolo.

Figure 1
Figura 1: densidad adecuada de nematodos para una posterior distribución en placas de. (A) este panel muestra una visión macroscópica. (B) este panel muestra una vista microscópica, en el aumento de X 20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Contenido de proteína del tipo salvaje C. elegans N2. Este panel muestra la correlación del número de nematodos en el rendimiento de la proteína del lisado, preparado como se describe en la sección de protocolo 5 nematodos de 12 días de edad en(n = 3 lisado de 500 nematodos; n = 3 lisado de 1.000 nematodos; y n = 1 lisado de 1.500 nematodos). La línea de regresión está marcada en rojo (r2 = 0.976, y = 0,64). La concentración de proteína total se midió utilizando el método de Bradford. Los datos se expresan como la media ± desviación estándar (SD). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Mayor formación de fructosyl-lisina después de un tratamiento de glucosa de C. elegans N2. Las concentraciones de lisina fructosyl después de un tratamiento con glucosa en nematodos de 12 días de edad y controles no tratados fueron determinadas por LC-MS/MS y normalizadas a una concentración de la proteína determinada por el método de Bradford. Los datos se expresan como la media ± SD P-valores fueron determinados por la de Student t-test, **p < 0.01. Los resultados son de tres experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Concentraciones de metilglioxal intracelular después de un tratamiento de metilglioxal de C. elegans N2. Se midieron concentraciones de metilglioxal por LC-MS/MS en nematodos de 12 días de edad tratados con metilglioxal. Las muestras se obtuvieron menos de 2 h después del último tratamiento. Los datos se expresan como media ± SD normalizada al número de nematodos. P-valores fueron determinados por la de Student t-test, **p < 0.01. Los resultados son de tres experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: El estrés oxidativo se mide en C. elegans CL2166 después de un tratamiento de glucosa. Transgénicos CL2166 (gst4::GFP)8 que contienen glutatión-S-transferasa 4-promotor-conducido GFP reportero fueron cultivadas en 400 μm FUdR las placas que contengan glucosa para d 2. Un grupo fue transferido a placas de glucosa fresco el día 1 como se describe en la sección 2 del presente Protocolo. El estrés oxidativo se midió como un incremento en fluorescencia [unidades de luz relativas (RLU)] con un lector de placas. Los datos se expresan como la media ± SD P-los valores se determinaron mediante ANOVA, *p < 0.05. Los resultados son de tres experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este protocolo presenta un enfoque fiable para el cultivo a gran escala de C. elegans para obtener resultados cuantitativos. Los hallazgos de la literatura podrían repetirse tal como se muestra en los Resultados de representante. Aunque este protocolo para la recogida de muestras a gran escala de C. elegans parece un método sencillo, hay algunos riesgos a tener en cuenta. Con respecto a la sincronización de la población de nematodos, este protocolo describe un acercamiento por blanqueamiento de la población con hipoclorito de sodio e hidróxido de sodio para destruir los nematodos y cosecha los huevos solamente. Debe tenerse en cuenta que este enfoque puede no ser adecuado para todos los experimentos. Dependiendo de la relación de tamaño de la población para el volumen de la solución de blanqueo, el efecto de dañar de la solución de blanqueo influye en el desarrollo de los embriones de15. Especialmente cuando se estudian procesos de desarrollo, esto podría ser un paso crucial. En cuanto a la manipulación de los nematodos, es crucial aplicar fuerzas de esquileo poco como sea posible a través del protocolo. Si no se manejan con cuidado, se pierda un gran número de nematodos. Por ello, es importante no exceder el tiempo de giro y la velocidad. Al transferir los nematodos, debe utilizarse una pipeta corte para reducir el número de nematodos lesionados. Para la transferencia de los nematodos, el volumen recomendado de búfer no debe excederse, ya que el agar puede quebrar cuando llega a ser demasiado húmedo, dando los nematodos la oportunidad de indagar en la placa. Mientras recogía las muestras, el buffer M9 debe estar helado para ralentizar el metabolismo de los nematodos, especialmente cuando se trabaja con metabolitos o sustratos que se degradan a C. elegans . Es importante lavar la muestra a fin de minimizar cualquier contaminación bacteriana de alimentación previa. Al transferir el precipitado, recuerde que un gran número de gusanos podría ponerte de puntas de pipeta de plástico. Debe utilizarse la pipeta de cristal recomendado, como puntas de pipeta incluso bajo vinculante podrían retener una gran cantidad de la muestra. Como alternativa, la adición de 0.01% Triton-X100 al buffer M9 fue previamente sugerido16. Para asegurar que ningún fallecido C. elegans o bacterias influirá en los resultados, flotación de sacarosa después de la colección de los nematodos puede realiza14. Esto se hace generalmente después de cultivo líquido para quitarlo del medio. En este experimento, esta limpieza fue omitida, porque metaboliza la sacarosa en glucosa y fructosa, por lo tanto potencialmente confundir nuestros resultados.

Típicamente, un cultivo a gran escala de C. elegans se realiza utilizando medios líquidos. Cultivo de líquido, sin embargo, no es adecuado para todos los valores experimentales, especialmente cuando se utilizan lecturas que requieren cifras exactas de los nematodos. Una modificación del aparato de Baerman fue descrita previamente para ordenar y purificar nematodos derivados del cultivo líquido17. Este método grandemente reduce la contaminación bacteriana y filtros de nematodos adultos sólo a través de un sistema de filtro de componentes múltiples. Este elegante método está limitada por el tiempo largo de filtrado (2-6 h) a temperatura ambiente, que podría confundir análisis metabólicos. En cuanto a la técnica de filtrado, los nematodos se clasifican por sus actividades móviles. Nematodos tienen que montar lo suficiente como para gatear independientemente a través de los poros de los filtros de diversos materiales. Así, los resultados se podrían distorsionados por exclusión de nematodos que son debilitados por los tratamientos experimentales.

Combinación de líquido y placa de culturas en un solo diseño experimental podría servir también como una confusión en los análisis posteriores. C. elegans desarrolla un fenotipo más delgado y más largo en cultivo líquido, lo que hace difícil comparar parámetros normalizados para masa, contenido de proteína, o cuerpo largo y ancho2. Por otra parte, el estudio de sustancias reactivas es un desafío en cultivo líquido, ya que sustancias reactivas probablemente serán modificadas o inactivadas por los componentes de los medios de comunicación antes de llegar a los nematodos. Aunque con este protocolo se pueden obtener muestras a gran escala de C. elegans , la placa sí mismo es más intensivas de cultivo líquido. Sin embargo, hay ciertas formas de facilitar el manejo (por ejemplo, con el uso de una máquina de dispensación de agar). Otra opción para promover el cultivo a gran escala eficiente es el uso de placas de Petri con un diámetro mayor para la producción de placas de agar. Esta opción podría ser la restricción de los análisis posteriores. Para la evaluación microscópica o placa de manejo en general, las comodidades disminuyen con el diámetro del plato.

Múltiples enfoques de alto rendimiento adecuados para la evaluación de diferentes parámetros, tales como químicos o detección de drogas, han sido desarrollado e investigado18. Dispositivos microfluídicos permiten a los investigadores para el estudio de diversos parámetros, como se muestra en un modelo de diabetes tipo 219. Vida útil, metabolismo de los lípidos y las respuestas de estrés oxidativo pueden ser simultáneamente evaluadas a nivel animal único, revelando las ventajas de la proyección de alto contenido, que integra fenotípica con información bioquímica. La evaluación de la fiabilidad y reproducibilidad de la literatura actual ya ha demostrado un gran refinamiento de estas técnicas, más allá de los estudios de prueba de concepto18. La asequibilidad, especialmente para los laboratorios más pequeños, sigue siendo problemática, como los dispositivos a menudo tienen que modificar para requisitos particulares según las necesidades experimentales, que pueden resultar costoso.

La cuantificación de las edades en C. elegans es complicada por la cutícula impermeable del nematodo. Un método comúnmente usado es la detección de las edades a través de los stainings inmunofluorescente6. Debido a la cutícula, tamaños de muestras más grandes se necesitan para disminuir la alta varianza de los resultados. La proyección de imagen tiene que ser tomado en cuenta como un factor de tiempo.

El protocolo para la preparación de lisado de todo el cuerpo descrito aquí hace edades intracelulares y otros componentes de C. elegans accesible para los análisis. Se han realizado mediciones de LC-MS/MS de las muestras de C. elegans antes14. Condiciones de cultivo adecuadas, sin embargo, para lograr un suficiente número de nematodos, han no se han descrito detalladamente, sin embargo.

El método descrito en el presente Protocolo es útil para lecturas que requieren un a gran escala, crecido homogénea población de C. elegans, o por la combinación de múltiples lecturas por experimento. Esto es particularmente conveniente para el estudio de enfermedades complejas multifactoriales como la diabetes y sus complicaciones. Enfoques alternativos, tales como proyección de alto rendimiento y alto contenido utilizando sistemas de microfluidos, tecnológicamente son más avanzados y son capaces de ofrecer datos de mayor tamaño. Su uso principal puede verse actualmente en química y drogas screening o cribado genético de mutantes en respuesta a los tratamientos experimentales. Este protocolo de ayuda a los investigadores para fácilmente y a bajo costo el tamaño de sus proyectos actuales o futuros sin la necesidad de un ajuste de las lecturas experimentales actuales y, por lo tanto minimizar cualquier pérdida de tiempo asociados con el establecimiento de nuevos métodos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este estudio fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) dentro de la CIG 1874 "Complicaciones microvasculares de la diabetes" y CRC 1118 "Metabolitos reactivos como causa de las complicaciones tardías diabéticas". Las cepas de C. elegans N2 y CL2166 fueron proporcionadas por la CGC, que está financiada por la oficina de NIH de investigación programas de infraestructura (P40 OD010440).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E. coli OP50 CGC n/a
C. elegans N2 CGC n/a
C. elegans CL2166 CGC n/a
Petri dish, 60 mm x 15 mm Greiner One 628161
Volumetric pipet, glas, 10 mL Neolab E-0413
Proteinase inhibitor cocktail tablets Roche 04693124001
Non-denaturing lysate buffer:
Tris-HCl, pH 8 Sigma T3253
Sodiumchloride (NaCl) Sigma S7653
Triton X-100 Sigma X-100
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma E5391
96-well plates, transparent bottom Brand 781611
Infinite M200, plate reader Tecan 30017581
Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm Next advance ZROB05-RNA
Bullet Blender, homogenizer Next advance BBX24
Pepsin from porcine gastric mucosa Sigma P6887
Thymol Sigma T0501
Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus Sigma P6911
Penicillin-Streptomycin solution Sigma P43339
Prolidase from Porcine Kidney Sigma P6675
Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica Sigma A8200
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Merckmillipore UFC501096
Basic Materials for plate culture are described in Reference 6.

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References

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Número 138 C. elegans bioquímica cultivo a gran escala metabolitos reactivos avanzados productos finales de glicación especies reactivas de oxígeno extracto de proteína lisado de cuerpo entero placa cultura protocolo que se lava de masas espectrometría diabético complicaciones
Base de placa de cultivo a gran escala de <em>elegans de Caenorhabditis</em>: preparación de muestras para el estudio de alteraciones metabólicas en la Diabetes
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Kohl, K., Fleming, T., Acunman, K., Hammes, H. P., Morcos, M., Schlotterer, A. Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes. J. Vis. Exp. (138), e58117, doi:10.3791/58117 (2018).

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