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Biochemistry

Piastra-base di coltivazione su larga scala di Caenorhabditis elegans: preparazione del campione per la studio di alterazioni metaboliche nel diabete

Published: August 24, 2018 doi: 10.3791/58117
Automatic Translation
1, 2,3, 1, 1,4, *1, *1
15th Medical Department, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 2Department of Internal Medicine, Heidelberg University, 3German Center for Diabetes Research (DZD), 4European Center for Angioscience, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University
* These authors contributed equally

Summary

Questo protocollo descrive un metodo per la coltivazione su larga scala di Caenorhabditis elegans su terreni solidi. Come alternativa alla coltura liquida, questo protocollo permette di ottenere parametri di diverse scale sotto la piastra-base di coltivazione. Questo aumenta la comparabilità dei risultati omettendo le differenze morfologiche e metaboliche tra cultura mediatica di liquidi e solidi.

Abstract

La coltura di Caenorhabditis elegans (c. elegans) in maniera su larga scala su piastre di agar possa essere che richiede tempo e difficile. Questo protocollo descrive un metodo semplice e poco costoso per ottenere un gran numero di animali per l'isolamento delle proteine di procedere con ulteriori analisi proteomica, spettrometria di massa o un western blot. Inoltre, un aumento dei numeri del nematode per immunostainings e l'integrazione delle analisi multiple sotto le stesse condizioni di coltura può essere raggiunto facilmente. Inoltre, un trasferimento tra piastre con differenti condizioni sperimentali è facilitato. Tecniche comuni nella cultura piastra coinvolgono il trasferimento di un singolo c. elegans utilizzando un filo di platino e il trasferimento di agar popolate pezzi usando un bisturi. Tuttavia, con l'aumento del nematode numeri, queste tecniche diventano eccessivamente lunghe. Questo protocollo descrive la coltura su grande scala di c. elegans compresi i numerosi passaggi per ridurre al minimo l'impatto della preparazione del campione sulla fisiologia del worm. Fluido e shear stress può modificare la durata di vita e processi metabolici in c. elegans, richiedendo così una descrizione dettagliata delle fasi critiche al fine di recuperare risultati affidabili e riproducibili. C. elegans è un organismo modello, costituito da cellule di un neurone per fino a un terzo, ma in mancanza di vasi sanguigni, fornendo così la possibilità di indagare esclusivamente alterazioni neuronali indipendente di controllo vascolare. Recentemente, neurodegenerazione precoce nella retinopatia diabetica è stata trovata prima di alterazioni vascolari. Così, c. elegans è di particolare interesse per lo studio di meccanismi generali delle complicazioni diabetiche. Ad esempio, una formazione aumentata di glycation prodotti finiti avanzati (età) e specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono osservata, che si trovano in modo riproducibile in c. elegans. Protocolli di gestire campioni di dimensioni adeguate per uno spettro più ampio di indagini sono presentati qui, esemplificato dallo studio delle alterazioni biochimiche indotte da diabete. In generale, questo protocollo può essere utile per gli studi che richiedono grande c. elegans numeri e nella quale coltura liquida non è adatta.

Introduction

Analisi di proteine, come una macchia occidentale o spettrometria di massa, richiedono milligrammi di proteine. Questo rendimento richiede una coltura su grande scala delle centinaia di c. elegans, che possono essere compiute in coltura liquida o in terreni solidi trasferendo i nematodi mediante lavaggio. Fluido e shear stress induce l'espressione di canali epiteliale del sodio (ENaC), che potrebbe aumentare lo stress osmotico attraverso un maggiore assorbimento di sodio, potenzialmente alterare la durata della vita di c. elegans e che interessano analisi metaboliche1 . Di conseguenza, alcuni passaggi critici nel presente protocollo per l'approccio basato su piastra prendere la riduzione dello stress che colpiscono la variabilità sperimentale in considerazione. Coltura liquida, d'altra parte, influenza il fenotipo dei nematodi e complica la cultura e la raccolta di un numero esatto di nematodi2. Inoltre, sostanze reattive possono essere modificate da componenti multimediali e possono essere distribuito in modo non uniforme prima di raggiungere i nematodi. Per quanto riguarda le limitazioni della coltura liquida, questo protocollo fornisce un approccio alternativo alla coltura campioni su larga scala di c. elegans.

C. elegans è un organismo di modello con una rete distinto di cellule neuronali 302, che costituiscono un terzo di tutte le sue cellule3. Sin dalla sua introduzione in scienza, molti omologhi e geni ortologhi sono state descritte, amplificando il suo valore come un modello per la ricerca medica. Recentemente, la prova per danno neurologico nella retinopatia diabetica, prima del danno vascolare, è stata presentata4. C. elegans è privo di vasi sanguigni, ma contiene una rete neuronale distinta, che lo rende un modello adatto per studiare alterazioni neuronali a parte quelle vascolari. Così, c. elegans è di particolare interesse per lo studio di meccanismi generali delle complicazioni diabetiche. Le alterazioni biochimiche nelle complicazioni diabetiche comportano la formazione di età, che influenzano ulteriormente la formazione di ROS in risposta all'iperglicemia5. Età si trovano in c. elegans e contribuire al danno neuronale6. Malattie croniche sono spesso causate da processi complessi, poligenici che richiedono un approccio multiparametrico per la valutazione dei loro meccanismi di fondo, come esemplificato qui con la valutazione delle complicazioni diabetiche. Questo protocollo può essere utile per ottenere più parametri simultaneamente, così come successivamente. Una maggiore comparabilità e riproducibilità di un approccio multiparametrico si ottengono omettendo le differenze morfologiche e metaboliche tra cultura mediatica di liquidi e solidi.

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Protocol

Nota: Questo protocollo è diviso in cinque sezioni. Punti 1-3, è presentato il protocollo principale alla cultura c. elegans a larga scala. Sezioni 4 e 5 forniscono ulteriori protocolli per la valutazione dei metaboliti esemplificati che accadono in metaboliti diabetiche. In dettaglio, sezione 1 descrive una cultura generale su larga scala sulle piastre. Sezione 2 si concentra sul trasferimento di grandi quantità di c. elegans, considerando che la sezione 3 spiega la raccolta di un campione su larga scala. Sezione 4 spiega l'isolamento della proteina dal campione e sezione 5 descrive la preparazione dei campioni per le analisi successive liquido cromatografia-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS).

1. su larga scala cultura sulle piastre

  1. In generale, di lavorare sotto una cappa sterile o accanto a una fiamma aperta per evitare contaminazioni.
  2. Alla cultura vermi fino a raggiungere la fase adulta giovane, seguire questo protocollo precedentemente pubblicato7 con i seguenti adattamenti.
    1. Utilizzare batteri viventi Escherichia coli OP50 per nutrire i nematodi e preparare agar di 400 µM fluorodeossiuridina (non ampicillina/FUdR) per gli esperimenti.
    2. Per la preparazione di una popolazione sincrona, utilizzare OP50 non concentrato e per successivi esperimenti con gli adulti, utilizzare 3.3 x OP50 concentrato rimuovendo il 70% del surnatante.
    3. Gli intervalli di alimentazione quotidiani sono raccomandati. Nel valutare lo sforzo ossidativo, diversi intervalli e volumi per l'alimentazione potrebbero interferire con i risultati.
    4. Per inoculazione, prendere un piatto con diversi nematodi e tagliarla a pezzi di circa 0,5 x 1 cm2 con un bisturi. Trasferire due o tre pezzi sulle piastre di supporto (NGM) crescita del nematode di 60 mm di diametro, contenenti OP50 non concentrato.
    5. Incubare le piastre alla temperatura adatta per il ceppo (selvaggio-tipo N2 devono essere messi a coltura a 20 ° C) fino a quando le uova sono visibili sulla piastra.
    6. Lavare la maggior parte delle uova e animali adulti con 2 mL di buffer di M9 e raccoglierli in una provetta da 15 mL. Centrifugare la sospensione a 800 x g per 2 min. Nel frattempo, iniziare a preparare la soluzione sbiancante.
    7. Togliere il tubo centrifugato e rimuovere il buffer M9 con una pipetta da 10 mL. Aggiungere 10 mL della soluzione sbiancante e mix su vortice fino a quando i nematodi adulti vengono lisati. Questo richiede solitamente circa 5 – 7 min, ma non dovrebbe durare più di 15 min o le uova non svilupperà completamente più avanti nell'esperimento.
    8. Centrifugare la sospensione a 800 x g per 2 min. lavare 3 volte con tampone di 10ml M9 per cancellare le uova da candeggio soluzione.
    9. Ora aggiungere 150 µ l della sospensione uovo sulle piastre OP50. Una densità di 200-300 uova dovrebbe essere raggiunto su ogni piatto. Attendere nematodi raggiunto lo stadio adulto.
      Nota: Il buffer di M9 (pH 7.0) utilizzato per gli esperimenti raffigurati consiste delle seguenti sostanze: 22mm KH2PO4, 42 mM Na2HPO4e 86 mM NaCl. Dopo la sterilizzazione in autoclave la miscela, aggiungere 1 mM MgSO4. La soluzione sbiancante contiene 0,5 M NaOH, 2,3 mM NaOCl risolto in acqua distillata.
    10. Preparare il tampone sterile M9, punte di pipetta sterile con un taglio punta per lavare via il worm e provette da 15 mL per raccoglierli in.
    11. Applicare circa 1 mL di tampone di M9 sulle piastre, distribuire delicatamente il buffer di oscillazione e delicatamente dispensare i nematodi fuori la piastra.
    12. Ora, raccogliere i nematodi nel tubo. Applicare 150 µ l di sospensione direttamente sulle piastre (seminato con OP50) con le punte di taglio pipetta e microscopicamente valutare la densità dei nematodi (consigliato: 50 – 100 nematodi per piastra di 60 mm).
    13. Se sono troppo dense, diluire la sospensione con buffer di M9 e valutarlo sotto il microscopio, fino a raggiunta la densità desiderata. Se il rendimento è troppo poco, lasciate che i vermi stabilirsi o centrifugare la sospensione 10 s a 800 x g per rimuovere il liquido.
      Nota: Un esempio di una sufficiente densità è dato in Figura 1A (macroscopiche) e 1B (microscopica) alle 20 l'incremento di X. Procedere empiricamente come descritto.
    14. Tenete a mente che i vermi si stabilirsi rapidamente. Per garantire un'equa distribuzione tra le piastre, capovolgere la provetta dopo ogni pila di piatti (4 – 5 piatti).
      Nota: Il taglio Pipettare punta, come pure l'oscillazione delicata e lavaggio delle piastre, riduce la sollecitazione di taglio.

2. trasferimento di grandi quantità di Caenorhabditis elegans

  1. Lavare i nematodi con circa 500 µ l di tampone di M9, a seconda dell'età e la secchezza delle piastre. Utilizzando lo stesso buffer, Ripeti staccando i nematodi, fino a quando la maggior parte degli animali sono raccolti in sospensione.
  2. Lentamente prendono i nematodi con un puntale taglio e trasferirli su un piatto preparato con OP50. Asciugare la piastra.
    Nota: Fare attenzione a non applicare più di volume consigliato. Soprattutto in esperimenti a lungo termine, le piastre non potrebbero tollerare e l'agar può rompersi, permettendo i nematodi la ricerca per indicizzazione nelle fessure.

3. raccolta di un grande campione di Caenorhabditis elegans

  1. A seconda del metodo selezionato, è possibile iniziare gli esperimenti con una quantità sufficiente di c. elegans. Per le analisi LC-MS/MS, preparare 20 piastre (60 x 15 mm) per ogni gruppo con circa 100 nematodi per piastra per garantire un rendimento di almeno 200 µ g di proteine per esempio.
    Nota: Questa parte del protocollo non richiede lavorando in condizioni sterili in piu ', come i nematodi saranno raccolti e congelati.
  2. Il giorno della raccolta del campione, preparare azoto liquido per snap-congelare i campioni raccolti. Tenere non sterili M9 buffer sul ghiaccio per rallentare il metabolismo del nematode.
  3. Lavare via il c. elegans dalle piastre applicando 1 mL di tampone di M9 e raggiunga le piastre. Questo evita di raccolta defunti nematodi e la maggior parte delle uova, se non ci sono affatto presente, perché si attaccano per i batteri e agar.
  4. Prendere il volume e trasferirlo in una provetta da 15 mL.
  5. Dopo la raccolta del campione completo, attendere i nematodi a stabilirsi o centrifugare la provetta brevemente a 800 x g e rimuovere la maggior parte del buffer M9. Lavare il campione 3 x con circa 10 mL di M9 (10 volte il volume del campione) per rimuovere i batteri.
    Nota: Per garantire che vengano rimossi tutti i nematodi defunti, galleggiamento saccarosio è un'altra opzione. Tuttavia, questo non era adatto per gli esperimenti visualizzati15. Saccarosio è idrolizzato a glucosio e fruttosio. Negli esperimenti raffigurati, il ruolo di glucosio è stato valutato per promuovere cambiamenti biochimici trovati in diabete cronico. Così, galleggiamento saccarosio potenzialmente poteva confondere i risultati.
  6. Preparare una provetta da 1,5 mL con 1 mL di tampone di M9 e una provetta di vuoto 1,5 mL per ogni campione. Trasferire il pellet con una pipetta di vetro dal tubo da 15 mL al tubo vuoto 1,5 mL. Questo passaggio è fondamentale per garantire un trasferimento di quantitativo.
    Nota: A differenza durante i passaggi precedenti, qui i nematodi sono più concentrati. A causa di un'eventuale adesione alle punte di pipetta di plastica, è prevista la perdita di gran parte del campione. Pertanto, utilizzare pipette in vetro.
  7. Dopo il trasferimento, è possibile utilizzare la pipetta di vetro per prendere 1 mL di tampone di M9 dal secondo tubo di 1,5 mL per risciacquare i nematodi dalla parete pipetta. Inoltre, lavare i nematodi rimanenti dal tubo da 15 mL e trasferirli nella provetta.
  8. Centrifugare la provetta a 19.000 x g per 1 min e quindi rimuovere tanto surnatante come possibile.
  9. Sigillare il tubo con Parafilm e immediatamente snap-freeze e in azoto liquido. Conservare la provetta a-80 ° C fino a quando la preparazione del lysate.

4. proteine isolamento per spettrometria di massa

Nota: L'isolamento di proteine qui descritto può essere utilizzato anche per altri dosaggi (ad es., macchia occidentale).

  1. Per il campione congelato, aggiungere gli stessi volumi di grani di ossido di zirconio di 0,5 mm e almeno 2 x il volume di lisato tampone contenente un cocktail di inibitore della proteinasi.
    Nota: L'analisi di correlazione di nematodi / proteine raffigurati sono stati eseguiti utilizzando 100 µ l di tampone. Campioni di LC-MS/MS sono stati lisati con 200 µ l di tampone.
  2. Avviare l'omogeneizzatore per 1 min velocità 9. Garantire che i campioni vengono lisati completamente. Ripetere questo passaggio se essi non sono completamente lisati.
  3. Centrifugare i campioni per 30 min a 4 ° C a 19.000 x g. Trasferire il surnatante in una provetta di nuova sul ghiaccio e conservare a-80 ° C fino a quando ulteriori misure stanno per essere prese.
    Nota: Il buffer non-denaturante utilizzato per gli esperimenti raffigurati si compone delle seguenti sostanze: 20 mM Tris-HCl (pH 8), 137 mM NaCl, 1% Triton-X e 2 mM EDTA.
    Nota: Dopo aver seguito la procedura del presente protocollo e dopo aver applicato la scala suggerita, il rendimento di un pellet di proteina da circa 1.000 nematodi dovrebbe essere circa 500 µ g. Per ulteriori confronti, consultare Figura 2 e i Risultati di rappresentante.

5. preparazione del campione per la misura di liquido cromatografia-spettrometria di massa

Nota: A seconda del parametro di interesse, la preparazione del campione sarà diverso. Questo protocollo si concentra sulla determinazione dell'età e methylglyoxal.

  1. Misurare methylglyoxal intracellulare di derivatizzazione con 1,2-diaminobenzene (DB) come descritto in precedenza9.
    1. Omogeneizzare i campioni con 20 µ l di acido tricloroacetico di gelida 20% (wt/vol) in cloruro di sodio 0,9% (wt/vol) e 80 µ l di acqua in una provetta da 1,5 mL.
    2. I campioni di 5 µ l con lo standard interno di Spike (13C3-MG; 400 nM), mescolare nel vortex e centrifugare poi li a 21.000 x g per 5 min a 4 ° C.
    3. Trasferire 35 µ l del surnatante la fiala del campione HPLC contenente un inserto di vetro 200 µ l.
    4. Aggiungere 5 µ l di sodio azide 3% (wt/vol) per ogni campione seguita da 10 µ l di mM 0,5 DB a 200 mM HCl contenente 0,5 mM diethylenetriaminepentaacetic acido (DETAPAC) in acqua.
    5. Incubare i campioni per 4 h a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
    6. Analizzare i campioni mediante LC-MS/MS, come descritto in precedenza9.
      Nota: Per la misurazione di età, isolare le proteine come descritto nella sezione 4 del protocollo.
  2. Misurare la concentrazione di proteina dei lisati (scongelati) utilizzando un saggio di Bradford10.
    1. Preparare aliquote di 30 µ l per una curva standard addizionata con albumina di siero bovino (BSA) risolto in tampone fosfato salino (PBS) delle seguenti concentrazioni: 0; 0,1; 0.2; 0.3; 0.4; 0,6; 0,8; e 1,0 mg/dL.
      Nota: Se il campione è stato preparato presso la dimensione suggerita (Vedi punto 4.1 per la preparazione di lisato con 200 µ l di tampone), la concentrazione stimata dovrebbe essere nel range di 2 – 7 mg/mL circa. In questo caso, diluire i campioni 01:10 con PBS prima della misurazione.
      Nota: Per i primi esperimenti utilizzando questo metodo, si consiglia di misurare i campioni in varie diluizioni (1, 01:10 e 1: 100). Come non c'è nessuna determinazione esatta del numero di nematodi, il rendimento può variare tra singoli ricercatori.
    2. Utilizzare una piastra a 96 pozzetti (polistirolo) trasparente e Pipettare 10 µ l di ogni concentrazione standard e dei campioni nelle diluizioni selezionate in duplicato nei pozzetti.
    3. Diluire la proteina dosaggio tintura reagente concentrato 1:5 con acqua distillata (aq. dest.) e aggiungere 200 µ l della diluizione per ogni campione sul piatto. Incubare la piastra per 10 min a temperatura ambiente.
    4. Misurare l'assorbanza entro 30 min a 595 nm con un lettore di piastra. I campioni possono essere interpolati dalla curva standard calcolata. Più dettagli del metodo sono stati descritti estesamente nella letteratura10.
  3. Misurare le età intracellulari come descritto in precedenza11,12.
    1. Gli estratti di proteine totali (circa 200 µ g) di lavare 3 volte con acqua di ultracentrifugazione in 10 unità di filtraggio centrifugo di kDa.
    2. Aggiungere 10 µ l di HCl 100 mM, 10 µ l di pepsina (2 mg/mL in HCl 20 mM) e 10 µ l di timolo (2 mg/mL in HCl 20 mM) alla proteina recuperata (circa 100 µ l) e incubare i campioni a 37 ° C per 24 h.
    3. I campioni del buffer a pH 7.4 con l'aggiunta di 12,5 µ l di tampone di fosfato di potassio 0,5 M (pH 7.4) e neutralizzare e 5 µ l di 260mm KOH.
    4. Aggiungere 10 µ l di Pronase E [2 mg/mL in tampone fosfato di potassio 10 mM (pH 7.4)] e 10 µ l di una soluzione di penicillina-streptomicina e incubare i campioni a 37 ° C per 24 h.
    5. Aggiungere 10 µ l di aminopeptidasi [2 mg/mL in tampone fosfato di potassio 10 mM (pH 7.4)] e 10 µ l di prolidasi [2 mg/mL in tampone fosfato di potassio 10 mM (pH 7.4)] e incubare i campioni a 37 ° C per 48 h.
    6. Analizzare l'idrolizzato risultante mediante LC-MS/MS, come descritto in precedenza12.

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Representative Results

Qui esempi di creazione di una larga scala di c. elegans della coltura per applicazioni nella ricerca del diabete sono presentate. Può essere di interesse per correlare i parametri di un singolo animale, piuttosto che per normalizzare e alla concentrazione di proteine totali. In un'analisi che richiedono un piccolo numero di nematodi, questo può essere facilmente realizzata contando i nematodi. Per una larga scala di c. elegans cultura coinvolgendo centinaia di nematodi per ogni gruppo sperimentale, questo approccio è scomodo. Nella Figura 2, la correlazione tra la quantità di c. elegans e il contenuto proteico è mostrata. Come dimostrato qui, isolamento riproducibile e quantitativa della proteina può essere ottenuto utilizzando questo protocollo.

La Amadori addotto fruttosile-lisina è uno dei precursori di età diversi formati durante diabete sperimentale animale modelli13. Figura 3 Visualizza misurazioni di LC-MS/MS dopo un trattamento di glucosio in 12-giorno-vecchio nematodi e comandi non trattati di pari età da tre esperimenti indipendenti. I nematodi sono stati omogeneizzati con un'aggiunta di 200 µ l di tampone lisato. Una formazione aumentata di fruttosile-lisina dopo il trattamento di alto-glucosio è presentato.

Metaboliti reattivi come methylglyoxal sono fluctuant e modificare rapidamente proteine14. Pertanto, resta da chiedersi se tali metaboliti reattivi in realtà si accumulano nell'organismo o vengono modificati prima di raggiungere la loro destinazione. Figura 4 conferma l'accumulo di methylglyoxal in c. elegans dopo un trattamento con la sostanza.

Lo sforzo ossidativo è aumentato durante l'iperglicemia6, così come durante la sollecitazione di taglio. Figura 5 non conferma alcuna differenza nella formazione dello sforzo ossidativo tra il gruppo glucosio-trattato, trasferito come nella sezione 2 del protocollo e il gruppo non trasferiti. Confronto di entrambi i gruppi trattati glucosio al gruppo di controllo non trattato Mostra un significativo aumento dello stress ossidativo indotto da glucosio. Al contrario, è stata osservata alcuna differenza significativa tra i due gruppi di glucosio-trattato. Questi risultati illustrano che gestisce nematodi usando questo protocollo non induce significativamente la formazione di stress ossidativo, che potrebbe servire come un confounder nelle indagini di invecchiamento o il metabolismo. Inoltre, i risultati nella letteratura corrente sono stati riprodotti utilizzando questo protocollo.

Figure 1
Figura 1: un'adeguata densità di nematodi per un ulteriore distribuzione sulle piastre. (A), questo pannello mostra una vista macroscopico. (B), questo pannello mostra una vista microscopica, alle 20 l'incremento di X. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Contenuto proteico di selvaggio-tipo di c. elegans N2. Questo pannello mostra la correlazione del numero di nematodi al rendimento della proteina del lisato, preparato come descritto nella sezione protocollo 5 in 12-giorno-vecchio nematodi(n = 3 lisato di 500 nematodi; n = 3 lisato di 1.000 nematodi; e n = 1 lisato di 1.500 nematodi). La retta di regressione è segnata in rosso (r2 = 0,976, y = 0,64). La concentrazione nella proteina totale è stata misurata utilizzando il metodo di Bradford. I dati sono espressi come la media ± deviazione standard (SD). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Aumentata formazione di fruttosile-lisina dopo un trattamento di glucosio di c. elegans N2. Le concentrazioni di fruttosile-lisina dopo un trattamento con glucosio nel 12-giorno-vecchio nematodi e comandi non trattati sono state determinate mediante LC-MS/MS e normalizzate ad una concentrazione di proteina determinata secondo il metodo di Bradford. I dati sono espressi come la media ± SD Il p-valori sono stati determinati mediante di Student t-test, * *p < 0.01. I risultati sono da tre esperimenti indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Le concentrazioni di methylglyoxal intracellulare dopo un trattamento di methylglyoxal di c. elegans N2. Concentrazioni di methylglyoxal sono state misurate mediante LC-MS/MS in nematodi 12-giorno-vecchio trattati con methylglyoxal. I campioni sono stati raccolti meno di 2 ore dopo l'ultimo trattamento. I dati sono espressi come media ± deviazione standard normalizzata al numero di nematodi. Il p-valori sono stati determinati mediante di Student t-test, * *p < 0.01. I risultati sono da tre esperimenti indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Stress ossidativo misurato in c. elegans CL2166 dopo un trattamento di glucosio. Transgenici CL2166 (gst4::GFP)8 contenente un reporter GFP 4-promotore-guidato di glutatione-S-transferasi sono state coltivate su 400 piastre di FUdR µM contenenti glucosio per 2 d. Un gruppo è stato trasferito alle piastre di glucosio fresco il giorno 1 come descritto nella sezione 2 del presente protocollo. Lo sforzo ossidativo è stato misurato come un aumento nella fluorescenza [unità di luce relativa (RLU)] con un lettore di piastra. I dati sono espressi come la media ± SD Il p-valori sono stati determinati mediante ANOVA, *p < 0.05. I risultati sono da tre esperimenti indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Questo protocollo presenta un metodo affidabile per la coltura su grande scala di c. elegans per ottenere risultati quantitativi. I risultati dalla letteratura possono essere replicati come mostrato nei Risultati di rappresentante. Anche se questo protocollo per la raccolta di campioni su larga scala di c. elegans sembra un metodo semplice, ci sono certe insidie di prendere in considerazione. Per quanto riguarda la sincronizzazione della popolazione del nematode, questo protocollo descrive un approccio candeggiando la popolazione con ipoclorito di sodio e idrossido di sodio per distruggere i nematodi e raccogliere le uova unicamente. Deve tener conto che questo approccio potrebbe non essere adatto per tutti gli esperimenti. In base al rapporto della grandezza della popolazione per il volume della soluzione sbianca, l'effetto che nuoc della soluzione sbianca influenza lo sviluppo di embrioni15. Soprattutto quando lo studio di processi di sviluppo, questo potrebbe essere un passo cruciale. Per quanto riguarda il trattamento dei nematodi, è fondamentale applicare come le forze di taglio piccolo come possibile in tutto il protocollo. Se non maneggiati con cura, un gran numero di nematodi perirà. Per quella materia, è importante non superare il tempo di filatura e velocità. Quando si trasferiscono i nematodi, deve essere utilizzato un puntale di taglio per ridurre il numero dei feriti nematodi. Per il trasferimento dei nematodi, volume consigliato del buffer non deve essere superato, come l'agar potrebbe rompere quando diventa troppo umido, dando i nematodi la possibilità di scavare nella piastra. Mentre la raccolta dei campioni, il buffer di M9 dovrà essere tenuto ghiacciato a rallentare il metabolismo dei nematodi, soprattutto quando si lavora con metaboliti o substrati di c. elegans si rovineranno. È importante lavare il campione accuratamente per ridurre al minimo qualsiasi contaminazione batterica da alimentazione preventiva. Durante il trasferimento il pellet, ricordate che un gran numero di vermi potrebbe attaccare per puntali in plastica. La pipetta di vetro consigliato deve essere utilizzata, come i puntali per pipette anche basso-associazione ha potuto mantenere una grande quantità del campione. In alternativa, l'aggiunta di 0,01% Triton-X100 nel buffer di M9 è stato precedentemente suggerito16. Per garantire che nessun defunto c. elegans o batteri influenzerà i risultati, galleggiamento saccarosio dopo la raccolta dei nematodi possa essere eseguiti14. Ciò è fatta solitamente dopo la coltura liquido per rimuovere il mezzo. In questo esperimento, questa purificazione è stata omessa, perché il saccarosio è metabolizzato in glucosio e fruttosio, così potenzialmente di confusione i nostri risultati.

In genere, una cultura su larga scala di c. elegans è eseguita utilizzando mezzi liquidi. Liquido di coltura, tuttavia, non è adatta a tutte le impostazioni sperimentali, soprattutto quando si utilizzano valori di lettura che richiedono numeri esatti dei nematodi. Una modifica dell'apparato Torch_2 è stata precedentemente descritta per ordinare e purificare i nematodi derivati da coltura liquida17. Questo metodo notevolmente riduce la contaminazione batterica e filtra solo adulti nematodi attraverso un sistema di filtro di componenti multipli. Questo metodo elegante è limitato dal tempo di filtraggio a lungo (2-6 ore) a temperatura ambiente, che potrebbero confondere analisi metaboliche. Per quanto riguarda la tecnica di filtraggio, i nematodi sono ordinati per loro attività di movimento. Nematodi devono essere abbastanza in forma per strisciare in modo indipendente attraverso i pori dei filtri da materiali diversi. Così, potrebbero risultare distorta risultati escludendo i nematodi sono indeboliti dai trattamenti sperimentali.

Che unisce culture liquido e piastra in un unico disegno sperimentale potrebbe anche servire come un confounder nelle analisi successive. C. elegans si sviluppa un fenotipo più sottile e più lungo in coltura liquida, rendendo difficile confrontare i parametri normalizzati a massa, contenuto proteico, o corpo di lunghezza e larghezza2. Inoltre, lo studio di sostanze reattive è impegnativo in coltura liquida, poiché sostanze reattive saranno probabilmente essere modificate o inattivate da componenti media prima di raggiungere i nematodi. Anche se campioni su larga scala di c. elegans possono essere ottenuti con questo protocollo, cultura piastra stessa è più laborioso rispetto a coltura liquida. Tuttavia, ci sono alcuni modi per facilitare la movimentazione (ad es., con l'uso di una macchina agar-erogazione). Un'altra opzione per promuovere la cultura su larga scala in modo efficiente è l'uso delle capsule di Petri con un diametro maggiore per la produzione di piastre di agar. Questa opzione potrebbe essere vincolo dalle analisi successive. Per la valutazione microscopica o piastra di movimentazione in genere, i servizi diminuiscono con il diametro del piatto.

Approcci diversi di alto-rendimento adatti per la valutazione di diversi parametri, quali chimica o screening di stupefacenti, sono stati sviluppati e studiati18. Dispositivi microfluidici permettono ai ricercatori di studiare i vari parametri, come illustrato in un modello di diabete di tipo 219. Durata della vita, metabolismo dei lipidi e risposte allo stress ossidativo possono essere contemporaneamente valutate a livello di singolo-animale, rivelando i vantaggi dello screening ad alto contenuto, che integra fenotipica con informazioni biochimiche. La valutazione dell'affidabilità e riproducibilità della letteratura corrente ha già dimostrato una grande raffinatezza di queste tecniche, andando di là di proof-of-concept studi18. L'accessibilità, soprattutto per i più piccoli laboratori, resta ancora problematico, come i dispositivi spesso devono essere personalizzata in base alle esigenze sperimentali, che possono rivelarsi costoso.

La quantificazione di età c. elegans è complicata dalla cuticola impermeabile del nematode. Un metodo comunemente usato è il rilevamento di età via immunofluorescente stainings6. A causa della cuticola, taglie più grandi campioni sono necessari per diminuire l'alta varianza dei risultati. Formazione immagine deve essere presa in considerazione come un fattore che richiede tempo.

Il protocollo per la preparazione del lysate corpo intero descritto qui rende accessibili per analisi età intracellulari e altri componenti di c. elegans . Misure di LC-MS/MS di campioni di c. elegans sono state realizzate prima del14. Adeguate condizioni di coltura, tuttavia, per ottenere un numero sufficiente di nematodi, non sono stati descritti in dettaglio, ancora.

Il metodo descritto in questo protocollo è utile per letture che richiedono una grande scala, omogeneamente cresciuta popolazione di c. elegans, o per la combinazione di più letture per esperimento. Ciò è particolarmente utile per lo studio di patologie complesse multifattoriali come il diabete e le sue complicazioni. Approcci alternativi, quali lo screening ad alta velocità e ad alto contenuto utilizzando sistemi microfluidici, sono tecnologicamente più avanzati e sono in grado di fornire dati di dimensioni maggiori. Loro applicazione principale attualmente può essere visto in chimica e lo screening di stupefacenti o screening genetici per mutanti risponde ai trattamenti sperimentali. Questo protocollo consente ai ricercatori di modo facile ed economico di alto livello la dimensione dei loro progetti attuali o futuri, senza la necessità di un adeguamento dell'attuale letture sperimentali e, quindi, per ridurre al minimo eventuali perdite di tempo connesso con l'istituzione del nuovo metodi.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo studio è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) entro il 1874 IRTG "Complicazioni microvascolari diabetiche" e CRC 1118 "Metaboliti reattivi come causa per le complicazioni diabetiche tarda". Ceppi di c. elegans N2 e CL2166 sono stati forniti da CGC, che è finanziato dall'ufficio NIH di programmi di ricerca dell'infrastruttura (P40 OD010440).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E. coli OP50 CGC n/a
C. elegans N2 CGC n/a
C. elegans CL2166 CGC n/a
Petri dish, 60 mm x 15 mm Greiner One 628161
Volumetric pipet, glas, 10 mL Neolab E-0413
Proteinase inhibitor cocktail tablets Roche 04693124001
Non-denaturing lysate buffer:
Tris-HCl, pH 8 Sigma T3253
Sodiumchloride (NaCl) Sigma S7653
Triton X-100 Sigma X-100
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma E5391
96-well plates, transparent bottom Brand 781611
Infinite M200, plate reader Tecan 30017581
Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm Next advance ZROB05-RNA
Bullet Blender, homogenizer Next advance BBX24
Pepsin from porcine gastric mucosa Sigma P6887
Thymol Sigma T0501
Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus Sigma P6911
Penicillin-Streptomycin solution Sigma P43339
Prolidase from Porcine Kidney Sigma P6675
Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica Sigma A8200
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Merckmillipore UFC501096
Basic Materials for plate culture are described in Reference 6.

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References

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Piastra-base di coltivazione su larga scala di <em>Caenorhabditis elegans</em>: preparazione del campione per la studio di alterazioni metaboliche nel diabete
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Kohl, K., Fleming, T., Acunman, K., Hammes, H. P., Morcos, M., Schlotterer, A. Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes. J. Vis. Exp. (138), e58117, doi:10.3791/58117 (2018).

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