Les auteurs décrivent un protocole étape par étape pour la chromatine tandem immunoprécipitation séquençage (tChIP-Seq) qui permet l’analyse de la modification d’histone génome cellule-spécifiques au type.
Régulation épigénétique joue un rôle central dans l’expression des gènes. Étant donné que la modification d’histone a été découvert dans les années 1960, ses fonctions physiologiques et pathologiques ont été largement étudiées. En effet, l’avènement de la nouvelle génération séquençage en profondeur et immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) par l’intermédiaire des anticorps spécifiques d’histone modification a révolutionné notre vision de la régulation épigénétique au sein du génome. À l’inverse, les tissus sont généralement composent de types cellulaires différents, et leur mélange complexe pose des défis analytiques pour enquêter sur l’épigénome dans un type particulier de cellules. Afin d’examiner l’état de la chromatine spécifiques à un type de cellule dans une manière de tout le génome, nous avons développé récemment en tandem la chromatine immunoprécipitation le séquençage (tChIP-Seq), qui repose sur l’épuration sélective de la chromatine par des protéines histones tagged noyau de cellule types d’intérêt, suivie par ChIP-seq. L’objectif de ce protocole est l’introduction de meilleures pratiques de tChIP-suiv. Cette technique fournit un outil polyvalent pour enquête épigénome tissu-spécifique dans les modifications d’histone diverse et organismes modèles.
Les tissus des animaux se composent de types cellulaires différents. La régulation des gènes dans chaque cellule définit le type de cellule. Modifications de la chromatine – modification histone et de méthylation de l’ADN – sous-tendent la spécificité cellulaire de type de l’expression génique. Ainsi, la mesure de régulation épigénétique dans chaque type de cellule a été désirée, mais il a été un défi technique.
Pour étudier l’épigénétique dans un type particulier de cellules, le séquençage de l’immunoprécipitation de la chromatine en tandem (tChIP-Seq) a été récemment mis au point ()Figure 1)1. TChIP, protéine de noyau épitope-tag histone H2B est exprimée d’un instigateur de cellule-spécifiques au type. Cette fonctionnalité permet l’isolement des chromatines des cellules d’intérêt, même si le matériel commence à partir d’un mélange de différents types de cellules. Suivant ChIP-Seq — purification de la chromatine via une marque modifiée-histone et séquençage en profondeur de prochaine génération isolé ADN — nous pouvons surveiller l’état épigénétique du type cellulaire ciblée de manière génome-large.
En utilisant cette technique, nous avons étudié récemment triméthylation neurone-spécifique de l’histone H3 protéine sur la lysine 4 (H3K4me3) marques. Dans cette étude, nous avons développé une souris knock-in dans lequel terminalement H2B indicateur-étiquetées protéine a été exprimée lors de la recombinaison Cre-mediated (Rosa26CAG floxed-pA H2B-drapeau). Par croisement avec une souris possédant le gène de Cre-réticulum endoplasmique (re) sous le contrôle du promoteur CamK2a, la lignée de souris obtenue induit H2B-drapeau en neurones actifs sur le tamoxifène injection (Camk2aH2B-drapeau)1. A partir de cerveau de la lignée de souris établie, nous avons effectué tChIP-Seq avec anticorps anti-H3K4me3. Étant donné que les marques de H3K4me3 correspondent souvent aux régions promotrices, nous pourrions découvrent des centaines de mRNA spécifiquement exprimé dans les neurones1.
Nous décrivons ici une méthode typique tChIP-Seq qui couvre les étapes de la dissection des tissus pour la construction de la bibliothèque ()Figure 1). L’objectif final de ce protocole est de partager nos meilleures pratiques pour l’exécution de tChIP-Seq et l’application future de cette méthode à d’autres types de cellules et des modifications d’histone.
Notre protocole a été optimisé pour les neurones du cerveau de souris, dans lequel l’expression de l’indicateur-étiquetées H2B est induite par injection de tamoxifène. Promoteurs, utilisés pour l’expression H2B, matériaux de tissu de départ et la quantité des tissus sont des paramètres pivotales pour succès tChIP-suiv. Ainsi, l’optimisation de ces facteurs devrait considérer pour chaque type de cellules d’intérêt.
Une étape essentielle entre les procédures utilisées…
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions tous les membres du laboratoire Iwasaki pour une lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu en partie par une subvention pour la recherche scientifique sur les domaines innovants (#26113005 S.N. et JP17H05679 à s.c.) ; une subvention pour les jeunes scientifiques (A) (JP17H04998 à S.C.) depuis le ministère de l’éducation, sciences, Sports et Culture du Japon (MEXT) ; et la pionnière des projets « Évolution cellulaire » et tous les projet de RIKEN « Maladie et épigénome » de RIKEN (à S.N. et S.C.).
Protein LoBind tube, 2 mL | Eppendorf | No. 0030108132 | For cell lysis |
Protein LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | No. 0030108116 | For ChIP and library preparation |
DNA LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | No. 0030108051 | For ChIP and library preparation |
8-strip PCR tube | BIO-BIK | 3247-00 | For ChIP and library preparation |
SK Mill | TOKKEN | SK-200 | Handy cryogenic grinder to make cell powder for fixation |
Metal bullet | TOKKEN | SK-100-DLC10 | Accessory of SK Mill |
2 mL stainless steel tube | TOKKEN | TK-AM5-SUS | An option for cell lysis |
2 mL stainless steel tube holder | TOKKEN | SK-100-TL | An option for cell lysis |
16% formaldehyde (w/v), methanol-free | Pierce | 28906 | To fix cells. Prepare 1% solution before use. |
Glycine | Nacalai Tesque | 17109-35 | Prepare 2.5 M stock |
D-PBS (-)(1x) | Nacalai Tesque | 14249-24 | For washing lysate and purified DNA |
HEPES | Nacalai Tesque | 02443-05 | For Lysis buffer 1. Prepare 1 M, pH 7.5 stock. |
5 M NaCl, molecular biology grade | Nacalai Tesque | 06900-14 | For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer |
0.5 M EDTA, molecular biology grade | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 311-90075 | For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer |
Glycerol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 072-04945 | For lysis buffer 1 |
NP-40 | Nacalai Tesque | 25223-75 | For lysis buffer 1 |
Triton X-100, molecular biology grade | Nacalai Tesque | 12967-32 | For Lysis buffer 1 |
Tris | Nacalai Tesque | 35406-91 | For Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer. Prepare 1 M, pH 8.0 stock. |
0.1 M EGTA pH neutral | Nacalai Tesque | 08947-35 | For Lysis Buffer 2 |
Protease inhibitor cocktail (100x) | Nacalai Tesque | 25955-24 | To block degradation of protein |
RIPA buffer | Thermo Fisher Scientific | 89900 | For cell lysis and washing |
milliTUBE 1 mL AFA Fiber | Covaris | 520130 | Sonicator tube. Accessory of Focused-ultrasonicator |
Focused-ultrasonicator | Covaris | S220 or E220 | To digest DNA into adequate size for ChIP-Seq |
UltraPure 10% SDS | Thermo Fisher Scientific | 15553-027 | For ChIP Elution Buffer |
RNase A | Nacalai Tesque | 30141-14 | To purify DNA from lysate |
Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115887001 | To purify DNA from lysate |
Ethanol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 054-07225 | Make 70% solution |
Monoclonal anti-FLAG M2 antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | F1804 | To purify chromatin expressed in cells of interest |
Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | 11201D | This can be used for anti-FLAG IP and anti-H3K4me3 IP |
Anti-tri-methyl histone H3 (K4), mouse monoclonal antibody | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 301-34811 | Any other antibody that works for ChIP analysis will work |
10x Blocking Reagent | Sigma-Aldrich | 11096176001 | For blocking during affinity purification |
Denhardt’s solution | Nacalai Tesque | 10727-74 | For blocking during affinity purification |
Glycogen (5 mg/ml) | Thermo Fisher Scientific | AM9510 | To purify DNA from lysate |
Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | For quantification of isolated DNA |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | For quantification of isolated DNA |
0.5 mL tube | Axygen | 10011-830 | For quantification by Qubit |
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Nacalai Tesque | 25970-56 | To purify DNA from lysate |
AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | SPRI magnetic beads for library preparation |
Metal ice rack | Funakoshi | IR-1 | To keep the cell lysate frozen |
Sample Cooler | New England Biolabs | T7771S | Helps fix cells with minimal damage |
2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | To check the quality of isolated DNA fragments. Another fragment analyzer can be used. |
Bioanalyzer 2100 Expert Software | Agilent Technologies | G2946CA | Supplied with the Bioanalyzer |
High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | To check the quality of the isolated DNA fragments |
KAPA LTP Library Preparation Kit | Roche | 07961898001 | Supplied with 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase, and PEG/NaCl solution |
NEXTflex DNA Barcodes | BIOO Scientific | NOVA-514101 | Adapter for library preparation. Supplied with DNA Barcode Adapters and Primer Mix. |
KAPA Real-Time Library Amplification Kit | Roche | 07959028001 | Supplied with 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix, and Fluorescent Standards |
2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Roche | KM2602 | For library preparation. Additionally, this enzyme may be required for the KAPA Real-Time Library Amplification Kit |
Buffer EB | Qiagen | 19086 | 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 for elution of DNA |
386-well qPCR plate | Thermo Fisher Scientific | 4309849 | For real-time PCR |
QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4485701 | To quantify DNA |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | For real-time PCR |
MicroAmp Clear Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | For plate sealing |
End-repair master mix | Combine 1.4 µL of 10x KAPA End Repair Buffer, 1 µL of KAPA End Repair Enzyme Mix, and 1.6 µL of H2O | ||
A-taling master mix | Combine 1 µL of KAPA A-Tailing Buffer, 0.6 µL of KAPA A-Tailing Enzyme, and 8.4 µL of H2O | ||
Ligation buffer mix | Combine 2 µL of KAPA ligation buffer and 6 µL of H2O | ||
Real-time PCR master mix | Combine 5 µL of 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, 0.35 µL of PCR Primer Mix (10 µM each of forward primer AATGATACGGCGACCACCGAG and reverse primer CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), and 3.15 µL of H2O | ||
PCR master mix | Combine 10 µL of 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 µL of PCR Primer Mix, and 0.6 µL of H2O | ||
Integrative Genomics Viewer | Broad Institute | IGV_2.3.88 | Genome browser to visualize sequencing data |
DNA olgionucleotide: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′ | Eurofins Genomics | A primer to amplify the promoter region of GAPDH | |
DNA olgionucleotide: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′ | Eurofins Genomics | A primer to amplify the promoter region of GAPDH | |
SYBR Premix Ex Taq | Takara | RR420L | To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region |
Thermal Cycler Dice | Takara | TP870 | To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region |