タンデム クロマチンのステップバイ ステップ プロトコルについて述べる免疫沈降配列 (tChIP-Seq) 細胞型特異ゲノムワイドなヒストン修飾の解析を可能にします。
エピジェネティック制御は、遺伝子発現の中心的な役割を果たしています。ヒストン修飾は、1960 年代に発見された、ので、その生理学的および病理学的機能が幅広く研究されています。確かに、次世代のディープ シーケンスと特定のヒストン修飾抗体を介してクロマチン免疫沈降 (チップ) の出現は遺伝子エピジェネティック制御の私達の眺めをもたらしました。逆に、組織は通常種類の多様な細胞で構成されて、彼らの複雑な混合物の特定の細胞型のエピゲノムを調査する課題が分析。ゲノムワイドなセル型固有クロマチンの状態に対処するため我々 は最近セルからタグ ヒストン蛋白によるクロマチンの選択的浄化に基づいているタンデム クロマチン免疫沈降配列 (tChIP-Seq) を開発チップ以下続く金利の種類このプロトコルの目標は tChIP 以下のベスト ・ プラクティスの導入この手法は、組織固有のエピゲノム多様なヒストン修飾とそのモデル生物の調査のための多機能なツールを提供します。
動物の組織は、多様な細胞の種類で構成されます。各細胞の遺伝子の規則では、セルの種類を定義します。クロマチン修飾 DNA メチル化とヒストン修飾、遺伝子発現の細胞型特異性の根底にあります。したがって、各細胞型におけるエピジェネティクス制御の測定が望まれているが、それは技術的な挑戦をされています。
特定のセル型でエピジェネティクスを調べるためには、タンデム クロマチン免疫沈降シーケンス (Seq tChIP) は最近開発された(図 1)1だったTChIP、コアのエピトープ タグ ヒストン H2B は細胞型特異プロモーターから表されます。材料は種々 の細胞の混合物から開始されますが、この機能によりクロマチン興味のセルからの分離です。次チップ Seq-変更されたヒストン マークと次世代のディープ シーケンスを介してクロマチン精製 DNA を隔離した-我々 はゲノムワイドな標的細胞型のエピジェネティックな状態を監視できます。
この手法を使用すると、最近のヒストン H3 リジン 4 (H3K4me3) 蛋白質ニューロン固有トリメチルを調査したマーク。その研究では、Cre を介する組み換え (Rosa26CAG floxed pA H2B フラグ) に表現された蛋白質の C 末端タグ付きのフラグ H2B のノックアウトのマウスを開発しました。CamK2a プロモーターの制御下で Cre 小胞体 (ER) の遺伝子を持つマウスとの交雑、による得られたマウス ラインはタモキシフェン注入 (Camk2aH2B フラグ)1にアクティブなニューロンの H2B フラグを誘発しました。アンチ H3K4me3 抗体 tChIP Seq を行ったマウスの確立されたラインの脳から始まって、.H3K4me3 マークは、しばしばプロモーター領域に対応するのでニューロン1特異的に発現する Mrna の何百もを見出す可能性があります。
ここでは、組織郭清からライブラリーの構築(図 1)へのステップをカバーする典型的な tChIP Seq 手法について述べる。この議定書の最終的な目標は、tChIP Seq のパフォーマンスと他のセルタイプおよびヒストンの修正にこのメソッドの将来のアプリケーションのためのベスト プラクティスを共有することです。
我々 のプロトコル フラグ タグ H2B の式がタモキシフェン投与により誘導されるマウスの脳の神経細胞の最適化を行った。H2B 式、原料、組織および組織の量に使用プロモーターが成功 tChIP シーケンスの極めて重要なパラメーターしたがって、これらの要因の最適化は、興味のセル タイプごとに考慮されなければなりません。
このプロトコルに使用するプロシージャの間…
The authors have nothing to disclose.
私たちは論文の批判的な読みの岩崎研究室のすべてのメンバーに感謝します。この作品は文部省科学研究領域 (S.N. と点火する JP17H05679 #26113005); 科学研究の部分で支えられました科研費若手研究者教育省、科学、スポーツ、(文部科学省); 日本の文化から (A) (点火する JP17H04998)先駆的プロジェクト「携帯電話の進化」とすべての理化学研究所プロジェクト「病気とエピゲノム」理化学研究所から (S.N. 点火し)。
Protein LoBind tube, 2 mL | Eppendorf | No. 0030108132 | For cell lysis |
Protein LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | No. 0030108116 | For ChIP and library preparation |
DNA LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | No. 0030108051 | For ChIP and library preparation |
8-strip PCR tube | BIO-BIK | 3247-00 | For ChIP and library preparation |
SK Mill | TOKKEN | SK-200 | Handy cryogenic grinder to make cell powder for fixation |
Metal bullet | TOKKEN | SK-100-DLC10 | Accessory of SK Mill |
2 mL stainless steel tube | TOKKEN | TK-AM5-SUS | An option for cell lysis |
2 mL stainless steel tube holder | TOKKEN | SK-100-TL | An option for cell lysis |
16% formaldehyde (w/v), methanol-free | Pierce | 28906 | To fix cells. Prepare 1% solution before use. |
Glycine | Nacalai Tesque | 17109-35 | Prepare 2.5 M stock |
D-PBS (-)(1x) | Nacalai Tesque | 14249-24 | For washing lysate and purified DNA |
HEPES | Nacalai Tesque | 02443-05 | For Lysis buffer 1. Prepare 1 M, pH 7.5 stock. |
5 M NaCl, molecular biology grade | Nacalai Tesque | 06900-14 | For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer |
0.5 M EDTA, molecular biology grade | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 311-90075 | For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer |
Glycerol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 072-04945 | For lysis buffer 1 |
NP-40 | Nacalai Tesque | 25223-75 | For lysis buffer 1 |
Triton X-100, molecular biology grade | Nacalai Tesque | 12967-32 | For Lysis buffer 1 |
Tris | Nacalai Tesque | 35406-91 | For Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer. Prepare 1 M, pH 8.0 stock. |
0.1 M EGTA pH neutral | Nacalai Tesque | 08947-35 | For Lysis Buffer 2 |
Protease inhibitor cocktail (100x) | Nacalai Tesque | 25955-24 | To block degradation of protein |
RIPA buffer | Thermo Fisher Scientific | 89900 | For cell lysis and washing |
milliTUBE 1 mL AFA Fiber | Covaris | 520130 | Sonicator tube. Accessory of Focused-ultrasonicator |
Focused-ultrasonicator | Covaris | S220 or E220 | To digest DNA into adequate size for ChIP-Seq |
UltraPure 10% SDS | Thermo Fisher Scientific | 15553-027 | For ChIP Elution Buffer |
RNase A | Nacalai Tesque | 30141-14 | To purify DNA from lysate |
Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115887001 | To purify DNA from lysate |
Ethanol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 054-07225 | Make 70% solution |
Monoclonal anti-FLAG M2 antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | F1804 | To purify chromatin expressed in cells of interest |
Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | 11201D | This can be used for anti-FLAG IP and anti-H3K4me3 IP |
Anti-tri-methyl histone H3 (K4), mouse monoclonal antibody | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 301-34811 | Any other antibody that works for ChIP analysis will work |
10x Blocking Reagent | Sigma-Aldrich | 11096176001 | For blocking during affinity purification |
Denhardt’s solution | Nacalai Tesque | 10727-74 | For blocking during affinity purification |
Glycogen (5 mg/ml) | Thermo Fisher Scientific | AM9510 | To purify DNA from lysate |
Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | For quantification of isolated DNA |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | For quantification of isolated DNA |
0.5 mL tube | Axygen | 10011-830 | For quantification by Qubit |
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Nacalai Tesque | 25970-56 | To purify DNA from lysate |
AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | SPRI magnetic beads for library preparation |
Metal ice rack | Funakoshi | IR-1 | To keep the cell lysate frozen |
Sample Cooler | New England Biolabs | T7771S | Helps fix cells with minimal damage |
2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | To check the quality of isolated DNA fragments. Another fragment analyzer can be used. |
Bioanalyzer 2100 Expert Software | Agilent Technologies | G2946CA | Supplied with the Bioanalyzer |
High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | To check the quality of the isolated DNA fragments |
KAPA LTP Library Preparation Kit | Roche | 07961898001 | Supplied with 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase, and PEG/NaCl solution |
NEXTflex DNA Barcodes | BIOO Scientific | NOVA-514101 | Adapter for library preparation. Supplied with DNA Barcode Adapters and Primer Mix. |
KAPA Real-Time Library Amplification Kit | Roche | 07959028001 | Supplied with 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix, and Fluorescent Standards |
2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Roche | KM2602 | For library preparation. Additionally, this enzyme may be required for the KAPA Real-Time Library Amplification Kit |
Buffer EB | Qiagen | 19086 | 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 for elution of DNA |
386-well qPCR plate | Thermo Fisher Scientific | 4309849 | For real-time PCR |
QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4485701 | To quantify DNA |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | For real-time PCR |
MicroAmp Clear Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | For plate sealing |
End-repair master mix | Combine 1.4 µL of 10x KAPA End Repair Buffer, 1 µL of KAPA End Repair Enzyme Mix, and 1.6 µL of H2O | ||
A-taling master mix | Combine 1 µL of KAPA A-Tailing Buffer, 0.6 µL of KAPA A-Tailing Enzyme, and 8.4 µL of H2O | ||
Ligation buffer mix | Combine 2 µL of KAPA ligation buffer and 6 µL of H2O | ||
Real-time PCR master mix | Combine 5 µL of 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, 0.35 µL of PCR Primer Mix (10 µM each of forward primer AATGATACGGCGACCACCGAG and reverse primer CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), and 3.15 µL of H2O | ||
PCR master mix | Combine 10 µL of 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 µL of PCR Primer Mix, and 0.6 µL of H2O | ||
Integrative Genomics Viewer | Broad Institute | IGV_2.3.88 | Genome browser to visualize sequencing data |
DNA olgionucleotide: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′ | Eurofins Genomics | A primer to amplify the promoter region of GAPDH | |
DNA olgionucleotide: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′ | Eurofins Genomics | A primer to amplify the promoter region of GAPDH | |
SYBR Premix Ex Taq | Takara | RR420L | To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region |
Thermal Cycler Dice | Takara | TP870 | To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region |