Vi beskriver ett stegvisa protokoll för tandem kromatin immunoprecipitation sekvensering (tChIP-Seq) som möjliggör analys av cell-typspecifika genome-wide Histon modifiering.
Epigenetisk reglering spelar centrala roller i genuttryck. Sedan Histon modifiering upptäcktes på 1960-talet, har dess fysiologiska och patologiska funktioner studerats. Faktiskt, tillkomsten av nästa generations djupsekvensering och kromatin immunoprecipitation (ChIP) via specifika Histon modifiering antikroppar har revolutionerat vår syn på epigenetisk reglering över hela genomet. Omvänt, vävnader består vanligtvis av olika celltyper och deras komplex blandning analytiska utmaningar att utreda epigenomet i en viss celltyp. För att lösa cell typspecifika kromatin staten på ett sätt som genome-wide, utvecklat vi nyligen tandem kromatin immunoprecipitation sekvensering (tChIP-Seq), som bygger på Selektiv rening av kromatin av märkta core Histon proteiner från cell typer av intresse, följt av ChIP-följande punkter Målet med detta protokoll är införandet av bästa praxis för tChIP-följande punkter Denna teknik är ett mångsidigt verktyg för vävnadsspecifika epigenomet utredning i olika Histon modifieringar och modellorganismer.
Vävnader av djur består av olika celltyper. Genreglering i varje cell definierar celltypen. Kromatin ändringar – DNA metylering och Histon ändring – ligger bakom celltyp specificitet av genuttryck. Således, mätning av epigenetisk reglering i varje celltyp har varit önskat, men det har varit en teknisk utmaning.
För att undersöka epigenetiken i en viss celltyp, var tandem kromatin immunoprecipitation sekvensering (tChIP-Seq) nyligen utvecklade ()figur 1)1. I tChIP uttrycks epitop-taggade core Histon protein H2B från en-typ-specifika promotorn. Denna funktion kan isolering av Chromatinsen från cellerna av intresse, även om materialet börjar från en blandning av olika celltyper. Följande ChIP-Seq — kromatin rening via en modified-histonglykoprotein mark och nästa generations djupsekvensering av isolerad DNA — vi kan övervaka epigenetiska status för den rikta Celltypen i genome-wide sätt.
Med denna teknik, vi nyligen undersökt neuron-specifika trimethylation av Histon H3 protein på lysin 4 (H3K4me3) märken. I denna studie har utvecklat vi en inpressning mus i vilken C-obotligt flagga-taggade H2B protein uttrycktes på Cre-medierad rekombination (Rosa26CAG floxed-pA H2B-flagga). Genom korsning med en mus som har genen Cre-endoplasmic reticulum (ER) under kontroll av CamK2a promotorn, inducerad raden erhållna mus H2B-flagga i aktiva nervceller vid tamoxifen injektion (Camk2aH2B-flaggan)1. Start från hjärnan av raden etablerade mus, utfört vi tChIP-Seq med anti-H3K4me3 antikropp. Eftersom H3K4me3 märken ofta motsvarar arrangören regioner, kan vi upptäcka hundratals mRNA specifikt uttryckt i nervceller1.
Här, beskriver vi en typisk tChIP-Seq metod som omfattar stegen från vävnad dissektion till biblioteket konstruktion ()figur 1). Det slutliga målet med detta protokoll är att dela våra bästa metoder för utförandet av tChIP-Seq och den framtida tillämpningen av denna metod till andra celltyper och Histon ändringar.
Våra protokoll var optimerad för nervceller i hjärnans mus, där uttrycket av flagg-märkta H2B framkallas av tamoxifen injektion. Initiativtagare som används för H2B uttryck, vävnad utgångsmaterial och beloppet av vävnaderna är avgörande parametrar för framgångsrika tChIP-följande punkter Således, optimering av dessa faktorer övervägas för varje celltyp av intresse.
Ett kritiskt steg bland de förfaranden som används i detta protokoll är DNA klippning för att uppnå en kro…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar alla medlemmar i Iwasaki lab för kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete var stöds delvis av ett bidrag för vetenskaplig forskning på innovativa områden (nr 26113005 att S.N. och JP17H05679 till S.I.); ett bidrag för unga forskare (A) (JP17H04998 till S.I.) från ministeriet för utbildning, vetenskap, sport och kultur i Japan (MEXT); och banbrytande projekt ”cellulära Evolution” och alla RIKEN projektet ”sjukdom och epigenomet” från RIKEN (till S.N. och S.I.).
Protein LoBind tube, 2 mL | Eppendorf | No. 0030108132 | For cell lysis |
Protein LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | No. 0030108116 | For ChIP and library preparation |
DNA LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | No. 0030108051 | For ChIP and library preparation |
8-strip PCR tube | BIO-BIK | 3247-00 | For ChIP and library preparation |
SK Mill | TOKKEN | SK-200 | Handy cryogenic grinder to make cell powder for fixation |
Metal bullet | TOKKEN | SK-100-DLC10 | Accessory of SK Mill |
2 mL stainless steel tube | TOKKEN | TK-AM5-SUS | An option for cell lysis |
2 mL stainless steel tube holder | TOKKEN | SK-100-TL | An option for cell lysis |
16% formaldehyde (w/v), methanol-free | Pierce | 28906 | To fix cells. Prepare 1% solution before use. |
Glycine | Nacalai Tesque | 17109-35 | Prepare 2.5 M stock |
D-PBS (-)(1x) | Nacalai Tesque | 14249-24 | For washing lysate and purified DNA |
HEPES | Nacalai Tesque | 02443-05 | For Lysis buffer 1. Prepare 1 M, pH 7.5 stock. |
5 M NaCl, molecular biology grade | Nacalai Tesque | 06900-14 | For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer |
0.5 M EDTA, molecular biology grade | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 311-90075 | For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer |
Glycerol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 072-04945 | For lysis buffer 1 |
NP-40 | Nacalai Tesque | 25223-75 | For lysis buffer 1 |
Triton X-100, molecular biology grade | Nacalai Tesque | 12967-32 | For Lysis buffer 1 |
Tris | Nacalai Tesque | 35406-91 | For Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer. Prepare 1 M, pH 8.0 stock. |
0.1 M EGTA pH neutral | Nacalai Tesque | 08947-35 | For Lysis Buffer 2 |
Protease inhibitor cocktail (100x) | Nacalai Tesque | 25955-24 | To block degradation of protein |
RIPA buffer | Thermo Fisher Scientific | 89900 | For cell lysis and washing |
milliTUBE 1 mL AFA Fiber | Covaris | 520130 | Sonicator tube. Accessory of Focused-ultrasonicator |
Focused-ultrasonicator | Covaris | S220 or E220 | To digest DNA into adequate size for ChIP-Seq |
UltraPure 10% SDS | Thermo Fisher Scientific | 15553-027 | For ChIP Elution Buffer |
RNase A | Nacalai Tesque | 30141-14 | To purify DNA from lysate |
Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115887001 | To purify DNA from lysate |
Ethanol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 054-07225 | Make 70% solution |
Monoclonal anti-FLAG M2 antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | F1804 | To purify chromatin expressed in cells of interest |
Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | 11201D | This can be used for anti-FLAG IP and anti-H3K4me3 IP |
Anti-tri-methyl histone H3 (K4), mouse monoclonal antibody | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 301-34811 | Any other antibody that works for ChIP analysis will work |
10x Blocking Reagent | Sigma-Aldrich | 11096176001 | For blocking during affinity purification |
Denhardt’s solution | Nacalai Tesque | 10727-74 | For blocking during affinity purification |
Glycogen (5 mg/ml) | Thermo Fisher Scientific | AM9510 | To purify DNA from lysate |
Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | For quantification of isolated DNA |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | For quantification of isolated DNA |
0.5 mL tube | Axygen | 10011-830 | For quantification by Qubit |
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Nacalai Tesque | 25970-56 | To purify DNA from lysate |
AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | SPRI magnetic beads for library preparation |
Metal ice rack | Funakoshi | IR-1 | To keep the cell lysate frozen |
Sample Cooler | New England Biolabs | T7771S | Helps fix cells with minimal damage |
2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | To check the quality of isolated DNA fragments. Another fragment analyzer can be used. |
Bioanalyzer 2100 Expert Software | Agilent Technologies | G2946CA | Supplied with the Bioanalyzer |
High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | To check the quality of the isolated DNA fragments |
KAPA LTP Library Preparation Kit | Roche | 07961898001 | Supplied with 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase, and PEG/NaCl solution |
NEXTflex DNA Barcodes | BIOO Scientific | NOVA-514101 | Adapter for library preparation. Supplied with DNA Barcode Adapters and Primer Mix. |
KAPA Real-Time Library Amplification Kit | Roche | 07959028001 | Supplied with 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix, and Fluorescent Standards |
2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Roche | KM2602 | For library preparation. Additionally, this enzyme may be required for the KAPA Real-Time Library Amplification Kit |
Buffer EB | Qiagen | 19086 | 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 for elution of DNA |
386-well qPCR plate | Thermo Fisher Scientific | 4309849 | For real-time PCR |
QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4485701 | To quantify DNA |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | For real-time PCR |
MicroAmp Clear Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | For plate sealing |
End-repair master mix | Combine 1.4 µL of 10x KAPA End Repair Buffer, 1 µL of KAPA End Repair Enzyme Mix, and 1.6 µL of H2O | ||
A-taling master mix | Combine 1 µL of KAPA A-Tailing Buffer, 0.6 µL of KAPA A-Tailing Enzyme, and 8.4 µL of H2O | ||
Ligation buffer mix | Combine 2 µL of KAPA ligation buffer and 6 µL of H2O | ||
Real-time PCR master mix | Combine 5 µL of 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, 0.35 µL of PCR Primer Mix (10 µM each of forward primer AATGATACGGCGACCACCGAG and reverse primer CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), and 3.15 µL of H2O | ||
PCR master mix | Combine 10 µL of 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 µL of PCR Primer Mix, and 0.6 µL of H2O | ||
Integrative Genomics Viewer | Broad Institute | IGV_2.3.88 | Genome browser to visualize sequencing data |
DNA olgionucleotide: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′ | Eurofins Genomics | A primer to amplify the promoter region of GAPDH | |
DNA olgionucleotide: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′ | Eurofins Genomics | A primer to amplify the promoter region of GAPDH | |
SYBR Premix Ex Taq | Takara | RR420L | To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region |
Thermal Cycler Dice | Takara | TP870 | To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region |