TChIP-Seq: Cellula-tipo-specifico Epigenome profilatura

Summary

Descriviamo un protocollo passo-passo per la cromatina tandem immunoprecipitazione sequenziamento (tChIP-Seq) che permette l'analisi di modifica dell'istone di genoma di cellula-tipo-specifico.

Abstract

Regolazione epigenetica svolge ruoli centrali nell'espressione genica. Dal momento che la modifica dell'istone è stato scoperto nel 1960, le sue funzioni fisiologiche e patologiche sono stati studiati estesamente. Infatti, l'avvento della nuova generazione sequenziamento profondo e immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) via gli anticorpi specifici istone modifica ha rivoluzionato il nostro punto di vista della regolazione epigenetica in tutto il genoma. Al contrario, tessuti in genere consistono di tipi cellulari diversi e loro miscela complessa pone sfide analitiche ad indagare l'epigenoma in un tipo di cella specifica. Per risolvere lo stato di tipo-specific cromatina delle cellule in un modo del genoma, recentemente abbiamo sviluppato il sequenziamento di immunoprecipitazione della cromatina tandem (tChIP-Seq), che è basato sulla purificazione selettiva della cromatina di proteine istoniche core contrassegnati dalla cella tipi di interesse, seguita da ChIP-seq. L'obiettivo del presente protocollo è l'introduzione delle migliori pratiche di tChIP-segg. Questa tecnica fornisce uno strumento versatile per epigenome tessuto-specifica indagine in modificazioni istoniche diversificata e organismi modello.

Introduction

Tessuti di animali consistono di tipi cellulari diversi. La regolazione genica in ogni cella definisce il tipo di cella. Modificazioni della cromatina - modifica del DNA di metilazione e istone - sono alla base della specificità di cellula-tipo dell'espressione genica. Così, la misura della regolazione epigenetica in ciascun tipo di cella è stata voluta, ma è stato una sfida tecnica.

Per studiare l'epigenetica in un tipo di cellula particolare, sequenziamento di immunoprecipitazione della cromatina tandem (tChIP-Seq) è stato sviluppato di recente (Figura 1)¹. In tChIP, proteina di nucleo epitopo-etichetta dell'istone H2B è espresso da un promotore di cellula-tipo-specifico. Questa funzione permette l'isolamento di cromatine dalle celle di interesse, anche se il materiale viene avviato da una miscela di vari tipi cellulari. Seguenti ChIP-Seq — purificazione della cromatina attraverso un contrassegno dell'istone per volta e generazione sequenziamento profondo del DNA isolato — possiamo monitorare lo stato epigenetico del tipo cellulare mirati in maniera genoma.

Usando questa tecnica, abbiamo recentemente studiato trimethylation di neurone-specific dell'istone H3 proteina a lisina 4 (H3K4me3) marchi. In quello studio, abbiamo sviluppato un topo knock-nel quale C-terminale Bandierina-etichettate H2B proteina è stata espressa su ricombinazione Cre-mediata (Rosa26^{CAG floxed-pA H2B-bandiera}). Dall'incrocio con un mouse che possiedono il gene Cre-reticolo endoplasmatico endoplasmatico (ER) sotto il controllo del promotore CamK2a, la linea di topo ottenuti indotta H2B-bandiera in neuroni attivi su tamoxifen iniezione (Camk2a^H2B-bandiera)¹. A partire dal cervello della riga del mouse stabilito, abbiamo effettuato tChIP-Seq con anticorpo anti-H3K4me3. Poiché H3K4me3 marchi corrispondono spesso a regioni promotrici, potremmo scoprire centinaia di mRNAs specificamente espressi nei neuroni¹.

Qui, descriviamo un metodo tipico tChIP-Seq che copre le misure da dissezione del tessuto per la costruzione della libreria (Figura 1). L'obiettivo finale di questo protocollo è quello di condividere le nostre best practice per le prestazioni di tChIP-Seq e la futura applicazione di questo metodo ad altri tipi di cellule e modificazioni istoniche.

Protocol

Tutti i metodi descritti nel presente documento sono stati approvati dalla divisione sicurezza di RIKEN (H27-EP071) e condotti con regolamenti e linee guida pertinenti.

1. dissezione del tessuto

1. Sezionare i tessuti di interesse in piccoli pezzi (circa < 3 mm²) usando le forbici di primavera.
   Nota: Frammenti di tessuto più grandi richiedono più tempo per congelare, e pezzi più piccoli verranno riporto più grandi volumi di tampone, entrambi i quali possono alterare i risultati.
2. Aggiungere i frammenti di tessuto dissecato in un contenitore pulito riempito con azoto liquido e raccoglierli in provette da 2 mL (1 parte per tubo) riempito con azoto liquido.
   Nota: I tubi con una superficie idrofila sono consigliati per questo passaggio.
3. Disporre le provette a-80 ° C per > 5 min con il tappo aperto per far evaporare l'azoto liquido rimanente.
   Nota: Dopo aver chiuso il tappo, frammenti di tessuto possono essere conservati a-80 ° C per un mese prima dell'uso.

2. fissazione delle cellule

Nota: Abbiamo usato una smerigliatrice criogenica utile per questo passaggio. Un apparecchio alternativo può essere utilizzato.

1. Posto i 2 mL-basso legame provette contenenti i campioni di tessuto su un rack di ghiaccio metallo raffreddato in azoto liquido.
2. Inserire un punto metallico in un 1,5 mL-tubo e chill con azoto liquido. Posizionarlo sul cestello ghiaccio in metallo.
3. Aprire il 2 mL-tubo e inserire il proiettile di metallo prechilled nella provetta. Chiudere il tappo, impostare i 2 mL-tubi in supporto del tubo di una smerigliatrice criogenico utile e immergere immediatamente il supporto tubo assemblato in azoto liquido per 1 min.
4. Inserire il supporto di tubo congelato la cassetta esterna del macinino criogenico utile ed agitare vigorosamente 60 volte per 30 s.
5. Smontare il supporto tubo, rimuovere il proiettile in metallo e posto i 2 mL-tubo su un raffreddatore di campioni prechilled a-20 ° C.
6. Il campione viene posto più fresco a-20 ° C per 15 min evitare il congelamento di fissativo nel passaggio successivo.
7. Portare il campione più fresco al banco, aprire il coperchio del tubo e immediatamente gocciolare 900 µ l di 1% di formaldeide in esso. Dopo parecchie volte il pipettaggio, trasferire la sospensione nel nuovo 2 mL-tubo contenente 900 µ l di 1% di formaldeide e correzione per 10 min con delicata rotazione in un incubatore a 23 ° C.
   Attenzione: La formaldeide è tossica e nociva.
8. Per interrompere la reazione di fissazione, aggiungere 100 µ l di glicina di 2,5 M per ogni provetta e centrifugare per 5 min a 3.000 x g a 4 ° C. Scartare il surnatante.
9. Aggiungere 1 mL di gelida tampone fosfato salino (PBS), centrifuga per 5 min a 3.000 x g a 4 ° C e scartare il surnatante. Ripetere questo passaggio due volte (3 lavaggi in totale).
   Nota: Campioni fissi possono essere congelati a flash di azoto liquido e conservato a-80 ° C.
10. Aggiungere 500 µ l di tampone di lisi 1 (50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES)-KOH (pH 7.5), 140 mM NaCl, 1 mM Etilendiamminotetraacetico acido (EDTA) (pH 8.0), 10% w/v glicerolo, 0,5% w/v NP-40, inibitore della proteasi di 0.25% w/v Triton x X-100 e 0.1 cocktail) per il pellet, dispensare diverse volte e ruotare per 10 min a 4 ° C.
    Nota: Il Buffer di lisi 1 dovrebbe essere filtrato e conservato a 4 ° C prima dell'uso.
11. Centrifugare per 5 min a 3.000 x g a 4 ° C e scartare il surnatante.
12. Aggiungere 1 mL di tampone di lisi 2 (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8.0), 0,5 mM EGTA e 0.1 x cocktail dell'inibitore di proteasi) per il pellet, vortice e ruotare per 10 min a 4 ° C.
    Nota: Il Buffer di lisi 2 dovrebbe essere filtrato e conservato a 4 ° C prima dell'uso.
13. Centrifugare per 5 min a 3.000 x g a 4 ° C e scartare il surnatante.
14. Aggiungere 800 µ l di tampone di dosaggio (RIPA) di radioimmunoprecipitation con inibitore di proteasi 1x cocktail al pellet e risospendere il pellet di pipettaggio.
15. Centrifugare per 5 min a 3.000 x g a 4 ° C e scartare il surnatante.
16. Aggiungere 500 µ l di tampone RIPA con 1 inibitore della proteasi x cocktail.
17. Centrifugare per 5 min a 3.000 x g a 4 ° C e scartare il surnatante.
18. Aggiungere 1 mL di tampone RIPA con 1 inibitore della proteasi x cocktail. Procedere immediatamente alla fase successiva.

3. cromatina tosatura

1. Trasferire il lisato in una provetta di sonicatore e quindi posizionare il tubo su un ultrasonicatore.
2. La cromatina di taglio con le seguenti impostazioni: temperatura: 4 ° C; picco di potenza incidente: 175 W; fattore di utilizzo: 10%; cicli/scatti in sequenza: 200; e tempo: 2.400 s.
3. Trasferire il campione per un 1,5 mL-proteina obbligatoria bassa provetta e centrifugare per 5 min a 20.000 x g a 4 ° C.
4. Raccogliere il surnatante in un nuovo tubo basso legame proteico.
   Nota: Il campione può essere flash-congelati in azoto liquido e conservato a-80 ° C.

4. qualità del controllo dei DNA (Reverse reticolazione)

1. Mix 20 µ l del lisato e 180 µ l di tampone di eluizione di ChIP (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8.0) e 1% w/v sodio dodecil solfato (SDS)) in una provetta di reazione a catena (PCR) della polimerasi. Incubare il campione a 65 ° C in un termociclatore per 6 ore con il coperchio del termociclatore aperto. Tenere il coperchio del termociclatore aperto per evitare eccessiva denaturazione.
   Nota: Il tampone di eluizione di ChIP dovrebbe essere filtrato e conservato a temperatura ambiente prima dell'uso. Al termine dell'incubazione può essere esteso per tutta la notte.
2. Aggiungere 1 µ l di 10 mg/mL RNasi A, vortex e incubare a 37 ° C per 30 min.
3. µ L 6,5 di 15 mg/mL proteinasi K, vortice e incubare a 55 ° C per 60 min.
4. Trasferire la reazione ad un tubo basso legame al DNA, aggiungere 4 µ l di glicogeno 5 mg/mL e vortice. Quindi, aggiungere 200 µ l di fenolo/cloroformio/alcool isoamilico (25:24:1) e centrifugare per 5 min a 18.000 x g a temperatura ambiente.
5. Trasferire il surnatante in una provetta di basso associazione DNA nuova. Aggiungere 200 µ l di tampone Tris-EDTA-NaCl (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA (pH 8.0) e 200 mM NaCl) per la soluzione di fenolo/cloroformio/alcool isoamilico rimanente e centrifugare per 5 min a 18.000 x g e a temperatura ambiente. Raccogliere il surnatante e mescolare con il surnatante primo.
6. Aggiungere 900 µ l di etanolo ghiacciata e incubare per 1 h a-20 ° C.
   Nota: al termine dell'incubazione può essere esteso a 4 - 6 h.
7. Centrifuga per 30 min a 18.000 x g a 4 ° C.
8. Scartare il surnatante. Aggiungere 1 mL di etanolo di 75% ghiacciata per il pellet e centrifugare per 30 min a 18.000 x g a 4 ° C. Ripetere questo passaggio (due lavaggi in totale).
9. Scartare il surnatante accuratamente e asciugare all'aria per 1 min a temperatura ambiente.
10. Aggiungere 50 µ l di tampone Tris-EDTA (TE) e sciogliere il DNA mediante incubazione a temperatura ambiente per 30 min o a 4 ° C durante la notte. Evitare nel Vortex o pipettaggio. Mantenere questo DNA come "input" e utilizzarlo per la preparazione di libreria se necessario.
11. Misurare la concentrazione di DNA con un fluorometro seguendo le istruzioni del produttore (Vedi tabella dei materiali) e controllare la distribuzione delle dimensioni con una macchina di elettroforesi di microfluidica (Vedi dati rappresentativi, mostrati in figura 2a). uso 10 ng o meno DNA per questo test.
    Nota: Frammenti di 100 – 500 paia di basi (bp) dovrebbero fare 50% o più del DNA.

5. purificazione di affinità dall'anticorpo anti-FLAG

Nota: Per neurone tChIP-Seq, tessuti cerebrali da 8 topi sono in genere utilizzati per un campione di tChIP-Seq per preparare 2 ng di DNA purificato da tandem immunitario-purificazione (Vedi punto 7.1). Nelle nostre mani, 0,1 ng di DNA ancora fornite librerie del DNA di alta qualità per ChIP-Seq (Kadota, inedito). Quindi, in teoria, un unico mouse può essere sufficiente effettuare neurone tChIP-segg. L'importo richiesto deve essere ottimizzato per il tipo di tessuti e cellule di interesse. Per il controllo negativo dell'esperimento imumuno-purificazione, tessuto cerebrale lisato dai topi senza qualsiasi espressione di H2B-bandiera dovrebbe essere preparato e utilizzato.

1. Dispensare 200 µ l di biglie magnetiche coniugato di immunoglobuline anti-topo di pecora G (IgG) in una provetta di basso legame proteico.
2. Posizionare il tubo su un supporto magnetico e attendere per 1 min per il surnatante diventare chiaro. Eliminare il supernatante, aggiungere 1 mL di PBS ghiacciata e vortexare. Ripetere questo passaggio (due lavaggi in totale).
3. Aggiungere 20 µ l di 1 mg/mL di un anticorpo anti-FLAG e ruotare per 5 ore a 4 ° C.
   Nota: al termine dell'incubazione può essere esteso per tutta la notte.
4. Lavare le perline seguendo passo 5.2. Posizionare le perline in una provetta da 15 mL.
5. Risospendere le sfere in 1110 µ l di tampone RIPA e poi 900 µ l di 10 x blocco reagente, 180 µ l di soluzione di Denhardt: 50x, 10 µ l di 100 x cocktail dell'inibitore di proteasi e 6,8 mL del lisato preparato nel passaggio 3. Dividere questa miscela in 5 tubi di proteina obbligatoria bassa. Ruotare per 6 h a 4 ° C.
   Nota: al termine dell'incubazione può essere esteso per tutta la notte.
6. Collocare la provetta sul supporto magnetico e attendere 1 min per il surnatante diventare chiaro. Eliminare il supernatante, aggiungere 1 mL di tampone RIPA e mescolare delicatamente. Ripetere questo passaggio 5 volte (6 lavaggi in totale). Piscina tutte le perline in un tubo di singola proteina obbligatoria bassa.
7. Aggiungere 200 µ l di tampone di eluizione di ChIP e ruotarlo per 15 min a temperatura ambiente. Controllare la qualità del DNA come descritto al punto 4.11 (Vedi dati rappresentativi illustrati nella Figura 2B e C). Procedere immediatamente alla fase successiva.

6. affinità purificazione dall'anticorpo Anti-H3K4me3 e reticolazione inversa

Nota: La seguente perlina preparazione che passaggi (6.1-6.4) devono essere eseguiti prima di passaggio 5.7.

1. Dispensare 40 µ l di biglie magnetiche coniugato di IgG di anti-topo pecore in una provetta da 2 mL-proteina che lega bassa.
2. Collocare la provetta sul supporto magnetico e attendere 1 min per il surnatante diventare chiaro. Eliminare il supernatante, aggiungere 1 mL di PBS ghiacciata e mescolare delicatamente. Ripetere questo passaggio (due lavaggi in totale).
3. Aggiungere 4 µ l di anticorpo anti-H3K4me3 1 mg/mL e ruotare per 6 h a 4 ° C.
4. Lavare le perline seguendo passo 6.2. Posizionare le perline in una provetta da 2 mL-proteina che lega bassa.
5. Risospendere le sfere in 1558 µ l di tampone RIPA e quindi aggiungere 200 µ l di 10 x blocco reagente, 40 µ l di soluzione di Denhardt: 50x, 2 µ l di 100 x inibitore della proteasi cocktail e 200 µ l di eluato preparato nel passaggio 5.7. Ruotare durante la notte a 4 ° C.
   Nota: La SDS nel buffer di eluizione di ChIP è stata diluita più di 10 volte in questa incubazione.
6. Collocare la provetta sul supporto magnetico e attendere 1 min per il surnatante diventare chiaro. Eliminare il supernatante, aggiungere 1 mL di tampone RIPA e mescolare delicatamente. Ripetere questa operazione 4 volte (5 lavaggi in totale). Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire le perle in una provetta di associazione basso di DNA e scartare il surnatante.
7. Aggiungere 200 µ l di tampone di eluizione di ChIP e ruotarlo per 15 min a temperatura ambiente. Trasferire l'eluato un nuovo DNA basso bindingTube.
   Nota: L'eluato possa essere conservato a-80 ° C.
8. Seguire il passaggio 4 per decrosslinking del DNA. Risospendere il DNA purificato in 20 µ l di buffer di TE.
9. Controllare la qualità del DNA come descritto al punto 4.11 (Vedi dati rappresentativi illustrati nella Figura 2D). (opzionale) Eseguire analisi di arricchimento mediante PCR quantitativa come descritto in precedenza². Dieci volte o maggiore arricchimento dovrebbe essere osservato.

7. libreria costruzione

1. Per ogni input e il campione di DNA ChIP, calcolare la percentuale di DNA nella regione 100 – 500-bp utilizzando la funzione di analisi di striscio del software per la macchina di elettroforesi di microfluidica. Stimare il volume di campione richiesto per ottenere 2 ng di 100 – 500 bp DNA. Utilizzare 20 ng DNA nell'intervallo 100-500-bp come l'esempio di "input".
2. Pipettare campioni di DNA in provette per PCR 8-striscia e H₂O per portare il volume totale a 10 µ l. (opzionale) se il volume del DNA supera 10 µ l, proporzionalmente la scalabilità di aggiungere la seguente reazione di fine-riparazione e la selezione della dimensione.
3. Preparare il mix master fine-riparazione (Vedi Tabella materiali). Aggiungere 4 µ l di master mix fine-riparazione del DNA ed incubare per 30 min a 20 ° C.
4. 36 µ l di 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 e 0,6 x volume (30 µ l) di solido fase biglie magnetiche reversibili immobilizzazione (SPRI) e incubare per 5 min a temperatura ambiente.
5. Mettete il tubo su un supporto magnetico e attendere fino a quando il surnatante diventa chiaro.
6. Trasferire il surnatante in una provetta nuova, aggiungere 1,2 x volumi (60 µ l) di biglie magnetiche SPRI e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
7. Mettete il tubo su un supporto magnetico e attendere fino a quando il surnatante diventa chiaro.
8. Lavare le perle due volte con 200 µ l di 80% EtOH, che tiene il tubo ancora sul magnete.
9. Centrifugare brevemente la provetta per raccogliere il residuo EtOH nella parte inferiore e reimmetterlo sul magnete. Rimuovere accuratamente l'EtOH residua.
10. Lasciare il coperchio tubo aperto per 1-2 min consentire l'EtOH ad evaporare.
11. Chiudere il coperchio e tenere il tubo sul ghiaccio.
    Nota: Ora avete ottenuto dimensione selezionata del DNA di 100 – 500 bp le perline. Ulteriori dettagli sulla selezione di dimensione doppia possono essere trovati sul sito Web del produttore (www.beckman.com).
12. Preparare A-tailing master mix (Vedi Tabella materiali).
13. Risospendere le perline (da passo 7.10) con 10 µ l di mix master A-tailing e incubare per 30 min a 30 ° C.
14. Aggiungere 1,8 x volume (18 µ l) di polietilenglicole (PEG) / soluzione di NaCl e incubare per 5 min a temperatura ambiente.
15. Procedura: 7,7-7.11 per purificare il DNA.
16. Preparare la miscela di buffer di legatura (Vedi Tabella materiali).
17. 8 µ l di miscela tampone legatura sulle perle (da passo 7,14), aggiungere 1 µ l di 1 adattatore µM e risospendere le perline. Utilizzare 1 µ l di 5 adattatore di µM per l'esempio di input. Considerare l'utilizzo di schede diverse per ogni campione per multiplexing.
18. Aggiungere 1 µ l di DNA ligasi e incubare per 15 minuti a 20 ° C.
19. Aggiungere 1,0 x volume (10 µ l) di soluzione di PEG/NaCl, risospendere le perline e incubare per 5 min a temperatura ambiente.
20. Procedura: 7,7-7.10 per purificare il DNA.
21. Pipettare 25 µ l di 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 nella provetta e risospendere le perline.
22. Aggiungere 1,0 x volume (25 µ l) di soluzione PEG/NaCl e incubare per 5 min a temperatura ambiente.
23. Procedura: 7,7-7.10 per purificare il DNA.
24. 11 µ l di 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 nella provetta e risospendere le perline.
25. Mettete il tubo su un supporto magnetico e attendere fino a quando il surnatante diventa chiaro.
26. Raccogliere il surnatante in una nuova provetta PCR 8-strip.
27. Preparare in tempo reale PCR master mix (Vedi materiali per dettagli).
28. Pipettare 8,5 µ l di mix master in tempo reale di PCR in una piastra 384 pozzetti quantitativa di PCR (qPCR) e aggiungere 1,5 µ l della scheda di legato del DNA (da passo 7,26).
29. Pipettare 10 µ l di ogni standard fluorescente a vuoto wells.
30. Eseguire PCR in tempo reale con il seguente programma: (98 ° C per 45 s) x 1 ciclo, (98 ° C per 15 s, 60 ° C per 30 s, 72 ° C per 30 s) x 20 cicli, e (72 ° C per 60 s) x 1 ciclo.
31. Determinare il numero di cicli PCR necessari a raggiungere l'intensità di fluorescenza del fluorescente Standard 2.
32. Preparare il PCR master mix (Vedi Tabella materiali).
33. Pipettare 11,5 µ l della miscela PCR padrone nel restante DNA adattatore-legati (da passo 7,26) ed eseguire la PCR come indicato nel passo 7.30 con i cicli PCR determinati nel passaggio 7,31.
34. Aggiungere 1,0 x volume (20 µ l) di soluzione PEG/NaCl e incubare per 5 min a temperatura ambiente.
35. Procedura: 7,7-7.10 per purificare il DNA.
36. Pipettare 20 µ l di 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 nella provetta e risospendere le perline.
37. Mettete il tubo su un supporto magnetico e attendere fino a quando il surnatante diventa chiaro.
38. Raccogliere il surnatante in una provetta da 1,5 mL-DNA basso legante nuovo.
39. Controllare la qualità della libreria come descritto al punto 4.11 (Vedi dati rappresentativi illustrati nella Figura 2E e F). Utilizzare 1 µ l di campione di DNA di biblioteca. (opzionale) Eseguire analisi di arricchimento di qPCR come descritto in precedenza ². Dieci volte o maggiore arricchimento dovrebbe essere osservato.

8. sequenziamento

1. Le librerie in un sequencer di prossima generazione di sequenza (Vedi dati rappresentativi illustrati nella Figura 3).
   Nota: La sequenza profondità sufficiente per l'analisi dei dati varia a seconda delle dimensioni del genoma dell' organismo³. Per uso umano e mouse, si consiglia di ottenere letture almeno 20 milioni di single-end. Secondo la resa di letture, multiplexing potrebbe essere redditizio.

Representative Results

Qui, descriviamo la dissezione del tessuto, fissazione, lisi cellulare, purificazione tandem della cromatina e preparazione libreria DNA Sequencer di prossima generazione. Durante le procedure, si può testare la qualità del DNA, che è la chiave del successo sequenziamento, a più passaggi (Figura 2). Poiché un singolo nucleosoma è in genere circondato da 147 bp DNA ⁴, tranciata DNA non dovrebbe essere più breve di quella dimensione. Subito dopo sonicazione, il DNA è stato isolato ed eseguire su una macchina di elettroforesi di microfluidica (Figura 2A). Nonostante i nostri sforzi per ottimizzare la gamma di dimensioni, abbiamo ancora avuto una popolazione di DNA (circa 2 kbp) che è rimasto unsheared. A questo punto, la frazione di DNA che vanno da 100-500 bp dovrebbe essere 50% o più della popolazione. Dopo la purificazione di affinità dell'anticorpo anti-FLAG (Figura 2B) e quindi dell'anticorpo anti-H3K4me3 (Figura 2D), la qualità del DNA isolato stata controllata nuovamente utilizzando la macchina di elettroforesi di microfluidica e la quantità di DNA che vanno da è stato stimato 100-500 bp. Anche se spesso abbiamo osservato una forte polarizzazione verso 2 kbp frammenti in questa fase, doppia la selezione della dimensione di biglie magnetiche SPRI rimosso questa frazione.

La specificità di immunitario-purificazione del DNA su H2B-bandiera è stata confermata con i campioni di controllo negativo, nel quale cervello lisato dai topi senza H2B-bandiera espressione è stata utilizzata (Figura 2). Abbiamo rilevato in genere trascurabile quantità di DNA da campioni di controllo negativo.

In seguito A-tailing, legatura di adattatore e PCR, è stata verificata la qualità della biblioteca sequenziamento (Figura 2E). In genere, 250-600 bp DNA è stato ottenuto. Il successo regolare ChIP e tChIP sono state evidenziate dall'analisi di arricchimento con qPCR² utilizzando primers targeting per regione del promotore del gene GAPDH (Figura 2F).

Rappresentante legge distribuzioni lungo geni del neurone (Camk2a, Slc17a7 e Gria1) dal genoma-browser sono mostrati in Figura 3. L'arricchimento di letture all'estremità 5 ' dei geni di neurone tChIP-Seq sopra intero cervello tChIP-Seq è stata osservata.

Figura 1: rappresentazione schematica del tChIP-segg. Questa figura è stata modificata da Mito, M. et al. ¹. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: controllo di qualità del DNA. (A, B, Ded E) Elettroferogramma ottenuto utilizzando una macchina di elettroforesi microfluidici per tranciato cromatina DNA (A), DNA purificato con anticorpo anti-FLAG (B) e quindi dell'anticorpo anti-H3K4me3 (C) e la biblioteca finale (D). I picchi evidenziati con numeri verdi e viola rappresentano gli standard dimensioni interne. Le linee tratteggiate Blue indicano le regioni di dimensioni DNA considerate per l'analisi a valle. FU: unità di fluorescenza.
(C) la quantità di DNA recuperato da anti-FLAG immunitario-purificazione. Ogni punto rappresenta una replica indipendente. (F) analisi di arricchimento di qPCR GAPDH di targeting. Ogni punto rappresenta una replica indipendente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: leggere distribuzioni nel neurone tChIP-segg. (A-C) Distribuzioni di lettura lungo geni rappresentativi del neurone a neurone tChIP-Seq e controllo intero cervello tChIP-Seq sono mostrati. RPM: letture al milione letture. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Il nostro protocollo è stato ottimizzato per i neuroni del cervello del mouse, in cui l'espressione della bandierina-etichettate H2B è indotto tramite l'iniezione di tamoxifene. I promotori utilizzati per H2B espressione, materiali di base del tessuto e la quantità dei tessuti sono parametri chiave per successo tChIP-segg. Così, l'ottimizzazione di questi fattori da considerare per ogni tipo di cellula di interesse.

Un passaggio fondamentale tra le procedure utilizzate in questo protocollo è il DNA di taglio per ottenere una lunghezza di cromatina di 100-500 bp⁵. In generale, la standardizzazione del passo sonicazione è complicato, in quanto dipende altamente da una varietà di fattori; condizioni di fissazione, i tessuti utilizzati, l'attrezzatura utilizzata per ultra-sonicazione e l'apparecchiatura di regolazione, tra gli altri. Di conseguenza, ottimizzazione di trial-and-error di questo passaggio di taglio del DNA sarà richiesto per singoli esperimenti. Invece di ultra-sonicazione, trattamento della nucleasi di micrococcal deve essere un'opzione per isolare il DNA di dimensioni nucleosoma singolo, come quello usato in ingenuo ChIP metodo⁶. Sebbene l'omogenea distribuzione delle dimensioni del DNA è ideale, Tosato DNAs può mostrare le popolazioni multiple, come mostrato nella Figura 2A. La selezione di dimensione doppia di biglie magnetiche SPRI, come descritto in precedenza, aiuta a rimuovere il più dimensioni dei frammenti del DNA.

In genere, preparazione libreria richiede 1 ng di 100-500 bp DNA. Basato su questo requisito, abbiamo scalato al materiale iniziale del tessuto cerebrale per i neuroni. Tuttavia, questa procedura potrebbe essere stimolante per estremamente piccoli campioni da tipi rari delle cellule. In tali casi, zione di ChIP, che si basa su Tn5 transposase invece di ligasi e richiede meno materiale⁷, può essere migliore alternativa.

Tuttavia, questo protocollo attuale è limitato ai tipi principali delle cellule nel materiale. Nelle nostre mani, 10% occupazione delle cellule mirate nella popolazione cellulare originale fornito Fiera purificazione della cromatina da bersaglio le cellule¹. Tuttavia, se anche altri tipi di rara delle cellule sono mirati, quindi più fini ottimizzazione di immunoprecipitazione per l'epitopo tag sarà garantito per distinguere il DNA isolato dal DNA contaminato da cellule non mirati. Per procedure consigliate l'analisi dei dati, è consigliabile confrontando i dati per l'analisi di tChIP-Seq controllo dal tessuto intero utilizzato per avviare l'esperimento. Dato che abbiamo trovato significativi pregiudizi da proteina di H2B-bandiera esogenicamente espressa, l'analisi dovrebbe essere confrontato e analizzato di arricchimento (o lo svuotamento) al fondo¹. Per questo controllo, infatti abbiamo creato una linea di mouse con espressa ubiquitariamente H2B-FLAG (Rosa^H2B-bandiera) ed abbiamo effettuato tChIP-Seq¹. Un'interpretazione più dettagliata dei dati è stato discusso in precedenza¹.

Basato sulla nostra analisi, H3K4me3 tChIP-Seq dai neuroni fornito paragonabile o migliore rilevamento di geni noti di neurone-specific di RNA-Seq dai neuroni di FACS-ordinato⁸ e traducendo purificazione di affinità di ribosomi (TRAP)-Seq⁹. Ad esempio, geni noti assone/dendrite-localizzato in modo efficiente sono stati recuperati utilizzando neurone tChIP-Seq¹. Notevolmente, il nostro tChIP-Seq non è limitato per il contrassegno dell'istone promotore-collegato ma è applicabile per altri vari di modifiche dell'istone¹⁰ anche se gli anticorpi sono disponibili. Inoltre, la strategia dell'isolamento di cromatina di istoni di nucleo con tag può essere utilizzata in altri organismi di modello. Anche se qui abbiamo usato l'epitopo FLAG per contrassegnare la proteina del core dell'istone, altri tag può essere applicato. Dal momento che la fissazione di formaldeide al DNA si verifica più comunemente in residui di lisina di una proteina¹¹, un tag con molti lisina dovrebbe essere evitato per eliminare pregiudizi contrassegnando l'epitopo. Così, l'approccio di tChIP-Seq deve essere versatile in diversi tessuti lungo molti tipi di contesti in studi epigenetici.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protein LoBind tube, 2 mL	Eppendorf	No. 0030108132	For cell lysis
Protein LoBind tube, 1.5 mL	Eppendorf	No. 0030108116	For ChIP and library preparation
DNA LoBind tube, 1.5 mL	Eppendorf	No. 0030108051	For ChIP and library preparation
8-strip PCR tube	BIO-BIK	3247-00	For ChIP and library preparation
SK Mill	TOKKEN	SK-200	Handy cryogenic grinder to make cell powder for fixation
Metal bullet	TOKKEN	SK-100-DLC10	Accessory of SK Mill
2 mL stainless steel tube	TOKKEN	TK-AM5-SUS	An option for cell lysis
2 mL stainless steel tube holder	TOKKEN	SK-100-TL	An option for cell lysis
16% formaldehyde (w/v), methanol-free	Pierce	28906	To fix cells. Prepare 1% solution before use.
Glycine	Nacalai Tesque	17109-35	Prepare 2.5 M stock
D-PBS (-)(1x)	Nacalai Tesque	14249-24	For washing lysate and purified DNA
HEPES	Nacalai Tesque	02443-05	For Lysis buffer 1. Prepare 1 M, pH 7.5 stock.
5 M NaCl, molecular biology grade	Nacalai Tesque	06900-14	For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer
0.5 M EDTA, molecular biology grade	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	311-90075	For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer
Glycerol	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	072-04945	For lysis buffer 1
NP-40	Nacalai Tesque	25223-75	For lysis buffer 1
Triton X-100, molecular biology grade	Nacalai Tesque	12967-32	For Lysis buffer 1
Tris	Nacalai Tesque	35406-91	For Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer. Prepare 1 M, pH 8.0 stock.
0.1 M EGTA pH neutral	Nacalai Tesque	08947-35	For Lysis Buffer 2
Protease inhibitor cocktail (100x)	Nacalai Tesque	25955-24	To block degradation of protein
RIPA buffer	Thermo Fisher Scientific	89900	For cell lysis and washing
milliTUBE 1 mL AFA Fiber	Covaris	520130	Sonicator tube. Accessory of Focused-ultrasonicator
Focused-ultrasonicator	Covaris	S220 or E220	To digest DNA into adequate size for ChIP-Seq
UltraPure 10% SDS	Thermo Fisher Scientific	15553-027	For ChIP Elution Buffer
RNase A	Nacalai Tesque	30141-14	To purify DNA from lysate
Proteinase K, recombinant, PCR Grade	Sigma-Aldrich	3115887001	To purify DNA from lysate
Ethanol	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	054-07225	Make 70% solution
Monoclonal anti-FLAG M2 antibody produced in mouse	Sigma-Aldrich	F1804	To purify chromatin expressed in cells of interest
Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	11201D	This can be used for anti-FLAG IP and anti-H3K4me3 IP
Anti-tri-methyl histone H3 (K4), mouse monoclonal antibody	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	301-34811	Any other antibody that works for ChIP analysis will work
10x Blocking Reagent	Sigma-Aldrich	11096176001	For blocking during affinity purification
Denhardt’s solution	Nacalai Tesque	10727-74	For blocking during affinity purification
Glycogen (5 mg/ml)	Thermo Fisher Scientific	AM9510	To purify DNA from lysate
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q32866	For quantification of isolated DNA
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	For quantification of isolated DNA
0.5 mL tube	Axygen	10011-830	For quantification by Qubit
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)	Nacalai Tesque	25970-56	To purify DNA from lysate
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881	SPRI magnetic beads for library preparation
Metal ice rack	Funakoshi	IR-1	To keep the cell lysate frozen
Sample Cooler	New England Biolabs	T7771S	Helps fix cells with minimal damage
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA	To check the quality of isolated DNA fragments. Another fragment analyzer can be used.
Bioanalyzer 2100 Expert Software	Agilent Technologies	G2946CA	Supplied with the Bioanalyzer
High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4626	To check the quality of the isolated DNA fragments
KAPA LTP Library Preparation Kit	Roche	07961898001	Supplied with 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase, and PEG/NaCl solution
NEXTflex DNA Barcodes	BIOO Scientific	NOVA-514101	Adapter for library preparation. Supplied with DNA Barcode Adapters and Primer Mix.
KAPA Real-Time Library Amplification Kit	Roche	07959028001	Supplied with 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix, and Fluorescent Standards
2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Roche	KM2602	For library preparation. Additionally, this enzyme may be required for the KAPA Real-Time Library Amplification Kit
Buffer EB	Qiagen	19086	10 mM Tris-Cl, pH 8.5 for elution of DNA
386-well qPCR plate	Thermo Fisher Scientific	4309849	For real-time PCR
QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	4485701	To quantify DNA
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	For real-time PCR
MicroAmp Clear Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4306311	For plate sealing
End-repair master mix			Combine 1.4 µL of 10x KAPA End Repair Buffer, 1 µL of KAPA End Repair Enzyme Mix, and 1.6 µL of H2O
A-taling master mix			Combine 1 µL of KAPA A-Tailing Buffer, 0.6 µL of KAPA A-Tailing Enzyme, and 8.4 µL of H2O
Ligation buffer mix			Combine 2 µL of KAPA ligation buffer and 6 µL of H2O
Real-time PCR master mix			Combine 5 µL of 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, 0.35 µL of PCR Primer Mix (10 µM each of forward primer AATGATACGGCGACCACCGAG and reverse primer CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), and 3.15 µL of H2O
PCR master mix			Combine 10 µL of 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 µL of PCR Primer Mix, and 0.6 µL of H2O
Integrative Genomics Viewer	Broad Institute	IGV_2.3.88	Genome browser to visualize sequencing data
DNA olgionucleotide: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′	Eurofins Genomics		A primer to amplify the promoter region of GAPDH
DNA olgionucleotide: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′	Eurofins Genomics		A primer to amplify the promoter region of GAPDH
SYBR Premix Ex Taq	Takara	RR420L	To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region
Thermal Cycler Dice	Takara	TP870	To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region