Summary

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenom Profilierung

Published: January 23, 2019
doi:

Summary

Wir beschreiben eine Schritt für Schritt Protokoll für Tandem Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung (tChIP-Seq), die es die Analyse der Zelle-typspezifischen genomweite Histon-Modifikation ermöglicht.

Abstract

Epigenetischen Regulation spielt zentrale Rolle in der Genexpression. Da Histon Änderungen in den 1960er Jahren entdeckt wurde, haben seine physiologischen und pathologischen Funktionen ausgiebig studiert. Das Aufkommen der Tiefe Sequenzierung der nächsten Generation und Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) über spezifische Histon Modifikation Antikörper hat in der Tat, unsere Sicht der epigenetischen Regulation über das Genom revolutioniert. Umgekehrt Gewebe bestehen typischerweise aus verschiedenen Zelltypen und ihre komplexe Mischung stellt analytische Herausforderungen an das Epigenom in einem bestimmten Zelltyp zu untersuchen. Um den Zellstatus typspezifische Chromatin in einer genomweiten Weise zu begegnen, haben wir vor kurzem entwickelt Tandem Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung (tChIP-Seq), basiert auf die selektive Reinigung von Chromatin von tagged Kern Histonproteine von Zelle Arten von Interesse, gefolgt von ChIP-seq. Das Ziel dieses Protokolls ist die Einführung von best Practices der tChIP-seq. Diese Technik bietet ein vielseitiges Werkzeug für gewebespezifischen Epigenom Untersuchung in verschiedenen Histon-Modifikationen und Modellorganismen.

Introduction

Gewebe von Tieren bestehen aus unterschiedlichen Zelltypen. Die Genregulation in jeder Zelle definiert die Zelltyp. Chromatin Modifikationen – DNA-Methylierung und Histon Modifikation – unterliegen die Zelltyp Spezifität der Genexpression. So, die Messung der epigenetischen Regulation in jeden Zelltyp wurde gewünscht, aber es war eine technische Herausforderung.

Um die Epigenetik in einem bestimmten Zelltyp zu untersuchen, war Tandem Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung (tChIP-Seq) neu entwickelte ()Abbildung 1()1. In tChIP drückt sich Epitop-Tags Kern Histon Protein H2B aus einer Zelle-Typ-spezifischen Promotor. Dieses Feature ermöglicht die Isolierung des Chromatins aus den Zellen von Interesse, obwohl das Material aus einer Mischung von verschiedenen Zelltypen beginnt. Folgende ChIP-Seq-Chromatin Reinigung über einen geändert-Histon Mark und Tiefe Sequenzierung der nächsten Generation der isolierten DNA – wir können den epigenetischen Status des gezielten Zelltyps in einer genomweiten Weise überwachen.

Mit dieser Technik, untersuchten wir vor kurzem Neuron-spezifische Trimethylation von Histon H3-Proteins an Lysin 4 (H3K4me3) markiert. In dieser Studie entwickelten wir eine Knock-in-Maus in die C-unheilbar Flagge markiert H2B Protein bei der Cre-vermittelten Rekombination (Rosa26CAG Floxed-pA H2B-FLAG) zum Ausdruck kam. Durch Kreuzung mit einer Maus besitzen das Cre-endoplasmic Reticulum (ER)-gen unter der Kontrolle des CamK2a-Promotors induziert der erhaltenen Mauslinie H2B-FLAG in aktiven Neuronen auf Tamoxifen Injektion (Camk2aH2B-FLAG)1. Das Gehirn der etablierten Mauslinie ab, führten wir tChIP-Seq mit Anti-H3K4me3 Antikörper. Da H3K4me3 Marken oft Förderer Regionen entsprechen, konnten wir Hunderte von mRNAs konkret ausgedrückt in Neuronen1entdecken.

Hier beschreiben wir eine typische tChIP-Seq-Methode, die die Schritte vom Gewebe Dissektion bis Bibliotheksbau ()Abbildung 1() umfasst. Das Endziel dieses Protokolls ist, unsere best Practices für die Leistung der tChIP-Seq und die künftige Anwendung dieser Methode zu anderen Zelltypen und Histon-Modifikationen zu teilen.

Protocol

Alle hier beschriebene Methoden wurden von der Abteilung Sicherheit des RIKEN (H27-EP071) genehmigt und mit entsprechenden Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. (1) Gewebe Dissektion Sezieren das Gewebe von Interesse in kleine Stücke (ca. < 3 mm2) mit einer feinen Feder Schere.Hinweis: Größere Gewebefragmente länger zu frieren, und kleinere Stücke tragen über größere Mengen des Puffers, die die Ergebnisse beeinflussen können. Einen sauberen Beh…

Representative Results

Hier beschreiben wir Gewebe Dissektion, Fixierung, Zelle Lysis Tandem Reinigung von Chromatin und DNA-Bibliothek Vorbereitung für nächste Generation Sequenzer. Im Verlauf der Verfahren kann man die Qualität der DNA, testen, das ist der Schlüssel für erfolgreiche Sequenzierung in mehreren Schritten (Abbildung 2). Da ein einzelnes Nukleosom in der Regel 147 bp DNA 4 umgeben istsollte geschert DNA nicht kürzer als dieser Größe sei…

Discussion

Unser Protokoll wurde für die Nervenzellen des Mausgehirns optimiert, der Ausdruck der Flagge markiert H2B durch Tamoxifen Injektion induziert wird. Promotoren verwendet für H2B Ausdruck, Ausgangsstoffe Gewebe und die Menge des Gewebes sind entscheidende Parameter für erfolgreiche tChIP-seq. Die Optimierung dieser Faktoren sollte somit für jeden Zelltyp des Interesses betrachtet werden.

Ein entscheidender Schritt zu den Verfahren, die in diesem Protokoll verwendeten ist die DNA Scheren um …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken allen Mitgliedern des Iwasaki Labor für kritische Lektüre des Manuskripts. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch eine Beihilfe für die wissenschaftliche Forschung an innovativen Bereichen (#26113005, S.N. und JP17H05679, s.i.); eine Beihilfe für den wissenschaftlichen Nachwuchs (A) (JP17H04998, s.i.) vom Ministerium für Bildung, Wissenschaft, Sport und Kultur Japans (MEXT); und die Pioneering Projekte “Zelluläre Evolution” und alle RIKEN Projekt “Krankheit und Epigenom” von RIKEN (zu S.N. s.i.).

Materials

Protein LoBind tube, 2 mL Eppendorf No. 0030108132 For cell lysis
Protein LoBind tube, 1.5 mL Eppendorf No. 0030108116 For ChIP and library preparation
DNA LoBind tube, 1.5 mL Eppendorf No. 0030108051 For ChIP and library preparation
8-strip PCR tube BIO-BIK 3247-00 For ChIP and library preparation
SK Mill TOKKEN SK-200 Handy cryogenic grinder to make cell powder for fixation
Metal bullet TOKKEN SK-100-DLC10 Accessory of SK Mill
2 mL stainless steel tube TOKKEN TK-AM5-SUS An option for cell lysis
2 mL stainless steel tube holder TOKKEN SK-100-TL An option for cell lysis
16% formaldehyde (w/v), methanol-free Pierce 28906 To fix cells. Prepare 1% solution before use.
Glycine Nacalai Tesque 17109-35 Prepare 2.5 M stock
D-PBS (-)(1x) Nacalai Tesque 14249-24 For washing lysate and purified DNA
HEPES Nacalai Tesque 02443-05 For Lysis buffer 1. Prepare 1 M, pH 7.5 stock.
5 M NaCl, molecular biology grade Nacalai Tesque 06900-14 For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer
0.5 M EDTA, molecular biology grade Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 311-90075 For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer
Glycerol Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 072-04945 For lysis buffer 1
NP-40 Nacalai Tesque 25223-75 For lysis buffer 1
Triton X-100, molecular biology grade Nacalai Tesque 12967-32 For Lysis buffer 1
Tris Nacalai Tesque 35406-91 For Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer. Prepare 1 M, pH 8.0 stock.
0.1 M EGTA pH neutral Nacalai Tesque 08947-35 For Lysis Buffer 2
Protease inhibitor cocktail (100x) Nacalai Tesque 25955-24 To block degradation of protein
RIPA buffer Thermo Fisher Scientific 89900 For cell lysis and washing
milliTUBE 1 mL AFA Fiber Covaris 520130 Sonicator tube. Accessory of Focused-ultrasonicator
Focused-ultrasonicator Covaris S220 or E220 To digest DNA into adequate size for ChIP-Seq
UltraPure 10% SDS Thermo Fisher Scientific 15553-027 For ChIP Elution Buffer
RNase A Nacalai Tesque 30141-14 To purify DNA from lysate
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Sigma-Aldrich 3115887001 To purify DNA from lysate
Ethanol Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 054-07225 Make 70% solution
Monoclonal anti-FLAG M2 antibody produced in mouse Sigma-Aldrich F1804 To purify chromatin expressed in cells of interest
Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG Thermo Fisher Scientific 11201D This can be used for anti-FLAG IP and anti-H3K4me3 IP
Anti-tri-methyl histone H3 (K4), mouse monoclonal antibody Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 301-34811 Any other antibody that works for ChIP analysis will work
10x Blocking Reagent Sigma-Aldrich 11096176001 For blocking during affinity purification
Denhardt’s solution Nacalai Tesque 10727-74 For blocking during affinity purification
Glycogen (5 mg/ml) Thermo Fisher Scientific AM9510 To purify DNA from lysate
Qubit 2.0 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q32866 For quantification of isolated DNA
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32851 For quantification of isolated DNA
0.5 mL tube Axygen 10011-830 For quantification by Qubit
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) Nacalai Tesque 25970-56 To purify DNA from lysate
AMPure XP beads Beckman Coulter A63881 SPRI magnetic beads for library preparation
Metal ice rack Funakoshi IR-1 To keep the cell lysate frozen
Sample Cooler New England Biolabs T7771S Helps fix cells with minimal damage
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2939BA To check the quality of isolated DNA fragments. Another fragment analyzer can be used.
Bioanalyzer 2100 Expert Software Agilent Technologies G2946CA Supplied with the Bioanalyzer
High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4626 To check the quality of the isolated DNA fragments
KAPA LTP Library Preparation Kit Roche 07961898001 Supplied with 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase, and PEG/NaCl solution
NEXTflex DNA Barcodes BIOO Scientific NOVA-514101 Adapter for library preparation. Supplied with DNA Barcode Adapters and Primer Mix.
KAPA Real-Time Library Amplification Kit Roche 07959028001 Supplied with 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix, and Fluorescent Standards
2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix Roche KM2602 For library preparation. Additionally, this enzyme may be required for the KAPA Real-Time Library Amplification Kit
Buffer EB Qiagen 19086 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 for elution of DNA
386-well qPCR plate Thermo Fisher Scientific 4309849 For real-time PCR
QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific 4485701 To quantify DNA
MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4311971 For real-time PCR
MicroAmp Clear Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4306311 For plate sealing
End-repair master mix Combine 1.4 µL of 10x KAPA End Repair Buffer, 1 µL of KAPA End Repair Enzyme Mix, and 1.6 µL of H2O
A-taling master mix Combine 1 µL of KAPA A-Tailing Buffer, 0.6 µL of KAPA A-Tailing Enzyme, and 8.4 µL of H2O
Ligation buffer mix Combine 2 µL of KAPA ligation buffer and 6 µL of H2O
Real-time PCR master mix Combine 5 µL of 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, 0.35 µL of PCR Primer Mix (10 µM each of forward primer AATGATACGGCGACCACCGAG and reverse primer CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), and 3.15 µL of H2O
PCR master mix Combine 10 µL of 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 µL of PCR Primer Mix, and 0.6 µL of H2O
Integrative Genomics Viewer Broad Institute IGV_2.3.88 Genome browser to visualize sequencing data
DNA olgionucleotide: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′ Eurofins Genomics A primer to amplify the promoter region of GAPDH
DNA olgionucleotide: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′ Eurofins Genomics A primer to amplify the promoter region of GAPDH
SYBR Premix Ex Taq Takara RR420L To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region
Thermal Cycler Dice Takara TP870 To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region

References

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Cite This Article
Mito, M., Kadota, M., Nakagawa, S., Iwasaki, S. TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling. J. Vis. Exp. (143), e58298, doi:10.3791/58298 (2019).

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