TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenom Profilierung

Summary

Wir beschreiben eine Schritt für Schritt Protokoll für Tandem Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung (tChIP-Seq), die es die Analyse der Zelle-typspezifischen genomweite Histon-Modifikation ermöglicht.

Abstract

Epigenetischen Regulation spielt zentrale Rolle in der Genexpression. Da Histon Änderungen in den 1960er Jahren entdeckt wurde, haben seine physiologischen und pathologischen Funktionen ausgiebig studiert. Das Aufkommen der Tiefe Sequenzierung der nächsten Generation und Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) über spezifische Histon Modifikation Antikörper hat in der Tat, unsere Sicht der epigenetischen Regulation über das Genom revolutioniert. Umgekehrt Gewebe bestehen typischerweise aus verschiedenen Zelltypen und ihre komplexe Mischung stellt analytische Herausforderungen an das Epigenom in einem bestimmten Zelltyp zu untersuchen. Um den Zellstatus typspezifische Chromatin in einer genomweiten Weise zu begegnen, haben wir vor kurzem entwickelt Tandem Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung (tChIP-Seq), basiert auf die selektive Reinigung von Chromatin von tagged Kern Histonproteine von Zelle Arten von Interesse, gefolgt von ChIP-seq. Das Ziel dieses Protokolls ist die Einführung von best Practices der tChIP-seq. Diese Technik bietet ein vielseitiges Werkzeug für gewebespezifischen Epigenom Untersuchung in verschiedenen Histon-Modifikationen und Modellorganismen.

Introduction

Gewebe von Tieren bestehen aus unterschiedlichen Zelltypen. Die Genregulation in jeder Zelle definiert die Zelltyp. Chromatin Modifikationen – DNA-Methylierung und Histon Modifikation – unterliegen die Zelltyp Spezifität der Genexpression. So, die Messung der epigenetischen Regulation in jeden Zelltyp wurde gewünscht, aber es war eine technische Herausforderung.

Um die Epigenetik in einem bestimmten Zelltyp zu untersuchen, war Tandem Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung (tChIP-Seq) neu entwickelte ()Abbildung 1()¹. In tChIP drückt sich Epitop-Tags Kern Histon Protein H2B aus einer Zelle-Typ-spezifischen Promotor. Dieses Feature ermöglicht die Isolierung des Chromatins aus den Zellen von Interesse, obwohl das Material aus einer Mischung von verschiedenen Zelltypen beginnt. Folgende ChIP-Seq-Chromatin Reinigung über einen geändert-Histon Mark und Tiefe Sequenzierung der nächsten Generation der isolierten DNA – wir können den epigenetischen Status des gezielten Zelltyps in einer genomweiten Weise überwachen.

Mit dieser Technik, untersuchten wir vor kurzem Neuron-spezifische Trimethylation von Histon H3-Proteins an Lysin 4 (H3K4me3) markiert. In dieser Studie entwickelten wir eine Knock-in-Maus in die C-unheilbar Flagge markiert H2B Protein bei der Cre-vermittelten Rekombination (Rosa26^{CAG Floxed-pA H2B-FLAG}) zum Ausdruck kam. Durch Kreuzung mit einer Maus besitzen das Cre-endoplasmic Reticulum (ER)-gen unter der Kontrolle des CamK2a-Promotors induziert der erhaltenen Mauslinie H2B-FLAG in aktiven Neuronen auf Tamoxifen Injektion (Camk2a^H2B-FLAG)¹. Das Gehirn der etablierten Mauslinie ab, führten wir tChIP-Seq mit Anti-H3K4me3 Antikörper. Da H3K4me3 Marken oft Förderer Regionen entsprechen, konnten wir Hunderte von mRNAs konkret ausgedrückt in Neuronen¹entdecken.

Hier beschreiben wir eine typische tChIP-Seq-Methode, die die Schritte vom Gewebe Dissektion bis Bibliotheksbau ()Abbildung 1() umfasst. Das Endziel dieses Protokolls ist, unsere best Practices für die Leistung der tChIP-Seq und die künftige Anwendung dieser Methode zu anderen Zelltypen und Histon-Modifikationen zu teilen.

Protocol

Alle hier beschriebene Methoden wurden von der Abteilung Sicherheit des RIKEN (H27-EP071) genehmigt und mit entsprechenden Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. (1) Gewebe Dissektion Sezieren das Gewebe von Interesse in kleine Stücke (ca. < 3 mm2) mit einer feinen Feder Schere.Hinweis: Größere Gewebefragmente länger zu frieren, und kleinere Stücke tragen über größere Mengen des Puffers, die die Ergebnisse beeinflussen können. Einen sauberen Beh…

Representative Results

Hier beschreiben wir Gewebe Dissektion, Fixierung, Zelle Lysis Tandem Reinigung von Chromatin und DNA-Bibliothek Vorbereitung für nächste Generation Sequenzer. Im Verlauf der Verfahren kann man die Qualität der DNA, testen, das ist der Schlüssel für erfolgreiche Sequenzierung in mehreren Schritten (Abbildung 2). Da ein einzelnes Nukleosom in der Regel 147 bp DNA 4 umgeben istsollte geschert DNA nicht kürzer als dieser Größe sei…

Discussion

Unser Protokoll wurde für die Nervenzellen des Mausgehirns optimiert, der Ausdruck der Flagge markiert H2B durch Tamoxifen Injektion induziert wird. Promotoren verwendet für H2B Ausdruck, Ausgangsstoffe Gewebe und die Menge des Gewebes sind entscheidende Parameter für erfolgreiche tChIP-seq. Die Optimierung dieser Faktoren sollte somit für jeden Zelltyp des Interesses betrachtet werden.

Ein entscheidender Schritt zu den Verfahren, die in diesem Protokoll verwendeten ist die DNA Scheren um …

Materials

Protein LoBind tube, 2 mL	Eppendorf	No. 0030108132	For cell lysis
Protein LoBind tube, 1.5 mL	Eppendorf	No. 0030108116	For ChIP and library preparation
DNA LoBind tube, 1.5 mL	Eppendorf	No. 0030108051	For ChIP and library preparation
8-strip PCR tube	BIO-BIK	3247-00	For ChIP and library preparation
SK Mill	TOKKEN	SK-200	Handy cryogenic grinder to make cell powder for fixation
Metal bullet	TOKKEN	SK-100-DLC10	Accessory of SK Mill
2 mL stainless steel tube	TOKKEN	TK-AM5-SUS	An option for cell lysis
2 mL stainless steel tube holder	TOKKEN	SK-100-TL	An option for cell lysis
16% formaldehyde (w/v), methanol-free	Pierce	28906	To fix cells. Prepare 1% solution before use.
Glycine	Nacalai Tesque	17109-35	Prepare 2.5 M stock
D-PBS (-)(1x)	Nacalai Tesque	14249-24	For washing lysate and purified DNA
HEPES	Nacalai Tesque	02443-05	For Lysis buffer 1. Prepare 1 M, pH 7.5 stock.
5 M NaCl, molecular biology grade	Nacalai Tesque	06900-14	For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer
0.5 M EDTA, molecular biology grade	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	311-90075	For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer
Glycerol	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	072-04945	For lysis buffer 1
NP-40	Nacalai Tesque	25223-75	For lysis buffer 1
Triton X-100, molecular biology grade	Nacalai Tesque	12967-32	For Lysis buffer 1
Tris	Nacalai Tesque	35406-91	For Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer. Prepare 1 M, pH 8.0 stock.
0.1 M EGTA pH neutral	Nacalai Tesque	08947-35	For Lysis Buffer 2
Protease inhibitor cocktail (100x)	Nacalai Tesque	25955-24	To block degradation of protein
RIPA buffer	Thermo Fisher Scientific	89900	For cell lysis and washing
milliTUBE 1 mL AFA Fiber	Covaris	520130	Sonicator tube. Accessory of Focused-ultrasonicator
Focused-ultrasonicator	Covaris	S220 or E220	To digest DNA into adequate size for ChIP-Seq
UltraPure 10% SDS	Thermo Fisher Scientific	15553-027	For ChIP Elution Buffer
RNase A	Nacalai Tesque	30141-14	To purify DNA from lysate
Proteinase K, recombinant, PCR Grade	Sigma-Aldrich	3115887001	To purify DNA from lysate
Ethanol	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	054-07225	Make 70% solution
Monoclonal anti-FLAG M2 antibody produced in mouse	Sigma-Aldrich	F1804	To purify chromatin expressed in cells of interest
Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	11201D	This can be used for anti-FLAG IP and anti-H3K4me3 IP
Anti-tri-methyl histone H3 (K4), mouse monoclonal antibody	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	301-34811	Any other antibody that works for ChIP analysis will work
10x Blocking Reagent	Sigma-Aldrich	11096176001	For blocking during affinity purification
Denhardt’s solution	Nacalai Tesque	10727-74	For blocking during affinity purification
Glycogen (5 mg/ml)	Thermo Fisher Scientific	AM9510	To purify DNA from lysate
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q32866	For quantification of isolated DNA
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	For quantification of isolated DNA
0.5 mL tube	Axygen	10011-830	For quantification by Qubit
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)	Nacalai Tesque	25970-56	To purify DNA from lysate
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881	SPRI magnetic beads for library preparation
Metal ice rack	Funakoshi	IR-1	To keep the cell lysate frozen
Sample Cooler	New England Biolabs	T7771S	Helps fix cells with minimal damage
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA	To check the quality of isolated DNA fragments. Another fragment analyzer can be used.
Bioanalyzer 2100 Expert Software	Agilent Technologies	G2946CA	Supplied with the Bioanalyzer
High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4626	To check the quality of the isolated DNA fragments
KAPA LTP Library Preparation Kit	Roche	07961898001	Supplied with 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase, and PEG/NaCl solution
NEXTflex DNA Barcodes	BIOO Scientific	NOVA-514101	Adapter for library preparation. Supplied with DNA Barcode Adapters and Primer Mix.
KAPA Real-Time Library Amplification Kit	Roche	07959028001	Supplied with 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix, and Fluorescent Standards
2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Roche	KM2602	For library preparation. Additionally, this enzyme may be required for the KAPA Real-Time Library Amplification Kit
Buffer EB	Qiagen	19086	10 mM Tris-Cl, pH 8.5 for elution of DNA
386-well qPCR plate	Thermo Fisher Scientific	4309849	For real-time PCR
QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	4485701	To quantify DNA
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	For real-time PCR
MicroAmp Clear Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4306311	For plate sealing
End-repair master mix			Combine 1.4 µL of 10x KAPA End Repair Buffer, 1 µL of KAPA End Repair Enzyme Mix, and 1.6 µL of H2O
A-taling master mix			Combine 1 µL of KAPA A-Tailing Buffer, 0.6 µL of KAPA A-Tailing Enzyme, and 8.4 µL of H2O
Ligation buffer mix			Combine 2 µL of KAPA ligation buffer and 6 µL of H2O
Real-time PCR master mix			Combine 5 µL of 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, 0.35 µL of PCR Primer Mix (10 µM each of forward primer AATGATACGGCGACCACCGAG and reverse primer CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), and 3.15 µL of H2O
PCR master mix			Combine 10 µL of 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 µL of PCR Primer Mix, and 0.6 µL of H2O
Integrative Genomics Viewer	Broad Institute	IGV_2.3.88	Genome browser to visualize sequencing data
DNA olgionucleotide: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′	Eurofins Genomics		A primer to amplify the promoter region of GAPDH
DNA olgionucleotide: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′	Eurofins Genomics		A primer to amplify the promoter region of GAPDH
SYBR Premix Ex Taq	Takara	RR420L	To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region
Thermal Cycler Dice	Takara	TP870	To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region