Descriviamo un protocollo passo-passo per la cromatina tandem immunoprecipitazione sequenziamento (tChIP-Seq) che permette l’analisi di modifica dell’istone di genoma di cellula-tipo-specifico.
Regolazione epigenetica svolge ruoli centrali nell’espressione genica. Dal momento che la modifica dell’istone è stato scoperto nel 1960, le sue funzioni fisiologiche e patologiche sono stati studiati estesamente. Infatti, l’avvento della nuova generazione sequenziamento profondo e immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) via gli anticorpi specifici istone modifica ha rivoluzionato il nostro punto di vista della regolazione epigenetica in tutto il genoma. Al contrario, tessuti in genere consistono di tipi cellulari diversi e loro miscela complessa pone sfide analitiche ad indagare l’epigenoma in un tipo di cella specifica. Per risolvere lo stato di tipo-specific cromatina delle cellule in un modo del genoma, recentemente abbiamo sviluppato il sequenziamento di immunoprecipitazione della cromatina tandem (tChIP-Seq), che è basato sulla purificazione selettiva della cromatina di proteine istoniche core contrassegnati dalla cella tipi di interesse, seguita da ChIP-seq. L’obiettivo del presente protocollo è l’introduzione delle migliori pratiche di tChIP-segg. Questa tecnica fornisce uno strumento versatile per epigenome tessuto-specifica indagine in modificazioni istoniche diversificata e organismi modello.
Tessuti di animali consistono di tipi cellulari diversi. La regolazione genica in ogni cella definisce il tipo di cella. Modificazioni della cromatina – modifica del DNA di metilazione e istone – sono alla base della specificità di cellula-tipo dell’espressione genica. Così, la misura della regolazione epigenetica in ciascun tipo di cella è stata voluta, ma è stato una sfida tecnica.
Per studiare l’epigenetica in un tipo di cellula particolare, sequenziamento di immunoprecipitazione della cromatina tandem (tChIP-Seq) è stato sviluppato di recente (Figura 1)1. In tChIP, proteina di nucleo epitopo-etichetta dell’istone H2B è espresso da un promotore di cellula-tipo-specifico. Questa funzione permette l’isolamento di cromatine dalle celle di interesse, anche se il materiale viene avviato da una miscela di vari tipi cellulari. Seguenti ChIP-Seq — purificazione della cromatina attraverso un contrassegno dell’istone per volta e generazione sequenziamento profondo del DNA isolato — possiamo monitorare lo stato epigenetico del tipo cellulare mirati in maniera genoma.
Usando questa tecnica, abbiamo recentemente studiato trimethylation di neurone-specific dell’istone H3 proteina a lisina 4 (H3K4me3) marchi. In quello studio, abbiamo sviluppato un topo knock-nel quale C-terminale Bandierina-etichettate H2B proteina è stata espressa su ricombinazione Cre-mediata (Rosa26CAG floxed-pA H2B-bandiera). Dall’incrocio con un mouse che possiedono il gene Cre-reticolo endoplasmatico endoplasmatico (ER) sotto il controllo del promotore CamK2a, la linea di topo ottenuti indotta H2B-bandiera in neuroni attivi su tamoxifen iniezione (Camk2aH2B-bandiera)1. A partire dal cervello della riga del mouse stabilito, abbiamo effettuato tChIP-Seq con anticorpo anti-H3K4me3. Poiché H3K4me3 marchi corrispondono spesso a regioni promotrici, potremmo scoprire centinaia di mRNAs specificamente espressi nei neuroni1.
Qui, descriviamo un metodo tipico tChIP-Seq che copre le misure da dissezione del tessuto per la costruzione della libreria (Figura 1). L’obiettivo finale di questo protocollo è quello di condividere le nostre best practice per le prestazioni di tChIP-Seq e la futura applicazione di questo metodo ad altri tipi di cellule e modificazioni istoniche.
Il nostro protocollo è stato ottimizzato per i neuroni del cervello del mouse, in cui l’espressione della bandierina-etichettate H2B è indotto tramite l’iniezione di tamoxifene. I promotori utilizzati per H2B espressione, materiali di base del tessuto e la quantità dei tessuti sono parametri chiave per successo tChIP-segg. Così, l’ottimizzazione di questi fattori da considerare per ogni tipo di cellula di interesse.
Un passaggio fondamentale tra le procedure utilizzate in questo protocollo…
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo tutti i membri del laboratorio Iwasaki per lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato supportato in parte da una sovvenzione per la ricerca scientifica in settori innovativi (n. 26113005 S.N. e JP17H05679 alla S.C.); una sovvenzione per giovani scienziati (A) (JP17H04998 per S.C.) dal Ministero della pubblica istruzione, scienza, sport e cultura del Giappone (MEXT); e la pionieristica progetti “Cellular Evolution” e tutte le RIKEN progetto “Malattia ed epigenoma” RIKEN (a S.N. e S.C.).
Protein LoBind tube, 2 mL | Eppendorf | No. 0030108132 | For cell lysis |
Protein LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | No. 0030108116 | For ChIP and library preparation |
DNA LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | No. 0030108051 | For ChIP and library preparation |
8-strip PCR tube | BIO-BIK | 3247-00 | For ChIP and library preparation |
SK Mill | TOKKEN | SK-200 | Handy cryogenic grinder to make cell powder for fixation |
Metal bullet | TOKKEN | SK-100-DLC10 | Accessory of SK Mill |
2 mL stainless steel tube | TOKKEN | TK-AM5-SUS | An option for cell lysis |
2 mL stainless steel tube holder | TOKKEN | SK-100-TL | An option for cell lysis |
16% formaldehyde (w/v), methanol-free | Pierce | 28906 | To fix cells. Prepare 1% solution before use. |
Glycine | Nacalai Tesque | 17109-35 | Prepare 2.5 M stock |
D-PBS (-)(1x) | Nacalai Tesque | 14249-24 | For washing lysate and purified DNA |
HEPES | Nacalai Tesque | 02443-05 | For Lysis buffer 1. Prepare 1 M, pH 7.5 stock. |
5 M NaCl, molecular biology grade | Nacalai Tesque | 06900-14 | For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer |
0.5 M EDTA, molecular biology grade | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 311-90075 | For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer |
Glycerol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 072-04945 | For lysis buffer 1 |
NP-40 | Nacalai Tesque | 25223-75 | For lysis buffer 1 |
Triton X-100, molecular biology grade | Nacalai Tesque | 12967-32 | For Lysis buffer 1 |
Tris | Nacalai Tesque | 35406-91 | For Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer. Prepare 1 M, pH 8.0 stock. |
0.1 M EGTA pH neutral | Nacalai Tesque | 08947-35 | For Lysis Buffer 2 |
Protease inhibitor cocktail (100x) | Nacalai Tesque | 25955-24 | To block degradation of protein |
RIPA buffer | Thermo Fisher Scientific | 89900 | For cell lysis and washing |
milliTUBE 1 mL AFA Fiber | Covaris | 520130 | Sonicator tube. Accessory of Focused-ultrasonicator |
Focused-ultrasonicator | Covaris | S220 or E220 | To digest DNA into adequate size for ChIP-Seq |
UltraPure 10% SDS | Thermo Fisher Scientific | 15553-027 | For ChIP Elution Buffer |
RNase A | Nacalai Tesque | 30141-14 | To purify DNA from lysate |
Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115887001 | To purify DNA from lysate |
Ethanol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 054-07225 | Make 70% solution |
Monoclonal anti-FLAG M2 antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | F1804 | To purify chromatin expressed in cells of interest |
Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | 11201D | This can be used for anti-FLAG IP and anti-H3K4me3 IP |
Anti-tri-methyl histone H3 (K4), mouse monoclonal antibody | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 301-34811 | Any other antibody that works for ChIP analysis will work |
10x Blocking Reagent | Sigma-Aldrich | 11096176001 | For blocking during affinity purification |
Denhardt’s solution | Nacalai Tesque | 10727-74 | For blocking during affinity purification |
Glycogen (5 mg/ml) | Thermo Fisher Scientific | AM9510 | To purify DNA from lysate |
Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | For quantification of isolated DNA |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | For quantification of isolated DNA |
0.5 mL tube | Axygen | 10011-830 | For quantification by Qubit |
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Nacalai Tesque | 25970-56 | To purify DNA from lysate |
AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | SPRI magnetic beads for library preparation |
Metal ice rack | Funakoshi | IR-1 | To keep the cell lysate frozen |
Sample Cooler | New England Biolabs | T7771S | Helps fix cells with minimal damage |
2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | To check the quality of isolated DNA fragments. Another fragment analyzer can be used. |
Bioanalyzer 2100 Expert Software | Agilent Technologies | G2946CA | Supplied with the Bioanalyzer |
High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | To check the quality of the isolated DNA fragments |
KAPA LTP Library Preparation Kit | Roche | 07961898001 | Supplied with 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase, and PEG/NaCl solution |
NEXTflex DNA Barcodes | BIOO Scientific | NOVA-514101 | Adapter for library preparation. Supplied with DNA Barcode Adapters and Primer Mix. |
KAPA Real-Time Library Amplification Kit | Roche | 07959028001 | Supplied with 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix, and Fluorescent Standards |
2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Roche | KM2602 | For library preparation. Additionally, this enzyme may be required for the KAPA Real-Time Library Amplification Kit |
Buffer EB | Qiagen | 19086 | 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 for elution of DNA |
386-well qPCR plate | Thermo Fisher Scientific | 4309849 | For real-time PCR |
QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4485701 | To quantify DNA |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | For real-time PCR |
MicroAmp Clear Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | For plate sealing |
End-repair master mix | Combine 1.4 µL of 10x KAPA End Repair Buffer, 1 µL of KAPA End Repair Enzyme Mix, and 1.6 µL of H2O | ||
A-taling master mix | Combine 1 µL of KAPA A-Tailing Buffer, 0.6 µL of KAPA A-Tailing Enzyme, and 8.4 µL of H2O | ||
Ligation buffer mix | Combine 2 µL of KAPA ligation buffer and 6 µL of H2O | ||
Real-time PCR master mix | Combine 5 µL of 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, 0.35 µL of PCR Primer Mix (10 µM each of forward primer AATGATACGGCGACCACCGAG and reverse primer CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), and 3.15 µL of H2O | ||
PCR master mix | Combine 10 µL of 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 µL of PCR Primer Mix, and 0.6 µL of H2O | ||
Integrative Genomics Viewer | Broad Institute | IGV_2.3.88 | Genome browser to visualize sequencing data |
DNA olgionucleotide: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′ | Eurofins Genomics | A primer to amplify the promoter region of GAPDH | |
DNA olgionucleotide: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′ | Eurofins Genomics | A primer to amplify the promoter region of GAPDH | |
SYBR Premix Ex Taq | Takara | RR420L | To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region |
Thermal Cycler Dice | Takara | TP870 | To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region |