TChIP-Seq: Профилирование конкретного типа ячейки Epigenome
Summary
Мы опишем пошаговое протокол для тандем хроматина иммунопреципитации последовательности (tChIP-Seq), который позволяет проводить анализ изменения определенного типа клеток геном wide гистонов.
Abstract
Эпигеномные регулирование играет центральную роль в экспрессии генов. Поскольку изменения гистона был обнаружен в 1960-х, его физиологических и патологических функции были широко изучены. Действительно появление глубоких секвенирование нового поколения и иммунопреципитации chromatin (чип) через конкретные гистона модификации антитела изменил наш взгляд эпигеномные регулирования через генома. И наоборот тканей, как правило, состоят из типов различных клеток, и их сложные смеси создает аналитические проблемы для расследования epigenome в конкретной ячейке тип. Для решения состояния конкретного типа хроматин клеток в геном всей манере, мы недавно разработали тандем хроматина иммунопреципитации последовательности (tChIP-Seq), которая основана на выборочной очистки хроматина тегами ядро гистоны из ячейки виды интересов, следуют чип-Seq. Целью настоящего Протокола является внедрение наилучшей практики tChIP-след Эта технология предоставляет универсальный инструмент для epigenome ткани конкретного расследования гистона различных модификаций и модельные организмы.
Introduction
Ткани животных состоят из клеток различных типов. Ген регулирование в каждой ячейке определяет тип ячейки. Chromatin изменения – ДНК метилирования и гистонов модификации – лежат в основе тип ячейки специфика экспрессии генов. Таким образом необходимости измерения эпигеномные регулирования в каждой ячейке тип, но это был технический вызов.
Расследовать эпигенетики в конкретной ячейке тип, секвенирование иммунопреципитации chromatin тандем (tChIP-Seq) был недавно разработанных ()Рисунок 1)1. В tChIP белка гистонов epitope тегами ядро H2B выражается от промоутера определенного типа клеток. Эта функция позволяет изоляции chromatins из клеток интерес, хотя материал начинается из смеси различных типов клеток. Следующие чип-Seq — хроматина очищение через изменение гистона Марк и глубокие секвенирование нового поколения изолированной ДНК — мы можем контролировать эпигеномные статус тип целевой ячейки в геном всей манере.
Используя эту технику, мы недавно исследовали нейрон конкретных trimethylation гистонов H3 белка на лизина 4 (H3K4me3) знаки. В этом исследовании мы разработали стук в мышь, в котором C-неизлечимо флаг тегами H2B белка была выражена при рекомбинации Cre опосредованной (Rosa26ЦАГ floxed ПА H2B-флаг). Путем скрещивания с помощью мыши, имеющих КРР эндоплазматического ретикулума (ER) гена под контролем промотора CamK2a, полученные мыши линии индуцированной H2B-флаг в активных нейронов на тамоксифен инъекций (Camk2aH2B-флаг)1. Начиная от мозга установленной мыши линии, мы провели tChIP-Seq с анти H3K4me3 антител. Так как H3K4me3 знаки часто соответствуют промоутер регионов, мы могли бы обнаружить сотни мРНК, конкретно выражена в нейроны1.
Здесь мы описываем метод типичный tChIP-Seq, который охватывает шаги от рассечение тканей для библиотеки строительных ()Рисунок 1). Конечная цель настоящего Протокола заключается в том, чтобы поделиться своим передовым опытом для выполнения tChIP-Seq и будущее применение этого метода в другие типы клеток и изменения гистона.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наш протокол был оптимизирован для нейронов мозга мыши, в котором выражение с тегами Флаг H2B индуцируется тамоксифен инъекции. Промоутеры, используемые для выражения H2B, исходных материалов ткани и количество тканей являются ключевой параметрами для успешной tChIP след Таким образом опт?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим всех членов Ивасаки лаборатории для критических чтении рукописи. Эта работа была частично поддерживается за счет целевых субсидий для научных исследований в инновационных областях (#26113005 с.н. и JP17H05679 с.и.); субсидий для молодых ученых () (JP17H04998 для с.и.) от министерства образования, науки, спорта и культуры Японии (МПКСНТ); и новаторские проекты всех RIKEN проект «Заболевания и Epigenome «от RIKEN (чтобы с.н. и с.и.) и «Сотовой эволюция».
Materials
| Protein LoBind tube, 2 mL | Eppendorf | No. 0030108132 | For cell lysis |
| Protein LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | No. 0030108116 | For ChIP and library preparation |
| DNA LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | No. 0030108051 | For ChIP and library preparation |
| 8-strip PCR tube | BIO-BIK | 3247-00 | For ChIP and library preparation |
| SK Mill | TOKKEN | SK-200 | Handy cryogenic grinder to make cell powder for fixation |
| Metal bullet | TOKKEN | SK-100-DLC10 | Accessory of SK Mill |
| 2 mL stainless steel tube | TOKKEN | TK-AM5-SUS | An option for cell lysis |
| 2 mL stainless steel tube holder | TOKKEN | SK-100-TL | An option for cell lysis |
| 16% formaldehyde (w/v), methanol-free | Pierce | 28906 | To fix cells. Prepare 1% solution before use. |
| Glycine | Nacalai Tesque | 17109-35 | Prepare 2.5 M stock |
| D-PBS (-)(1x) | Nacalai Tesque | 14249-24 | For washing lysate and purified DNA |
| HEPES | Nacalai Tesque | 02443-05 | For Lysis buffer 1. Prepare 1 M, pH 7.5 stock. |
| 5 M NaCl, molecular biology grade | Nacalai Tesque | 06900-14 | For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer |
| 0.5 M EDTA, molecular biology grade | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 311-90075 | For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer |
| Glycerol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 072-04945 | For lysis buffer 1 |
| NP-40 | Nacalai Tesque | 25223-75 | For lysis buffer 1 |
| Triton X-100, molecular biology grade | Nacalai Tesque | 12967-32 | For Lysis buffer 1 |
| Tris | Nacalai Tesque | 35406-91 | For Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer. Prepare 1 M, pH 8.0 stock. |
| 0.1 M EGTA pH neutral | Nacalai Tesque | 08947-35 | For Lysis Buffer 2 |
| Protease inhibitor cocktail (100x) | Nacalai Tesque | 25955-24 | To block degradation of protein |
| RIPA buffer | Thermo Fisher Scientific | 89900 | For cell lysis and washing |
| milliTUBE 1 mL AFA Fiber | Covaris | 520130 | Sonicator tube. Accessory of Focused-ultrasonicator |
| Focused-ultrasonicator | Covaris | S220 or E220 | To digest DNA into adequate size for ChIP-Seq |
| UltraPure 10% SDS | Thermo Fisher Scientific | 15553-027 | For ChIP Elution Buffer |
| RNase A | Nacalai Tesque | 30141-14 | To purify DNA from lysate |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115887001 | To purify DNA from lysate |
| Ethanol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 054-07225 | Make 70% solution |
| Monoclonal anti-FLAG M2 antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | F1804 | To purify chromatin expressed in cells of interest |
| Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | 11201D | This can be used for anti-FLAG IP and anti-H3K4me3 IP |
| Anti-tri-methyl histone H3 (K4), mouse monoclonal antibody | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 301-34811 | Any other antibody that works for ChIP analysis will work |
| 10x Blocking Reagent | Sigma-Aldrich | 11096176001 | For blocking during affinity purification |
| Denhardt’s solution | Nacalai Tesque | 10727-74 | For blocking during affinity purification |
| Glycogen (5 mg/ml) | Thermo Fisher Scientific | AM9510 | To purify DNA from lysate |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | For quantification of isolated DNA |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | For quantification of isolated DNA |
| 0.5 mL tube | Axygen | 10011-830 | For quantification by Qubit |
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Nacalai Tesque | 25970-56 | To purify DNA from lysate |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | SPRI magnetic beads for library preparation |
| Metal ice rack | Funakoshi | IR-1 | To keep the cell lysate frozen |
| Sample Cooler | New England Biolabs | T7771S | Helps fix cells with minimal damage |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | To check the quality of isolated DNA fragments. Another fragment analyzer can be used. |
| Bioanalyzer 2100 Expert Software | Agilent Technologies | G2946CA | Supplied with the Bioanalyzer |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | To check the quality of the isolated DNA fragments |
| KAPA LTP Library Preparation Kit | Roche | 07961898001 | Supplied with 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase, and PEG/NaCl solution |
| NEXTflex DNA Barcodes | BIOO Scientific | NOVA-514101 | Adapter for library preparation. Supplied with DNA Barcode Adapters and Primer Mix. |
| KAPA Real-Time Library Amplification Kit | Roche | 07959028001 | Supplied with 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix, and Fluorescent Standards |
| 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Roche | KM2602 | For library preparation. Additionally, this enzyme may be required for the KAPA Real-Time Library Amplification Kit |
| Buffer EB | Qiagen | 19086 | 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 for elution of DNA |
| 386-well qPCR plate | Thermo Fisher Scientific | 4309849 | For real-time PCR |
| QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4485701 | To quantify DNA |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | For real-time PCR |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | For plate sealing |
| End-repair master mix | Combine 1.4 µL of 10x KAPA End Repair Buffer, 1 µL of KAPA End Repair Enzyme Mix, and 1.6 µL of H2O | ||
| A-taling master mix | Combine 1 µL of KAPA A-Tailing Buffer, 0.6 µL of KAPA A-Tailing Enzyme, and 8.4 µL of H2O | ||
| Ligation buffer mix | Combine 2 µL of KAPA ligation buffer and 6 µL of H2O | ||
| Real-time PCR master mix | Combine 5 µL of 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, 0.35 µL of PCR Primer Mix (10 µM each of forward primer AATGATACGGCGACCACCGAG and reverse primer CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), and 3.15 µL of H2O | ||
| PCR master mix | Combine 10 µL of 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 µL of PCR Primer Mix, and 0.6 µL of H2O | ||
| Integrative Genomics Viewer | Broad Institute | IGV_2.3.88 | Genome browser to visualize sequencing data |
| DNA olgionucleotide: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′ | Eurofins Genomics | A primer to amplify the promoter region of GAPDH | |
| DNA olgionucleotide: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′ | Eurofins Genomics | A primer to amplify the promoter region of GAPDH | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara | RR420L | To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region |
| Thermal Cycler Dice | Takara | TP870 | To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region |
References
- Mito, M., et al. Cell type-specific survey of epigenetic modifications by tandem chromatin immunoprecipitation sequencing. Scientific Reports. 8 (1), 1143 (2018).
- Kadota, M., et al. CTCF binding landscape in jawless fish with reference to Hox cluster evolution. Scientific Reports. 7 (1), 4957 (2017).
- Jung, Y. L., et al. Impact of sequencing depth in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Research. 42 (9), (2014).
- Becker, P. B., Workman, J. L. Nucleosome remodeling and epigenetics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), a017905 (2013).
- Kidder, B. L., Zhao, K. Efficient library preparation for next-generation sequencing analysis of genome-wide epigenetic and transcriptional landscapes in embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. , 3-20 (2014).
- Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645 (2012).
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Hornstein, N., et al. Ligation-free ribosome profiling of cell type-specific translation in the brain. Genome Biology. 17 (1), 149 (2016).
- Zhao, Y., Garcia, B. A. Comprehensive catalog of currently documented histone modifications. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), a025064 (2015).
- Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).
