כאן, אנו מציגים עבור פרוטוקול סינתזה ואפיון של חלקיקי תחמוצת צריום (nanoceria) עבור ROS (מינים חמצן תגובתי) ניקוי ויוו, nanoceria הדמיה ברקמות הצמח על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית, אין ויוו ניטור של nanoceria ROS ניקוי על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית.
הצטברות (ROS) מינים חמצן תגובתי מהווה סימן היכר של תגובת המתח והאביוטיים הצמח. ROS לשחק תפקיד כפול צמחים על-ידי מתנהג כמו מולקולות ברמות נמוכות איתות ופגיעה מולקולות ברמה גבוהה. הצטברות של ROS בצמחים לחוץ עלולה לגרום נזק מטבוליטים, אנזימים, ליפידים ו DNA, גרימת הפחתה של צימוח ועם תשואה. היכולת של חלקיקי תחמוצת צריום (nanoceria) catalytically ניקוי ROS ויוו מספקת כלי ייחודי כדי להבין bioengineer צמחים לעקת. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול לסנתז לאפיין פוליפוני (אקרילי) חומצה nanoceria מצופה (PNC), ממשק חלקיקים עם צמחים באמצעות חדירה פרופריה עלה ושל לפקח על ההפצה שלהם, ROS ניקוי ויוו באמצעות קונפוקלי מיקרוסקופ. הנוכחי מולקולרית כלים לטיפול ROS הצטברות בצמחים מוגבלות לדגם מינים ודורשים שיטות טרנספורמציה מפרך. פרוטוקול זה עבור ויוו ROS ניקוי יש פוטנציאל שיוחל פראי סוג צמחים עם עלים רחבים ומבנה העלה כמו תודרנית לבנה.
חלקיקי תחמוצת צריום (nanoceria) נמצאים בשימוש נרחב אורגניזמים חיים, ממחקר בסיסי בביו-הנדסה, עקב שלהם מינים חמצן תגובתי קטליטי ברורים (ROS) ניקוי יכולת1,2,3. Nanoceria יש ROS ניקוי יכולות עקב מספר רב של משרות פנויות חמצן משטח זה לסירוגין שני חמצון הברית (Ce3 + ,4 +לסה נ.) 4,5,6. לסה נ3 + משתלשלות איגרות חוב ניקוי יעיל ROS בעוד זנים סריג ב הננומטרי רגנרציה של אתרים אלה פגם באמצעות רכיבה על אופניים תגובות7חמצון-חיזור. Nanoceria גם שימשו לאחרונה ללמוד ולשתול הנדסה פונקציה8,9. צמחים תחת לחץ והאביוטיים חווים הצטברות של ROS, גרימת נזק חמצוני שומנים, חלבונים ו DNA10. בצמחים לבנה א , ניקוי קטליטי nanoceria של ROS ויוו מוביל צמח משופרת פוטוסינתזה תחת אור גבוהה, חום ומדגיש מצמררת8. Nanoceria החלה קרקע גם עליות לירות תשואה ביומסה של דגנים של חיטה (חיטת הלחם)11; שמן קנולה (כרוב napus) הצמחים שטופלו nanoceria יש ביומסה צמח גבוה יותר תחת לחץ מלח12.
Nanoceria מציעים למלחמה ולשתול ביולוגים כלי מבוסס-ננו-טכנולוגיה כדי להבין תגובות הלחץ והאביוטיים ולשפר צמחים לעקת יובש. ויוו ROS הניקוי יכולות של Nanoceria עצמאיות של מיני צמחים, המשלוח נתיישב לרקמות הצמח יש הפוטנציאל לאפשר יישום רחב מחוץ דגם אורגניזמים. בניגוד לשיטות אחרות מבוססות מבחינה גנטית, nanoceria אינם מחייבים יצירת קווים צמח עם ביטוי של אנזימים נוגדי חמצון עבור ROS גבוהה ניקוי יכולת13. עלה פרופריה חדירה של nanoceria צמחים היא גישה מעשית במעבדה מבוסס מחקר.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לתאר סינתזה 1) אפיון טעונים שלילית פוליפוני (אקרילי) חומצה nanoceria (PNC), 2) משלוח ואת המעקב של PNC בכל רחבי עלים תאים ולאחר 3) הפיקוח על התומכים ב- PNC ROS הניקוי ב ויוו. ב פרוטוקול זה, פוליפוני טעונים שלילית (אקרילי) חומצה nanoceria (PNC) מסונתז, המאופיינת שלהם ספקטרום הבליעה, קוטר hydrodynamic, פוטנציאל זטה. אנו מתארים שיטה הסתננות פרופריה עלה פשוטה כדי לספק PNC לתוך הצמח רקמות עלים. עבור ויוו הדמיה של ננו-חלקיק הפצה בתוך תאי mesophyll, צבע פלורסנט (DiI) שימש תווית PNC (DiI-PNC) ולצפות על חלקיקים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי זריחה. לבסוף, נסביר כיצד לפקח ויוו PNC ROS ניקוי באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
ב פרוטוקול זה, אנו מתארים PNC סינתזה אפיון, תיוג הפלורסנט, הדמיה קונאפוקלית של חלקיקים בתוך תאי צמחים mesophyll שהפגינו ויוו ROS הניקוי הפעילות שלהם. PNC הם מסונתז מתערובת של חנקת צריום והפתרון במספר דוכנים של אמוניה מימית. PNC מאופיינים spectrophotomery קליטה וריכוז באמצעות החוק באר-Lamberts. מדידות פוטנצ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת קליפורניה, ריברסייד, משרד החקלאות המכון הלאומי של מזון וחקלאות, פתח פרוייקט 1009710 J.P.G. חומר זה מתבסס על עבודה הנתמכים על ידי הקרן הלאומית למדע תחת גרנט 1817363 מס על J.P.G.
Cerium (III) nitrate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 238538-100G | |
Molecular Biology Grade Water, Corning | VWR | 45001-044 | |
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | VWR | 14-959-49A | |
Poly (acrylic acid) 1,800 Mw | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
Fisherbrand Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessory, Insert Retainer | Fisher Scientific | 02-215-391 | |
Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessories: Foam Insert Set | Fisher Scientific | 02-215-395 | |
Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 05002-1L | |
PYREX Griffin Beakers, Graduated, Corning | VWR | 13912-149 | |
RCT basic | IKA | 3810001 | |
Eppendorf Microcentrifuge 5424 | VWR | 80094-126 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Millipore-Sigma | UFC901024 | |
Allegra X-30 Series Benchtop Centrifuge | Beckman Coulter | B06314 | |
UV-2600 Sptecrophotometer | Shimadzu | UV-2600 120V | |
Whatman Anotop 10 syringe filter | Sigma-Aldrich | WHA68091102 | |
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
Zetasizer Nano S | Malvern Panalytical | Zen 1600 | |
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma-Aldrich | 42364-100MG | |
Dimethyl Sulfoxide, ACS | VWR | BDH1115-1LP | |
Sunshine Mix #1 LC1 | Green Island Distributors, Inc | 5212601.CFL080P | |
Adaptis 1000 | Conviron | A1000 | |
TES, >99% (titration | Sigma-Aldrich | T1375-100G | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
Air-Tite All-Plastic Norm-Ject Syringe | Fisher Scientific | 14-817-25 | |
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
Carolina Observation Gel | Carolina | 132700 | |
Corning microscope slides, frosted one side, one end | Sigma-Aldrich | CLS294875X25-72EA | |
Cork Borer Sets with Handles | Fisher Scientific | S50166A | |
Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | P9900-25G | |
Micro Cover Glasses, Square, No. 1 | VWR | 48366-045 | |
Leica Laser Scanning Confocal Microscope TCS SP5 | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D6883-250MG | |
Dihydroethidium | Sigma-Aldrich | D7008-10MG | |
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Eppendorf Uvette cuvettes | Sigma-Aldrich | Z605050-80EA | |
Chlorophyll meter | Konica Minolta | SPAD-502 |