식물 반응 산소 종에서 Vivo에서 음이온 세 륨 산화물 나노 입자의 촉매 청소
Summary
여기, 선물이 vivo에서confocal 현미경 검사 법, 그리고 비보에 의해 식물 조직에서 이미징 nanoceria 청소 합성 및 선생님 (반응성 산소 종)에 대 한 세 륨 산화물 나노 입자 (nanoceria)의 특성에 대 한 프로토콜 nanoceria 선생님 confocal 현미경 검사 법에 의해 청소의 모니터링.
Abstract
반응성 산소 종 (ROS) 축적 식물 abiotic 스트레스 반응의 특징 이다. 선생님 신호 수준 낮은 분자 및 높은 수준에서 분자를 손상 하 여 식물에는 이중 역할을 재생 합니다. 스트레스 식물에 선생님의 축적 대사, 효소, 지질, 및 식물 성장과 수확량의 감소를 일으키는 원인이 되는 DNA 손상 수 있습니다. 세 륨 산화물 나노 입자 (nanoceria)의 능력을 촉매로 선생님에서 vivo에서 청소는 독특한 도구 이해를 bioengineer 공장 abiotic 스트레스 관용을 제공 합니다. 여기, 선물이 합성 및 폴 리 (아크릴) 산 성 코팅된 nanoceria (PNC) 특성화, 식물 잎 lamina 침투를 통해 나노 인터페이스 및 그들의 분포와 선생님에서 vivo에서 confocal 사용 하 여 청소 하는 프로토콜 현미경 검사 법입니다. 식물에 선생님 축적을 조작 하기 위한 현재 분자 도구 모델 종으로 제한 하 고 힘 드는 변환 방법이 필요로. Vivo에서 선생님 청소에 대 한이 프로토콜 애기 thaliana같은 잎 구조와 넓은 잎 야생 타입 식물에 적용 될 가능성이 있다.
Introduction
세 륨 산화물 나노 입자 (nanoceria) 생물 공학 능력1,,23청소의 독특한 촉매 반응성 산소 종 (선생님) 때문에 기초 연구에서 널리 사용 됩니다. Nanoceria는 두 산화 상태 (Ce3 + 및 Ce4 +) 4,,56사이 대체 표면 산소 공석의 큰 숫자 때문에 능력을 청소 하는 선생님. Ce3 + 매달려 유대는 nanoscale에 격자 긴장 redox 반응7자전거를 통해 이러한 결함 사이트의 재생을 촉진 하는 동안 선생님을 효과적으로 청소. Nanoceria는 또한 최근 사용 되었습니다 공부 하 고 엔지니어링 공장 기능8,9. Abiotic 스트레스 식물 선생님, 지질, 단백질 및 DNA10산화 손상의 축적 경험. A. thaliana 식물, 높은 빛, 열, 및 재미 스트레스8에서 향상 된 식물 광합성에 리드 nanoceria 촉매 vivo에서 선생님의 청소. 토양도 밀 (Triticum aestivum)11;의 증가 촬영 바이오 매스 및 곡물 수율 적용 nanoceria nanoceria로 치료 하는 canola (브라 시카 napus) 식물 소금 스트레스12에서 더 높은 식물 바이오 매스에 있다.
Nanoceria는 bioengineers를 제공 하 고 식물 생물학 abiotic 스트레스 응답을 이해 하 고 식물 abiotic 스트레스 내성을 강화 하는 나노기술 기반 도구. 선생님 청소 기능 vivo에서 Nanoceria의 식물 종의 독립적인 있으며 식물 조직에 손쉬운 배달 모형 유기 체 이상으로 광범위 한 응용 프로그램을 사용 하도록 가능성이 있다. 다른 유전자 기반 메서드와 달리 nanoceria 청소 능력13높은 선생님에 대 한 항 산화 효소의 overexpression 공장 라인을 생성 필요 하지 않습니다. Nanoceria 식물의 잎 lamina 침투 연구소 기반 연구에 대 한 실용적인 접근 방법입니다.
이 프로토콜의 전체 목표 1) 합성 부정 청구 폴 리 (아크릴) 산 nanoceria (PNC)의 특성화, 2) 납품 및 리프 셀에 걸쳐 PNC의 추적 및 3)의 모니터링 PNC 기반 선생님 청소 에서 설명 하는 vivo. 이 프로토콜에서 부정 청구 폴 리 (아크릴) 산 nanoceria (PNC)는 합성 하 고 그들의 흡수 스펙트럼, 유체역학 직경, 및 잠재적인 제타 특징. 식물으로 잎 조직 PNC를 제공 하는 간단한 잎 lamina 침투 방법을 설명 합니다. 이미징에 대 한 vivo에서 mesophyll 셀 내에서 나노 분산의, 형광 염료 (DiI) 레이블을 PNC (DiI-PNC)과 공초점 형광 현미경 검사 법을 통해 나노 입자 관찰에 사용 되었다. 마지막으로, 우리는 vivo에서 confocal 현미경 검사 법을 통해 PNC 선생님 청소 모니터링 하는 방법을 설명 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에 우리 PNC 합성, 특성, 형광 염료 라벨, 및 그들의 비보에 선생님 청소 활동을 전시 식물 mesophyll 세포 내에서 나노 입자의 confocal 영상 설명 합니다. PNC는 세 륨 질산염 및 PAA 솔루션에서 수산화 암모늄의 혼합물에서 합성 됩니다. PNC 흡수 spectrophotomery와 맥주 Lamberts 법을 사용 하 여 결정 하는 농도 의해 특징. 제타 잠재적인 측정 엽록체8납품을 강화 하기 위한 PN…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 캘리포니아 대학, 리버 사이드와 미국 농 무부 식품 및 농업, 해치 프로젝트 1009710 J.P.G.에 의해 지원 되었다 이 자료는 J.P.G.에 보조금 번호 1817363에서 국립 과학 재단에서 지 원하는 작업 기반
Materials
| Cerium (III) nitrate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 238538-100G | |
| Molecular Biology Grade Water, Corning | VWR | 45001-044 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | VWR | 14-959-49A | |
| Poly (acrylic acid) 1,800 Mw | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessory, Insert Retainer | Fisher Scientific | 02-215-391 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessories: Foam Insert Set | Fisher Scientific | 02-215-395 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 05002-1L | |
| PYREX Griffin Beakers, Graduated, Corning | VWR | 13912-149 | |
| RCT basic | IKA | 3810001 | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5424 | VWR | 80094-126 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Millipore-Sigma | UFC901024 | |
| Allegra X-30 Series Benchtop Centrifuge | Beckman Coulter | B06314 | |
| UV-2600 Sptecrophotometer | Shimadzu | UV-2600 120V | |
| Whatman Anotop 10 syringe filter | Sigma-Aldrich | WHA68091102 | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Zetasizer Nano S | Malvern Panalytical | Zen 1600 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma-Aldrich | 42364-100MG | |
| Dimethyl Sulfoxide, ACS | VWR | BDH1115-1LP | |
| Sunshine Mix #1 LC1 | Green Island Distributors, Inc | 5212601.CFL080P | |
| Adaptis 1000 | Conviron | A1000 | |
| TES, >99% (titration | Sigma-Aldrich | T1375-100G | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Air-Tite All-Plastic Norm-Ject Syringe | Fisher Scientific | 14-817-25 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Carolina Observation Gel | Carolina | 132700 | |
| Corning microscope slides, frosted one side, one end | Sigma-Aldrich | CLS294875X25-72EA | |
| Cork Borer Sets with Handles | Fisher Scientific | S50166A | |
| Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | P9900-25G | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1 | VWR | 48366-045 | |
| Leica Laser Scanning Confocal Microscope TCS SP5 | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D6883-250MG | |
| Dihydroethidium | Sigma-Aldrich | D7008-10MG | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Eppendorf Uvette cuvettes | Sigma-Aldrich | Z605050-80EA | |
| Chlorophyll meter | Konica Minolta | SPAD-502 |
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