Summary

식물 반응 산소 종에서 Vivo에서 음이온 세 륨 산화물 나노 입자의 촉매 청소

Published: August 26, 2018
doi:

Summary

여기, 선물이 vivo에서confocal 현미경 검사 법, 그리고 비보에 의해 식물 조직에서 이미징 nanoceria 청소 합성 및 선생님 (반응성 산소 종)에 대 한 세 륨 산화물 나노 입자 (nanoceria)의 특성에 대 한 프로토콜 nanoceria 선생님 confocal 현미경 검사 법에 의해 청소의 모니터링.

Abstract

반응성 산소 종 (ROS) 축적 식물 abiotic 스트레스 반응의 특징 이다. 선생님 신호 수준 낮은 분자 및 높은 수준에서 분자를 손상 하 여 식물에는 이중 역할을 재생 합니다. 스트레스 식물에 선생님의 축적 대사, 효소, 지질, 및 식물 성장과 수확량의 감소를 일으키는 원인이 되는 DNA 손상 수 있습니다. 세 륨 산화물 나노 입자 (nanoceria)의 능력을 촉매로 선생님에서 vivo에서 청소는 독특한 도구 이해를 bioengineer 공장 abiotic 스트레스 관용을 제공 합니다. 여기, 선물이 합성 및 폴 리 (아크릴) 산 성 코팅된 nanoceria (PNC) 특성화, 식물 잎 lamina 침투를 통해 나노 인터페이스 및 그들의 분포와 선생님에서 vivo에서 confocal 사용 하 여 청소 하는 프로토콜 현미경 검사 법입니다. 식물에 선생님 축적을 조작 하기 위한 현재 분자 도구 모델 종으로 제한 하 고 힘 드는 변환 방법이 필요로. Vivo에서 선생님 청소에 대 한이 프로토콜 애기 thaliana같은 잎 구조와 넓은 잎 야생 타입 식물에 적용 될 가능성이 있다.

Introduction

세 륨 산화물 나노 입자 (nanoceria) 생물 공학 능력1,,23청소의 독특한 촉매 반응성 산소 종 (선생님) 때문에 기초 연구에서 널리 사용 됩니다. Nanoceria는 두 산화 상태 (Ce3 + 및 Ce4 +) 4,,56사이 대체 표면 산소 공석의 큰 숫자 때문에 능력을 청소 하는 선생님. Ce3 + 매달려 유대는 nanoscale에 격자 긴장 redox 반응7자전거를 통해 이러한 결함 사이트의 재생을 촉진 하는 동안 선생님을 효과적으로 청소. Nanoceria는 또한 최근 사용 되었습니다 공부 하 고 엔지니어링 공장 기능8,9. Abiotic 스트레스 식물 선생님, 지질, 단백질 및 DNA10산화 손상의 축적 경험. A. thaliana 식물, 높은 빛, 열, 및 재미 스트레스8에서 향상 된 식물 광합성에 리드 nanoceria 촉매 vivo에서 선생님의 청소. 토양도 밀 (Triticum aestivum)11;의 증가 촬영 바이오 매스 및 곡물 수율 적용 nanoceria nanoceria로 치료 하는 canola (브라 시카 napus) 식물 소금 스트레스12에서 더 높은 식물 바이오 매스에 있다.

Nanoceria는 bioengineers를 제공 하 고 식물 생물학 abiotic 스트레스 응답을 이해 하 고 식물 abiotic 스트레스 내성을 강화 하는 나노기술 기반 도구. 선생님 청소 기능 vivo에서 Nanoceria의 식물 종의 독립적인 있으며 식물 조직에 손쉬운 배달 모형 유기 체 이상으로 광범위 한 응용 프로그램을 사용 하도록 가능성이 있다. 다른 유전자 기반 메서드와 달리 nanoceria 청소 능력13높은 선생님에 대 한 항 산화 효소의 overexpression 공장 라인을 생성 필요 하지 않습니다. Nanoceria 식물의 잎 lamina 침투 연구소 기반 연구에 대 한 실용적인 접근 방법입니다.

이 프로토콜의 전체 목표 1) 합성 부정 청구 폴 리 (아크릴) 산 nanoceria (PNC)의 특성화, 2) 납품 및 리프 셀에 걸쳐 PNC의 추적 및 3)의 모니터링 PNC 기반 선생님 청소 에서 설명 하는 vivo. 이 프로토콜에서 부정 청구 폴 리 (아크릴) 산 nanoceria (PNC)는 합성 하 고 그들의 흡수 스펙트럼, 유체역학 직경, 및 잠재적인 제타 특징. 식물으로 잎 조직 PNC를 제공 하는 간단한 잎 lamina 침투 방법을 설명 합니다. 이미징에 대 한 vivo에서 mesophyll 셀 내에서 나노 분산의, 형광 염료 (DiI) 레이블을 PNC (DiI-PNC)과 공초점 형광 현미경 검사 법을 통해 나노 입자 관찰에 사용 되었다. 마지막으로, 우리는 vivo에서 confocal 현미경 검사 법을 통해 PNC 선생님 청소 모니터링 하는 방법을 설명 합니다.

Protocol

1. A. thaliana 식물 성장 5 cm x 5 cm 일회용 냄비에 뿌리 다 A. thaliana 씨앗 표준 토양 혼합 가득. 32 이러한 냄비의 물으로 채워진 플라스틱 쟁반에 넣어 (~ 0.5 c m 깊이)는 식물을 가진 플라스틱 트레이 식물 성장 챔버로 전송. 다음과 같이 성장 챔버 설정을 설정: 200 µ / ms 광합성 활성 방사선 (파), 24 ± 1 ° C 일 및 21 ± 1 ° C 밤, 습도 60%, 및 14/10 h 주/야간 라이트 정권, 각각. </…

Representative Results

PNC 합성 및 특성 .PNC 종합 되었다 하 고 정화 방법을 프로토콜 섹션 2에서 설명 하는 다음 특징. 그림 1 A 세 륨 질산염, PAA, 세 륨 질산염 및 PAA, PNC의 혼합물의 솔루션의 채색을 보여 줍니다. PNC 합성 후 흰색에서 밝은 노란색 색상 변화를 볼 수 있다. 10 kDa 필터 정화, 후 피츠버그 대 일 분 광 광도와 특징 …

Discussion

이 프로토콜에 우리 PNC 합성, 특성, 형광 염료 라벨, 및 그들의 비보에 선생님 청소 활동을 전시 식물 mesophyll 세포 내에서 나노 입자의 confocal 영상 설명 합니다. PNC는 세 륨 질산염 및 PAA 솔루션에서 수산화 암모늄의 혼합물에서 합성 됩니다. PNC 흡수 spectrophotomery와 맥주 Lamberts 법을 사용 하 여 결정 하는 농도 의해 특징. 제타 잠재적인 측정 엽록체8납품을 강화 하기 위한 PN…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 캘리포니아 대학, 리버 사이드와 미국 농 무부 식품 및 농업, 해치 프로젝트 1009710 J.P.G.에 의해 지원 되었다 이 자료는 J.P.G.에 보조금 번호 1817363에서 국립 과학 재단에서 지 원하는 작업 기반

Materials

Cerium (III) nitrate hexahydrate Sigma-Aldrich 238538-100G
Molecular Biology Grade Water, Corning VWR 45001-044 
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes VWR 14-959-49A
Poly (acrylic acid) 1,800 Mw Sigma-Aldrich 323667-100G
Fisherbrand Digital Vortex Mixer Fisher Scientific 02-215-370
Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessory, Insert Retainer Fisher Scientific 02-215-391
Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessories: Foam Insert Set Fisher Scientific 02-215-395
Ammonium hydroxide solution Sigma-Aldrich 05002-1L
PYREX Griffin Beakers, Graduated, Corning VWR 13912-149 
RCT basic IKA 3810001
Eppendorf Microcentrifuge 5424 VWR 80094-126
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units Millipore-Sigma UFC901024
Allegra X-30 Series Benchtop Centrifuge Beckman Coulter B06314
UV-2600 Sptecrophotometer Shimadzu UV-2600 120V
Whatman Anotop 10 syringe filter Sigma-Aldrich WHA68091102
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips Fisher Scientific 14-829-45
Zetasizer Nano S Malvern Panalytical Zen 1600
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate Sigma-Aldrich 42364-100MG
Dimethyl Sulfoxide, ACS VWR BDH1115-1LP
Sunshine Mix #1 LC1 Green Island Distributors, Inc 5212601.CFL080P
Adaptis 1000 Conviron A1000
TES, >99% (titration Sigma-Aldrich T1375-100G
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266-1KG
Air-Tite All-Plastic Norm-Ject Syringe Fisher Scientific 14-817-25
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers Fisher Scientific 06-666A
Carolina Observation Gel Carolina 132700
Corning microscope slides, frosted one side, one end Sigma-Aldrich CLS294875X25-72EA
Cork Borer Sets with Handles Fisher Scientific S50166A
Perfluorodecalin Sigma-Aldrich P9900-25G
Micro Cover Glasses, Square, No. 1 VWR 48366-045
Leica Laser Scanning Confocal Microscope TCS SP5 Leica Microsystems TCS SP5
2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate Sigma-Aldrich D6883-250MG
Dihydroethidium Sigma-Aldrich D7008-10MG
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL Fisher Scientific 05-408-129
Eppendorf Uvette cuvettes Sigma-Aldrich Z605050-80EA
Chlorophyll meter  Konica Minolta SPAD-502

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Newkirk, G. M., Wu, H., Santana, I., Giraldo, J. P. Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles. J. Vis. Exp. (138), e58373, doi:10.3791/58373 (2018).

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