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Biochemistry

आनुवंशिक संश्लेषित एल-dihydroxyphenylalanine (डोपा) और प्रोटीन के लिए अपने आवेदन विकार

Published: August 24, 2018 doi: 10.3791/58383
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry, Sogang University

Summary

यहां, हम एल के आनुवंशिक शामिल करने के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान dihydroxyphenylalanine सरल प्रारंभिक सामग्री और प्रोटीन विकार के लिए अपने आवेदन से संश्लेषित ।

Abstract

L-dihydroxyphenylalanine (डोपा) एक एमिनो एसिड पशुओं और पौधों में catecholamines के संश्लेषण में पाया जाता है । अपने विशेष जैव रासायनिक गुणों की वजह से, एमिनो एसिड जैव रासायनिक अनुप्रयोगों में कई का उपयोग करता है । इस रिपोर्ट में प्रोटीन विकार के लिए एक संश्लेषित डोपा और उसके आवेदन के जेनेटिक शामिल करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है । डोपा एक tyrosine phenol द्वारा संश्लेषित है-lyase (TPL) से catechol, पाइरूवेट, और अमोनिया, और एमिनो एसिड सीधे प्रोटीन में आनुवंशिक निगमन विधि द्वारा एक विकसित aminoacyl-tRNA और aminoacyl-tRNA synthetase जोड़ी का उपयोग कर शामिल है । यह प्रत्यक्ष निगमन प्रणाली कुशलतापूर्वक अंय प्राकृतिक अमीनो एसिड के थोड़ा निगमन और डोपा के लिए पिछले आनुवंशिक निगमन प्रणाली की तुलना में बेहतर प्रोटीन उपज के साथ डोपा शामिल हैं । प्रोटीन विकार डोपा युक्त प्रोटीन के साथ कुशल और साइट विशिष्ट है और विभिंन अनुप्रयोगों के लिए अपनी उपयोगिता से पता चलता है । इस प्रोटोकॉल के लिए वांछित साइटों पर डोपा युक्त उत्परिवर्ती प्रोटीन के कुशल और औद्योगिक और दवा अनुप्रयोगों के लिए उनके विकार में शामिल करने के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं के साथ प्रोटीन वैज्ञानिकों प्रदान करता है ।

Introduction

डोपा एक एमिनो पशुओं और पौधों में catecholamines के संश्लेषण में शामिल एसिड है । इस एमिनो एसिड tyrosine hydroxylase और आणविक ऑक्सीजन (ओ2)1द्वारा Tyr से संश्लेषित है । क्योंकि डोपा डोपामाइन का एक अग्रदूत है और रक्त मस्तिष्क बाधा रिस सकता है, यह पार्किंसंस रोग2के उपचार में इस्तेमाल किया गया है । डोपा भी कौड़ी आसंजन प्रोटीन (नक्शे) है, जो गीला शर्तों3,4,5,6,7में mussels के चिपकने वाले गुणों के लिए जिंमेदार है में पाया जाता है । Tyr शुरू में जहां डोपा नक्शे में पाया जाता है और फिर8,9tyrosinases द्वारा डोपा में बदल दिया है पदों पर इनकोडिंग है । अपने दिलचस्प जैव रासायनिक गुणों के कारण, डोपा आवेदनों की एक किस्म में इस्तेमाल किया गया है । डोपा के dihydroxyl समूह रासायनिक ऑक्सीकरण करने के लिए प्रवण है, और एमिनो एसिड आसानी से एल में परिवर्तित हो जाता है-dopaquinone, मेलेनिन के एक अग्रदूत साबित । अपने उच्च electrophilicity के कारण, एल dopaquinone और उसके डेरिवेटिव thiols और अमीन10,11,12,13के साथ crosslinking और विकार के लिए इस्तेमाल किया गया है । 1, 2-Quinones भी cycloaddition प्रतिक्रियाओं के लिए एक डिएनए के रूप में कार्य कर सकते हैं और bioconjugation के लिए इस्तेमाल किया गया है तनाव से संवर्धित ऑक्सीकरण नियंत्रित cyclooctyne-1, 2-quinone (SPOCQ) cycloaddition14. इसके अलावा, dihydroxyl समूह ऐसे Fe3 + और घन2 +, और डोपा युक्त प्रोटीन के रूप में धातु आयनों chelate कर सकते है दवा वितरण और धातु आयन संवेदन15,16के लिए उपयोग किया गया है ।

डोपा आनुवंशिक रूप से एक ओर्थोगोनल aminoacyl का उपयोग करके प्रोटीन में शामिल किया गया है-tRNA (ए. ए.-tRNA) और aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) जोड़ी17 और प्रोटीन के लिए इस्तेमाल किया विकार और crosslinking10,11, 12,13. इस रिपोर्ट में, प्रयोगात्मक परिणाम और डोपा के आनुवंशिक निगमन के लिए प्रोटोकॉल सस्ते शुरू सामग्री और bioconjugation करने के लिए अपने अनुप्रयोगों से संश्लेषित वर्णित हैं । डोपा एक TPL का उपयोग कर और catechol, पाइरूवेट, और अमोनिया से ई कोलाईमें शुरू करने के लिए संश्लेषित है । संश्लेषित डोपा सीधे एक विकसित ए. ए.-tRNA और डोपा के लिए aaRS जोड़ी व्यक्त द्वारा प्रोटीन में शामिल है । इसके अलावा, डोपा युक्त प्रोटीन है साइट विशेष रूप से एक फ्लोरोसेंट जांच और crosslinked के साथ संयुग्मित के लिए प्रोटीन oligomers का उत्पादन । इस प्रोटोकॉल प्रोटीन वैज्ञानिकों के लिए उपयोगी हो जाएगा, जैव संश्लेषित उत्परिवर्ती प्रोटीन डोपा युक्त है और संयुग्मी रासायनिक जांच या औद्योगिक और दवा अनुप्रयोगों के लिए दवाओं के साथ प्रोटीन ।

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Protocol

1. प्लाज्मिड निर्माण

  1. एक अभिव्यक्ति प्लाज्मिड निर्माण (pBAD-दोहरे TPL-GFP-WT) कि TPL Citrobacter से एक गठन प्रमोटर के नियंत्रण में freundii जीन व्यक्त और ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) जीन के नियंत्रण के तहत एक अपने6टैग के साथ araBAD प्रवर्तक. pBAD के लिए-दोहरे TPL-GFP-E90TAG, codon के साइट (E90) के लिए एक एंबर डोपा (टैग), एक साइट-निर्देश codon प्रोटोकॉल का उपयोग कर के साथ की जगह । इस प्लाज्मिड के निर्माण के लिए विवरण हमारी पिछली रिपोर्ट18में वर्णित किया गया था ।
  2. एक tRNA/aaRS-व्यक्त प्लाज्मिड (pEVOL-DHPRS2)18,19 डोपा के आनुवंशिक निगमन के लिए निर्माण । pEVOL एक विशेष प्लाज्मिड वेक्टर स्वतंत्र प्रवर्तकों के साथ aaRS जीन की दो प्रतियां व्यक्त कर रहा है, और प्लाज्मिड की विस्तृत जानकारी एक पिछली रिपोर्ट19में वर्णित है ।
  3. उच्च शुद्धता प्लाज्मिड DNAs प्राप्त करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्लाज्मिड तैयारी किट का उपयोग करें । यदि आवश्यक हो, तो agarose जेल ट्रो का उपयोग करके prepped DNAs की शुद्धता की जाँच करें ।

2. कल्चरल वडा

  1. Electroporation
    1. इस प्रयोग के लिए इलेक्ट्रो-सक्षम ई. कोलाई DH10β तनाव का प्रयोग करें । प्रत्येक प्लाज्मिड डीएनए (pEVOL-DHPRS2 और pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG) के 1 µ l को सक्षम कोशिकाओं के 20 µ l में जोड़ें । मिश्रण उंहें धीरे एक सजातीय मिश्रण बनाने के लिए, एक पिपेट का उपयोग कर ।
    2. मिश्रण को electroporation cuvettes पर ट्रांसफर कर दीजिये । cuvette को electroporation चैंबर में रखें । चैंबर में cuvette पुश फर्म cuvette-चैंबर संपर्क बनाने के लिए ।
    3. cuvette झटका, ०.१ के लिए 25 µF और २.५ केवी का उपयोग-सेमी cuvettes ।
    4. गरम सुपर इष्टतम शोरबा (समाज) के 1 मिलीलीटर जोड़ें, जिसमें 2% (w/v) tryptone, ०.५% (w/v) खमीर निकालने, 10 मिमी NaCl, २.५ मिमी KCl, 10 मिमी MgCl2, और 20 मिमी ग्लूकोज, cuvette करने के लिए, और एक संस्कृति ट्यूब के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण । झटकों के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए उन्हें गर्मी से बचाव कोशिकाओं ।
    5. फैलाओ 10-100 µ एक lysogeny शोरबा पर बचाया कोशिकाओं के एल (पौंड) आगर प्लेट युक्त ३५ µ जी/एमएल क्लॉरॅंफेनिकोल और १०० µ जी/एमएल एम्पीसिलीन । 16 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं की मशीन ।
  2. स्टार्टर संस्कृति तैयारी
    1. Inoculate एक एकल रूपांतरित कॉलोनी में 5 पौंड मध्यम एंटीबायोटिक दवाओं से युक्त । मिलाते के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर 12 एच के लिए कॉलोनी मशीन ।

3. एक GFP-सिंथेटिक सिस्टम द्वारा E90DOPA की अभिव्यक्ति और शुद्धि

  1. एक कृत्रिम प्रणाली द्वारा GFP-E90DOPA की अभिव्यक्ति
    1. स्टार्टर संस्कृति (2 एमएल) पीए-५०५२ मीडियम20 (५० mM न2HPO4, के १०० मिलीलीटर के लिए स्थानांतरण ५० मिमी KH2पो4, 25 मिमी [एनएच4]2तो4, 2 मिमी MgSO4, ०.१% [डब्ल्यू/वी] ट्रेस धातुओं, ०.५% [w/वी] ग्लिसरॉल, ०.०५% [w/v] ग्लूकोज, और 5% [w/v] अमीनो एसिड [pH ७.२५]) युक्त ३५ µ g/mL क्लॉरॅंफेनिकोल, १०० µ जी/एमएल एम्पीसिलीन, १०० मिमी पाइरूवेट, 10 मिमी catechol, 25 मिमी अमोनिया, और ३०० µ एम dithiothreitol (डीटीटी) मिलाते के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन द्वारा पीछा किया ।
    2. ०.२% (डब्ल्यू/वी) एल-arabinose के 2 मिलीलीटर जोड़ें जब ५५० एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व (आयुध डिपो) ०.८ तक पहुंचता है । मिलाते के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर 12 एच के लिए नमूना मशीन ।
    3. 5 मिनट के लिए ११,००० x g पर कोशिकाओं नीचे स्पिन, supernatant त्यागें, और पर सेल गोली फ्रीज-८० ° c ।
  2. सेल lysis
    1. गल बर्फ पर सेल गोली और ५० मिमी2पीओ4 (पीएच ८.०), 10 मिमी imidazole, और ३०० mm NaCl युक्त lysis बफर के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend ।
    2. Sonicate 10 मिनट के लिए बर्फ पर resuspend कोशिकाओं का उपयोग करें ८०% sonication आयाम 25 एस की एक पल्स के साथ और ३५ एस बंद ।
    3. 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर १८,००० x g पर सेल lysate नीचे स्पिन । शुद्धि के लिए एक ताजा ट्यूब के लिए supernatant स्थानांतरण और गोली त्यागें ।
  3. नी-ंत् संबध क्रोमैटोग्राफी
    1. जोड़ें ni-ंत् (nitrilotriacetic एसिड) राल (३०० µ एल राल निलंबन के लिए एक १००-एमएल संस्कृति) supernatant करने के लिए और धीरे से 1 ज के लिए निलंबन मिलाते हुए 4 डिग्री सेल्सियस पर नी-ंत् राल के लिए प्रोटीन बाँध
    2. एक स्तंभ के लिए निलंबन स्थानांतरण और धो2पीओ4 (पीएच ८.०), 20 मिमी imidazole, और ३०० मिमी NaCl युक्त धोने बफर के 5 मिलीलीटर के साथ राल 3x धो लें ।
    3. Elute ५० mm 2 पीओ4 (पीएच ८.०), २५० mm imidazole, और ३०० mm NaCl युक्त रेफरेंस बफर के ३०० µ l के साथ3x प्रोटीन 3x है ।
    4. २८० एनएम पर अवशोषण को मापने के द्वारा प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण । २८० एनएम पर GFP-E90DOPA के लिए विलुप्त गुणांक (२४,६३० एम-1सेमी-1) एक प्रोटीन विलुप्त गुणांक कैलकुलेटर (जैसे, https://web.expasy.org/protparam/) और स्वतंत्र रूप से मापा विलुप्त होने की गणना की गई थी coefficiennt (२६३० एम-1सेमी-1) डोपा के लिए । एक वैकल्पिक विधि के रूप में, प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख21 का उपयोग करें ।

4. Oligomerization की शुद्धि GFP-E90DOPA

  1. एच2ओ (6 मिमी) (१.० equiv. to GFP-E90DOPA) में सोडियम periodate के 1 µ एल जोड़ें µ-GFP (३०० E90DOPA मीटर) के एक फॉस्फेट बफर में ५० मिमी ना2µ4 (पीएच ८.०) और ३०० मिमी HPO युक्त 20 NaCl एल के एक समाधान के लिए ।
  2. ४८ एच के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर आगे बढ़ने के लिए oligomerization प्रतिक्रिया की अनुमति दें ।
  3. कदम 6 में वर्णित के रूप में सोडियम dodecyl सल्फेट-polyacrylamide जेल ट्रो) (एसडीएस-पृष्ठ) द्वारा प्रतिक्रिया मिश्रण का विश्लेषण करें ।

5. विकार की Alkyne जांच के साथ GFP-E90DOPA का SPOCQ

  1. cy 5.5-लिंक्ड azadibenzocyclooctyne (cy 5.5-ADIBO)22 में एच2ओ (४.० मिमी) (10 equiv) के 1 µ l को जोड़ें । करने के लिए GFP-E90DOPA) के एक समाधान के लिए 20 µ एल के GFP-E90DOPA (20 µ m) एक फॉस्फेट बफर युक्त ५० mm Na2HPO4 (पीएच ८.०) और ३०० मिमी NaCl.
  2. प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए एच2ओ (४०० µ एम) (१.० equiv. to GFP-E90DOPA) में सोडियम periodate के 1 µ एल जोड़ें ।
  3. 1 एच के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर आगे बढ़ने के लिए SPOCQ प्रतिक्रिया की अनुमति दें । यदि एक प्रकाश के प्रति संवेदनशील जांच का प्रयोग किया जाता है, एल्यूमीनियम पंनी के साथ प्रतिक्रिया पोत कवर ।

६. त्यसपछि GFP का शुद्धिकरण

  1. एक फॉस्फेट बफर जोड़ने के द्वारा SPOCQ प्रतिक्रिया मिश्रण पतला, ५० मिमी ना2HPO4 (पीएच ८.०) और ३०० mm NaCl, ५०० µ एल युक्त.
  2. एक केंद्रापसारक फिल्टर स्पिन कॉलम को पतला समाधान स्थानांतरण । 15 मिनट के लिए 4 ° c पर १४,००० x g पर स्पिन कॉलम केंद्रापसारक और प्रवाह के माध्यम से त्यागें । दोहराएं इस कदम 3x आदेश में किसी भी अतिरिक्त cy 5.5-ADIBO को दूर करने के लिए ।
  3. स्पिन कॉलम से शुद्ध नमूना एक १.५-एमएल microcentrifuge ट्यूब स्थानांतरण ।
  4. वैकल्पिक रूप से, एक ही बफर के खिलाफ डायलिसिस द्वारा एक शुद्धि ले ।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर शुद्ध GFP की दुकान ।

7. एसडीएस-पृष्ठ विश्लेषण और प्रतिदीप्ति जेल स्कैनिंग

  1. प्रोटीन नमूना बफर के 5 µ एल जोड़कर एसडीएस-पृष्ठ विश्लेषण के लिए प्रोटीन नमूने तैयार ( सामग्री की तालिकादेखें) और डीटीटी के 2 µ l (१.०० मी) के 13 µ l को शुद्ध, या क्रूड, लेबल GFP (१३.६ µ M या ०.३८ mg/ oligomeric GFP के एक विश्लेषण के लिए, GFP (६७.८ µ m या १.९ मिलीग्राम/एमएल) के एक उच्च एकाग्रता का उपयोग करें । 10 मिनट के लिए ९५ ° c पर उंहें मशीन द्वारा प्रोटीन स्वभाव ।
  2. एक 4%-12% बीआईएस प्लेस-Tris एसडीएस-पृष्ठ जेल कैसेट (खरीदा, बनाया जेल कैसेट्स) ट्रो सेल के लिए और एक चल रहे बफर जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) । प्रोटीन के नमूनों और एक आणविक वजन मार्कर लोड । ३५ के लिए ट्रो भागो-४० मिनट में २०० V ।
    नोट: अंधेरे में सभी प्रक्रियाओं को बाहर ले जाकर प्रकाश करने के लिए प्रोटीन के नमूनों के किसी भी जोखिम से बचें, फ्लोरोसेंट जांच के फोटो ब्लीचिंग को कम करने के लिए.
  3. प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए एक प्रतिदीप्ति स्कैनर का उपयोग करें । ट्रो से एक प्रोटीन जेल लपेटें और यह एक प्रतिदीप्ति स्कैनर पर जगह है । एक उचित तरंग दैर्ध्य सेटिंग का उपयोग करके जेल स्कैन । cy 5.5 के लिए, स्कैनर सॉफ़्टवेयर में प्रदान किए गए Cy5 मोड का चयन करें ।
  4. दाग एक वाणिज्यिक प्रोटीन धुंधला एजेंट के साथ जेल ।

८. मालदी-तोफ MS विश्लेषण Trypsin पाचन द्वारा

  1. एक बफर में ५० मिमी Tris-एचसीएल (पीएच ८.०), ०.१% (डब्ल्यू/वी) एसडीएस, और 25 मिमी डीटीटी के लिए 1 एच ° c के लिए शुद्ध GFP-E90DOPA (२.२ मिलीग्राम/एमएल या ८० µ मीटर) की मशीन १०० µ एल ।
  2. Iodoacetamide के 1 µ l को एच2ओ (आईएए, ४.० मीटर) में जोड़ें (५०० equiv. to GFP-E90DOPA) को शुद्ध GFP-E90DOPA समाधान (८० µ M) को एक ही बफर में डालें । प्रकाश से सुरक्षा के साथ 30 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण की मशीन ।
  3. GFP-E90DOPA नमूना trypsin जोड़कर डाइजेस्ट (1:100 चिढ़ाने-सब्सट्रेट-प्रोटीन अनुपात [डब्ल्यू/डब्ल्यू]) और 4 एच के लिए ३७ ° c पर प्रतिक्रिया मिश्रण गर्मी
  4. सी18 स्पिन कॉलम के साथ एक मानक लवण विधि का उपयोग करके पचा पेप्टाइड नमूना शुद्ध ।
  5. मैट्रिक्स के लिए रिपोर्ट प्रोटोकॉल द्वारा पचता पेप्टाइड्स का विश्लेषण-असिस्टेड लेजर desorption/ionization समय-की-उड़ान मास स्पेक्ट्रोमेट्री (मालदी-तोफ MS) अल्फा-cyano-4-hydroxycinnamic एसिड (CHCA) का उपयोग कर एक मैट्रिक्स के रूप में23।

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Representative Results

एक TPL से संश्लेषित डोपा के प्रत्यक्ष शामिल करने के लिए अभिव्यक्ति प्रणाली चित्रा 1में दिखाया गया है । विकसित ए. ए. के लिए जीन-tRNA और aaRS जोड़ी एक प्लाज्मिड में रखा जाता है, और GFP जीन (GFP-E90TAG) ९० स्थिति में एक एंबर codon युक्त एक और प्लाज्मिड में स्थित है डोपा GFP द्वारा प्रतिदीप्ति के शामिल मूल्यांकन । TPL जीन को इसी अभिव्यक्ति में रखा गया है प्लाज्मिड युक्त GFP जीन और constitutively की उपज को अधिकतम करने के लिए व्यक्त किया गया डोपा का संश्लेषण. इस अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करना, डोपा के लिए इष्टतम स्थिति के संश्लेषण की जांच की गई । वृद्धि मीडिया इस प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया 25 मिमी अमोनिया और १०० mm पाइरूवेट, catechol (0-10 मिमी) की बदलती सांद्रता के साथ निहित । catechol एकाग्रता डोपा संश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण था, जबकि अमोनिया और पाइरूवेट 25 मिमी और १०० मिमी से अधिक सांद्रता, क्रमशः, डोपा के संश्लेषण और निगमन को प्रभावित नहीं किया. catechol के इष्टतम एकाग्रता 10 मिमी था, और अधिक से अधिक 10 मिमी की एकाग्रता अपनी cytotoxicity के कारण बैक्टीरियल कोशिका वृद्धि की कमी हुई । इस इष्टतम स्थिति में, डोपा अपनी प्रारंभिक सामग्री से TPL द्वारा संश्लेषित किया गया था, और संश्लेषित डोपा सीधे GFP में शामिल किया गया था । व्यक्त उत्परिवर्ती GFP (GFP-E90DOPA) शुद्ध किया गया था और एसडीएस द्वारा विश्लेषण-पृष्ठ (चित्रा 2ए) । पूर्ण लंबाई GFP शुद्ध था, और डोपा निगम मालदी द्वारा पुष्टि की गई थी-तोफ एमएस विश्लेषण (चित्रा 2बी) । प्रोटीन trypsin के साथ पच गया था, पेप्टाइड डोपा युक्त टुकड़ा का विश्लेषण किया गया था, और परिणाम कोई जासूसी Tyr या अंय प्राकृतिक एमिनो एसिड निगमन के साथ डोपा के अनंय निगमन दिखाया । डोपा के TPL द्वारा संश्लेषित क्षमता के शामिल होने की क्षमता 3 मिमी डोपा है, जो डोपा की वजह से अपनी cytotoxicity19की अधिकतम एकाग्रता है के साथ निगमन दक्षता के समान था । हालांकि 10 मिमी catechol उदारवादी विषाक्तता दिखाया, संस्कृति समय के 16 ज के बाद सेल घनत्व तीन था-3 मिमी डोपा की उपस्थिति की तुलना में अधिक चौगुना करने के लिए. तिगुना से शुद्ध प्रोटीन उपज 3 मिमी डोपा (चित्रा 3) का उपयोग कर प्रयोग से उस से अधिक था ।

डोपा युक्त उत्परिवर्ती GFP प्रोटीन विकार के लिए इस्तेमाल किया गया था । डोपा हल्के oxidants द्वारा L-dopaquinone में ऑक्सीकरण किया जा सकता है, और electrophilic quinone तनावपूर्ण alkynes और nucleophiles, जैसे thiols और अमीन के साथ प्रतिक्रिया करता है, और bioconjugation (चित्रा 4) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । GFP-E90DOPA सोडियम periodate के साथ प्रतिक्रिया द्वारा SPOCQ cycloaddition के लिए परीक्षण किया गया था, cy 5.5-ADIBO22के साथ एक इलाज के बाद । इस SPOCQ प्रतिक्रिया एसडीएस-पृष्ठ और प्रतिदीप्ति इमेजिंग (चित्रा 5ए) द्वारा विश्लेषण किया गया था । तीव्र प्रतिदीप्ति बैंड सोडियम periodate और cy 5.5-ADIBO के उपचार के साथ मनाया गया था, जबकि कोई प्रतिदीप्ति बैंड नियंत्रण प्रतिक्रियाओं में GFP-WT के साथ या एक सोडियम periodate उपचार के बिना दिखाया गया था, की दक्षता और विशिष्टता की पुष्टि आनुवंशिक रूप से शामिल डोपा के साथ विकार प्रतिक्रिया । इसके अलावा प्रोटीन oligomerization के लिए डोपा युक्त GFP का प्रयोग किया गया । L-dopaquinone उसी प्रोटीन में Lys या Cys के साथ प्रतिक्रिया करता है, जिसके परिणामस्वरूप oligomeric प्रोटीन होता है. GFP-E90DOPA सोडियम periodate के साथ इलाज किया गया था और oligomerization ४८ एच के लिए किया जाता था, और प्रतिक्रिया एक सोडियम एसडीएस उपचार के बिना एक नियंत्रण नमूना के साथ तुलना में periodate-पृष्ठ द्वारा विश्लेषण किया गया था (चित्रा 5बी). विश्लेषण periodate-इलाज नमूना के लिए समान रूप से अंतरिक्ष प्रोटीन बैंड के साथ एक स्पष्ट oligomerization पैटर्न दिखाया, जबकि नियंत्रण नमूना किसी भी अंय बैंड के बिना बरकरार प्रोटीन दिखाया ।

Figure 1
चित्रा 1 : डोपा catechol, पाइरूवेट, और अमोनिया से संश्लेषित प्रत्यक्ष शामिल । डोपा विकास माध्यम में catechol, पाइरूवेट, और अमोनिया से TPL व्यक्त heterologously द्वारा संश्लेषित है । विकसित tRNA/डोपा के लिए aaRS जोड़ी सह है लक्ष्य प्रोटीन, GFP में संश्लेषित डोपा शामिल व्यक्त की है । TPL जीन एक गठन प्रमोटर के तहत रखा गया था क्रम में GFP अभिव्यक्ति उत्प्रेरण से पहले डोपा का संश्लेषण शुरू करने के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : एसडीएस-PAGE and मालदी-तोफ MS िरा के GFP-E90DOPA द्वारा व्यक्त की गई डिजाइन की गई कृत्रिम प्रणाली । (क) GFP-E90DOPA द्वारा 10 मिमी catechol, १०० मिमी पाइरूवेट, और 25 मिमी अमोनिया की उपस्थिति में डिजाइन की गई कृत्रिम प्रणाली द्वारा व्यक्त किया गया था, और फिर नी-ंत् अपनत्व क्रोमैटोग्राफी से शुद्ध । GFP-WT की तुलना के लिए भी विश्लेषण किया गया. नमूने बीआईएस द्वारा अलग-Tris 4%-12% एसडीएस-पृष्ठ, और जेल Coomassie शानदार नीले आर-२५० के साथ दाग था । (ख) GFP-E90DOPA के tryptic पाचन से डोपा युक्त पेप्टाइड अंशों का मालदी-तोफ MS विश्लेषण । GFP-WT से पेप्टाइड अंश अवशेषों ८६-९६ (SAMPEGYVQER) शामिल हैं । GFP-WT से अंश में Glu को GFP-E90DOPA से पेप्टाइड अंश में डोपा के साथ प्रतिस्थापित कर दिया जाता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : डोपा के एक सामांय आनुवंशिक निगमन के साथ संश्लेषित डोपा के प्रत्यक्ष शामिल करने की तुलना । इन पैनलों GFP-E90DOPA डिजाइन किए गए कृत्रिम सिस्टम द्वारा व्यक्त की और अतिरिक्त पाइरूवेट, अमोनिया, और catechol के बिना 3 मिमी डोपा की उपस्थिति में आनुवंशिक शामिल । (क) प्रोटीन की पैदावार को शुद्ध GFP-E90DOPA से प्राप्त किया गया, और (ख) सेल घनत्व को इंडक्शन के बाद 16 ज में मापा गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : GFP-E90DOPA के bioconjugation की अभिक्रिया योजना । GFP-E90DOPA डोपा को dopaquinone में परिवर्तित करने के लिए ऑक्सीकरण हो जाता है । dopaquinone-एक तनावपूर्ण alkyne के साथ प्रोटीन युक्त की प्रतिक्रिया साइट विशिष्ट प्रोटीन लेबलिंग प्राप्त है । एक लंबे समय के लिए एक उच्च एकाग्रता में dopaquinone-युक्त प्रोटीन की मशीन (४८ ज) प्रोटीन स्व-विकार प्रोटीन oligomers का उत्पादन करने के लिए कारण बनता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : उत्परिवर्ती प्रोटीन युक्त डोपा के Bioconjugation । (क) एक तनावपूर्ण alkyne, ADIBO-cy 5.5 के साथ एक डोपा-युक्त प्रोटीन की SPOCQ प्रतिक्रियाओं । GFP-WT और GFP-E90DOPA सोडियम periodate के साथ इलाज किया गया और ADIBO के साथ प्रतिक्रिया-cy 5.5 ६० मिनट के लिए । प्रतिक्रियाओं एसडीएस द्वारा विश्लेषण किया गया पृष्ठ, और Coomassie-सना हुआ (ऊपर) और प्रतिदीप्ति (नीचे) छवियों को दिखाया गया है । (ख) GFP-E90DOPA के Oligomerization । डोपा युक्त GFP सोडियम periodate के साथ इलाज किया गया था और ४८ एच के लिए मशीन । प्रतिक्रिया मिश्रण एसडीएस द्वारा विश्लेषण किया गया था-पृष्ठ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, डोपा का संश्लेषण और प्रत्यक्ष शामिल करने का वर्णन किया गया है । इस विधि में प्रयुक्त बैक्टीरियल कोशिका एक अतिरिक्त अमीनो एसिड को संश्लेषित कर सकते हैं और प्रोटीन संश्लेषण के लिए एक अप्राकृतिक बिल्डिंग ब्लॉक के रूप में इसका इस्तेमाल करते हैं । अप्राकृतिक एमिनो एसिड का आनुवंशिक शामिल एक विस्तारित आनुवंशिक कोड के साथ अप्राकृतिक जीव के विकास के लिए एक प्रमुख तकनीक किया गया है । हालांकि, इस विधि तकनीकी रूप से अधूरा है और निगमन दक्षता में सुधार और अंतर्जात अनुवाद प्रणालियों के लिए गड़बड़ी को कम करने के लिए संशोधित किया जा रहा है । हाल ही में, विधि में महत्वपूर्ण प्रगति codons24,अप्राकृतिक अमीनो एसिड और इंजीनियरिंग ओर्थोगोनल शोधों केलिए25 ,27,28 के लिए reassign द्वारा प्राप्त किया गया है ,29. इन सुधार के अलावा, प्रणाली यहां वर्णित एक विस्तारित आनुवंशिक कोड के साथ एक अप्राकृतिक जीव के लिए एक और क्षमता प्रदान करता है: एक अप्राकृतिक एमिनो एसिड का संश्लेषण । यह क्षमता एक विस्तारित आनुवंशिक प्रदर्शनों की कार्यक्षमताओं के साथ एक जीव के रूप में अप्राकृतिक प्रणाली और अधिक स्वतंत्रता देता है । इसके अलावा, डोपा इस पद्धति में प्रयुक्त बैक्टीरियल तनाव पर उदारवादी विषाक्तता से पता चलता है, और 3 मिमी डोपा, सेल विकास में काफी कम है, जो कम प्रोटीन की उपज के परिणामस्वरूप । प्रत्यक्ष निगमन प्रणाली का उपयोग करके, विषाक्तता कम हो गया था और प्रोटीन उपज तिगुना वृद्धि हुई ।

aaRS उत्परिवर्ती डोपा के आनुवंशिक शामिल करने के लिए इस्तेमाल किया उदारवादी दक्षता और निष्ठा है और डोपा के एक कम एकाग्रता में Tyr शामिल है । 18 इसलिए, बैक्टीरियल कोशिकाओं में डोपा के संश्लेषण Tyr शामिल होने को रोकने के लिए पर्याप्त कुशल होना चाहिए । catechol, अमोनिया, और पाइरूवेट से TPL द्वारा डोपा का संश्लेषण एक प्रतिवर्ती प्रतिक्रिया है, और प्रारंभिक सामग्री के उच्च सांद्रता एक कुशल के लिए आवश्यक है । हालांकि, catechol 10 मिमी पर इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है क्योंकि यह जीवाणु इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया तनाव को विषाक्त है । इस प्रोटोकॉल में डीटीटी एकाग्रता भी महत्वपूर्ण है । डोपा अपनी विषाक्तता से पता चलता है जब यह एल-dopaquinone में परिवर्तित हो जाता है, और डीटीटी वृद्धि के माध्यम में जोड़ा जाता है ऑक्सीकरण दर को कम करने के लिए । हम सेल के विकास में कमी मनाया जब डीटीटी एकाग्रता ३०० µ मीटर से अधिक था । इसलिए, एक इष्टतम और डोपा के संश्लेषण के लिए, घटकों (विशेष रूप से catechol और संस्कृति माध्यम के लिए डीटीटी) उपयुक्त सांद्रता में इस्तेमाल किया जाना चाहिए के रूप में इस प्रोटोकॉल में वर्णित है ।

इस प्रोटोकॉल भी साइट विशिष्ट प्रोटीन विकार के लिए डोपा युक्त प्रोटीन के अनुप्रयोगों का वर्णन है । एल dopaquinone डोपा के ऑक्सीकरण द्वारा उत्पंन कुशलतापूर्वक एक जैव रासायनिक जांच करने के लिए जुड़े एक तनावपूर्ण alkyne के साथ प्रतिक्रिया करता है । इस cycloaddition प्रतिक्रिया आम तौर पर अमीन या thiols द्वारा nucleophilic इसके अलावा प्रतिक्रियाओं से भी तेज है । फिर भी, डोपा के ऑक्सीकरण दोनों एक डोपा युक्त प्रोटीन और एक तनावपूर्ण alkyne की उपस्थिति में किया जाना चाहिए, के लिए प्रोटीन में nucleophiles द्वारा nucleophilic के अलावा कम करने के लिए । इसलिए, इस प्रतिक्रिया के लिए रिएजेंट के अतिरिक्त का क्रम महत्वपूर्ण है ।

कई अप्राकृतिक अमीनो एसिड प्रोटीन विकार के लिए उपलब्ध हैं, और उनमें से कुछ एक तेजी से प्रतिक्रिया दर और उत्कृष्ट विकार दक्षता प्राप्त30,31,३२,३३। इन एमिनो एसिड biorthogonal कार्यात्मक समूहों जैसे azides, alkynes, तनावपूर्ण alkenes या alkynes, और tetrazines होते हैं । हालांकि वे साइट विशेष प्रोटीन विकार के लिए उपयोगी होते हैं, उनमें से कई महंगी या व्यावसायिक रूप से दुर्गम है, जो अपने अनुप्रयोगों को सीमा, विशेष रूप से बड़े पैमाने पर प्रोटीन की आवश्यकता होती है उन में । इसलिए, डोपा के सस्ते शुरू सामग्री और इसके प्रत्यक्ष शामिल होने से जैव संश्लेषण दवा और औद्योगिक एक जैव रासायनिक जांच या एक दवा युक्त बड़े पैमाने उत्परिवर्ती प्रोटीन की आवश्यकता के अनुप्रयोगों के लिए उपयोगी हो जाएगा (एंटीबॉडी-ड्रग संयुग्मी, एडीसी).

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध को ग्लोबल फ्रंटियर रिसर्च प्रोग्राम (एनआरएफ-2015M3A6A8065833), और कोरिया सरकार द्वारा वित्तपोषित नेशनल रिसर्च फाउंडेशन ऑफ कोरिया (एनआरएफ) के माध्यम से बेसिक साइंस रिसर्च प्रोग्राम (2018R1A6A1A03024940) द्वारा समर्थित किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Plasmid Construction
Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
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DH10β Invitrogen C6400-03 Expression Host
Plasmid Mini-prep kit Nucleogen 5112 200/pack
Agarose Intron biotechnology 32034 500 g
Ethidium bromide Alfa Aesar L07482 1 g
LB Broth BD Difco 244620 500 g
2. Culture preparation
2.1) Electroporation
Micro pulser  BIO-RAD 165-2100
Micro pulser cuvette BIO-RAD 165-2089 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin Sodium Wako 018-10372 25 g
Chloramphenicol Alfa Aesar B20841 25 g
Agar SAMCHUN 214230 500 g
SOC medium Sigma S1797 100 mL
3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
L(+)-Arabinose, 99% Acros 104981000 100 g
Pyrocatechol, 99% SAMCHUN P1387 25 g
Ammonium sulfate, 99% SAMCHUN A0943 500 g
pyruvic acid, 98% Alfa Aesar A13875 100 g
Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99% SAMCHUN S0891 1 kg
Potassium phophate, monobasic, 99% SAMCHUN P1127 1 kg
Magnesium sulfate, anhydrous, 99% SAMCHUN M0146 1 kg
D(+)-Glucose, anhydrous, 99% SAMCHUN D0092 500 g
Glycerol, 99% SAMCHUN G0269 1 kg
Trace metal mix a5 with co Sigma 92949 25 mL
L-Proline, 99% SAMCHUN P1257 25 g
L-Phenylalanine, 98.5% SAMCHUN P1982 25 g
L-Tryptophane JUNSEI 49550-0310 25 g
L-Arginine, 98% SAMCHUN A1149 25 g
L-Glutamine, 98% JUNSEI 27340-0310 25 g
L-Asparagine monohydrate, 99% SAMCHUN A1198 25 g
L-Methionine JUNSEI 73190-0410 25 g
L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99% SAMCHUN H0604 25 g
L-Threonine, 99% SAMCHUN T2938 25 g
L-Leucine JUNSEI 87070-0310 25 g
Glycine, 99% SAMCHUN G0286 25 g
L-Glutamic acid, 99% SAMCHUN G0233 25 g
L-Alanine, 99% SAMCHUN A1543 25 g
L-Isoleucine, 99% SAMCHUN I1049 25 g
L-Valine, 99% SAMCHUN V0088 25 g
L-Serine SAMCHUN S2447 25 g
L-Aspartic acid SAMCHUN A1205 25 g
L-Lysine monohydrochloride, 99% SAMCHUN L0592 25 g
3.2 Cell lysis
Imidazole, 99% SAMCHUN I0578 1kg
Sodium phosphate monobasic, 98% SAMCHUN S0919 1 kg
Sodium Chloride, 99% SAMCHUN S2907 1 kg
Ultrasonic Processor - 150 microliters to 150 milliliters SONIC & MATERIALS VCX130
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resin QIAGEN 30210 25 mL
Polypropylene column QIAGEN 34924 50/pack, 1 mL capacity
4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA 
Sodium periodate, 99.8& Acros 419610050 5 g
5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ) 
Cy5.5-ADIBO  FutureChem FC-6119 1mg
6. Purification of Labeled GFP
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters MILLIPORE UFC500396 96/pack, 500ul capacity
7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % Sigma 10708984001 10 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X Thermofisher NP0007 10 mL
MES running buffer Thermofisher NP0002 500 mL
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels Thermofisher NO0321 12 well
Coomassie Brilliant Blue R-250 Wako 031-17922 25 g
G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging System Syngene G BOX Chemi XT4
8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion
8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% SAMCHUN T1351 500 g
Hydrochloric acid, 35~37% SAMCHUN H0256 500 mL
Dodecyl sulfate sodium salt, 85% SAMCHUN D1070 250 g
Iodoacetamide Sigma I6125 5 g
Trypsin Protease, MS Grade Thermofisher 90057 5 x 20 µg/pack
C-18 spin columns Thermofisher 89870 25/pack, 200 µL capacity
8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF
Acetonitirile, 99.5% SAMCHUN A0125 500 mL
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma C2020 10 g
Trifluoroacetic acid, 99% SAMCHUN T1666 100 g
MTP 384 target plate ground steel BC targets Bruker 8280784
Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometer Bruker

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References

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जैव रसायन अंक १३८ डोपा आनुवंशिक निगमन जैव संश्लेषण tyrosine phenol-lyase प्रोटीन विकार तनाव संवर्धित ऑक्सीकरण नियंत्रित cyclooctyne-1 2-quinone (SPOCQ) cycloaddition
आनुवंशिक संश्लेषित एल-dihydroxyphenylalanine (डोपा) और प्रोटीन के लिए अपने आवेदन विकार
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Kim, S., Lee, H. S. Genetic… More

Kim, S., Lee, H. S. Genetic Incorporation of Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) and Its Application to Protein Conjugation. J. Vis. Exp. (138), e58383, doi:10.3791/58383 (2018).

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