Summary
Burada, L-dihydroxyphenylalanine uzarlar basit başlangıç malzemelerden genetik birleşme ve protein konjugasyon için uygulama için bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
L-dihydroxyphenylalanine (basıncın) katekolaminler hayvanlar ve bitkiler içinde biyosentezi bulunan bir amino asittir. Belirli biyokimyasal özellikleri nedeniyle, amino asit biyokimyasal uygulamalarda birden çok faydası vardır. Bu rapor bir protokol uzarlar basıncın genetik birleşme ve protein konjugasyon için uygulama açıklar. BASINCIN bir Tirozin fenol-liyaz (TPL) katekol, pyruvate ve amonyak tarafından uzarlar olduğunu ve amino asit doğrudan bir Gelişmiş Aminoasil tRNA ve Aminoasil tRNA sentetaz çiftini kullanarak genetik birleşme yöntemi tarafından proteinlerin dahil edilmiştir. Bu doğrudan birleşme sistemi verimli basıncın daha iyi protein verimini basıncın daha önceki genetik birleşme sistemi ile diğer doğal amino asitler ve küçük eklenmesi ile birleştirmek. Protein konjugasyon basıncın içeren proteinler ile verimli ve siteye özel ve kullanışlılığı çeşitli uygulamalar için gösterir. Bu iletişim kuralı protein bilim adamları ile istediğiniz siteleri ve onların konjugasyon Sanayi ve ilaç uygulamaları için basıncın içeren mutasyona uğramış proteinlerin verimli biyosentezi için ayrıntılı yordamlar sağlar.
Introduction
BASINCIN katekolaminler hayvanlar ve bitkiler içinde biyosentezi katılan bir amino asittir. Bu amino asit tirozin hidroksilaz ve moleküler oksijen (O2)1tarafından Tyr sentezlenir. BASINCIN dopamin öncüsüdür ve kan - beyin bariyerini nüfuz için Parkinson hastalığı2tedavisinde kullanılmıştır. BASINCIN da midye ıslak koşullar3,4,5,6,7yapışkanlı özelliklerini sorumludur midye yapışma proteinler (haritalar) bulunur. Tyr başlangıçta nerede basıncın haritalar bulunur ve basıncın tyrosinases8,9tarafından daha sonra dönüştürülür pozisyonlarda kodlanır. İlginç biyokimyasal özellikleri nedeniyle, basıncın çeşitli uygulamalarda kullanılmaktadır. BASINCIN dihidroksi grup kimyasal oksidasyon yatkın ve amino asit L-dopaquinone, melanins habercisi kolayca dönüştürülür. Onun yüksek electrophilicity nedeniyle, L-dopaquinone ve onun türevleri crosslinking ve fiil ile10,11,12,13thiols ve aminler için kullanılmaktadır. 1,2-quinones Dien cycloaddition tepkiler gibi de davranabilir ve bioconjugation için zorlanma terfi oksidasyon kontrollü cyclooctyne-1,2-quinone (SPOCQ) cycloaddition14tarafından kullanılmıştır. Buna ek olarak, dihidroksi grup Fe3 + ve Cu2 +gibi metal iyonlarının şelasyon yapın ve basıncın içeren proteinler ilaç dağıtım ve metal iyon15,16algılama için kullanılmıştır.
BASINCIN edilmiş genetik olarak protein bir dik Aminoasil tRNA (aa-tRNA) ve Aminoasil tRNA sentetaz (aaRS) çifti17 kullanarak dahil ve protein konjügasyon ve crosslinking10,11için, kullanılan 12,13. Bu raporda, deneysel sonuçlar ve protokolleri basıncın uzarlar ucuz başlangıç malzemeleri ve uygulamaları bioconjugation için genetik birleşme açıklanmıştır. BASINCIN bir TPL kullanarak ve katekol, pyruvate ve Escherichia coliamonyak başlayarak uzarlar var. BASINCIN uzarlar doğrudan evrimleşmiş bir aa-tRNA ve aaRS çifti için basıncın ifade ederek protein kurulmuştur. Buna ek olarak, basıncın içeren uzarlar protein site-specifically bir floresan sonda ve protein reaksiyonlar üretmek için çapraz ile Birleşik. Bu iletişim kuralı için biosynthesize mutasyona uğramış proteinlerin basıncın içeren protein bilim adamları için yararlı olduğu ve proteinler ile biyokimyasal probları veya ilaç sanayi ve ilaç uygulamaları için eşlenik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. plazmid İnşaat
- Sitrobacter freundii üzerinden TPL gen bir bünye organizatörü kontrol altında ve yeşil flüoresan protein (GFP) gen bir His ile ifade bir ifade plazmid (pBAD-çift-TPL-GFP-WT) inşa6-etiket denetimi altında araBAD organizatörü. PBAD-çift-TPL-GFP-E90TAG için kodon (E90) site için bir site Yönetmen: mutagenesis iletişim kuralı kullanılarak basıncın kehribar bir kodon (TAG), ile değiştirin. Bu plazmid inşası için Ayrıntılar bizim önceki rapor18' açıklanan.
- Bir tRNA/aaRS-ifade plazmid (pEVOL-DHPRS2)18,19 basıncın genetik birleşme oluşturmak. pEVOL aaRS genlerin iki kopya bağımsız organizatör ile ifade bir özel plazmid vektörü olduğu ve plazmid ayrıntılı bilgi bir önceki rapor19' de açıklanmıştır.
- Piyasada bulunan plazmid hazırlık setleri yüksek saflıkta plazmid DNA'lar almak için kullanın. Hazırlandı DNA'lar saflığı özel jel elektroforez, kullanarak gerekirse gözden geçirin.
2. kültür hazırlama
-
Elektroporasyon
- Bu deney için kullanım elektro-yetkili E. coli DH10β zor. Her plazmid DNA (pEVOL-DHPRS2 ve pBAD-çift-TPL-GFP-E90TAG) 1 µL yetkili hücreleri 20 µL için ekleyin. Mix onları hafifçe bir pipet kullanarak homojen bir karışım yapmak.
- Karışım Elektroporasyon cuvettes aktarın. Küvet Elektroporasyon odasına koyun. Firma küvet-odası yapmak için odasına küvet itmek başvurun.
- 25 µF kullanarak küvet, şok ve 2,5 kV 0.1 cm cuvettes için.
- Prewarmed süper en iyi suyu (SOC), 1 %2 (w/v) tryptone içeren mL ekleyin, %0,5 (w/v) özü, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2ve 20 mM glikoz, küvet için Maya ve hücreleri bir kültür tüp transfer. Hücreleri onları 37 ° C'de sallayarak ile 1 h için kuluçka kurtarma.
- 10-100 µL 35 µg/mL kloramfenikol ve 100 µg/mL ampisilin içeren bir tabakta lysogeny suyu (LB) agar kurtarıldı hücrelerinin yayıldı. 16 h için 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
-
Starter kültür hazırlama
- Antibiyotik içeren LB orta 5 ml dönüştürülmüş bir koloni aşılamak. Colony 37 ° C'de sallayarak ile 12 h için kuluçkaya.
3. ifade ve arıtma GFP-E90DOPA biyosentetik sistemi tarafından
-
GFP-E90DOPA ifade biyosentetik sistem tarafından
- Starter kültür (2 mL) 100 mL PA-5052 orta20 (50 mM Na2HPO4, 50 mM KH2PO4,4, 2 mM MgSO4, % 0,1 [w/v] izlemek böylece metaller, %0,5 [w/v] gliserol, 25 mM [NH4]2aktarım %0,05 [w/v] glikoz ve %5 [w/v] amino asitler [pH 7.25]) 35 µg/mL kloramfenikol, 100 µg/mL ampisilin, 100 mM pyruvate, 10 mM katekol, 25 mM amonyak ve 300 µM dithiothreitol (DTT) içeren bir kuluçka 30 ° C'de sallayarak ile izledi.
- 2 mL %0,2 (w/v) L-arabinoz eklediğinizde 550 nm ulaşır 0.8, optik yoğunluk (OD). Örnek 12 h 30 ° C'de sallayarak ile için kuluçkaya.
- Spin aşağı hücreleri 11.000 x g 5 min için de, süpernatant atmak ve hücre Pelet-80 ° C'de dondurmak
-
Hücre lizis
- Hücre Pelet buz çözme ve 10 mL lizis arabellek 50 mM NaH2PO4 (pH 8.0), içeren hücrelerde resuspend 10 mM imidazole ve 300 mM NaCl.
- 10 dk. kullanım % 80 sonication genlik bir darbe ile 25 buzda resuspended hücreleri solüsyon içeren temizleyicide s kapalı açık ve 35 s.
- Spin aşağı lysate 18.000 x g 15 dk. arıtma için taze bir tüp süpernatant aktarmak için 4 ° C'de, hücre ve Pelet atın.
-
Ni-NTA benzeşme Kromatografi
- Ni-NTA (nitrilotriacetic asit) reçine (reçine süspansiyon bir 100 mL kültür için 300 µL) süpernatant için ekleyebilir ve süspansiyon 1 h için hafifçe sallayarak proteinler 4 ° C'de Ni-NTA reçine bağlayabilirsiniz.
- Süspansiyon Polipropilen bir sütuna aktarmak ve reçine 3 yıkama yıkama arabelleği 50 mM NaH2PO4 (pH 8.0), içeren 5 mL x 20 mM imidazole ve 300 mM NaCl.
- Proteinler 3 elute x 50 mM NaH2PO4 (pH 8.0), içeren elüsyon arabelleği 300 µL ile 250 mM imidazole ve 300 mM NaCl.
- 280 absorbans ölçerek protein konsantrasyonu belirlemek nm. Yok olma (24,630 M-1cm-1) için katsayısı GFP-E90DOPA, 280 nm olarak hesaplanır bir protein yok olma katsayısı hesaplama (Örneğin, https://web.expasy.org/protparam/) ve bağımsız olarak ölçülen yok tarafından coefficiennt (2630 M-1cm-1) basıncın için. Alternatif bir yöntem, Bradford protein tahlil21 protein konsantrasyonu tayini için kullanın.
4. Oligomerizasyonda arıtılmış GFP-E90DOPA
- Sodyum 1 µL periodate H2O (6 mM) eklemek (1.0 eşdeğeri GFP-E90DOPA için) 20 µL GFP-E90DOPA bir çözüm için (300 µM) 50 mM Na2HPO4 (pH 8.0) içeren bir fosfat tampon ve 300 mM NaCl.
- Oligomerizasyonda tepki için 48 h 25 ° C'de devam etmek izin verir.
- Reaksiyon karışımı Sodyum Lauryl Sülfat-polyacrylamide jel elektroforez tarafından analiz) (SDS-sayfa) 6. adımda açıklandığı gibi.
5. GFP-E90DOPA SPOCQ tarafından bir alkin sonda ile konjugasyon
- Cy5.5 bağlı azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO)22 H2O (4.0 mM) 1 µL ekleyin (10 GFP-E90DOPA eşdeğeri) 20 µL GFP-E90DOPA bir çözüm için (20 µM) 50 mM Na2HPO4 (pH 8.0) içeren bir fosfat tampon ve 300 mM NaCl.
- Sodyum 1 µL H2O periodate Ekle (400 µM) (1.0 GFP-E90DOPA eşdeğeri) tepki karışıma.
- 25 ° c 1 h için devam etmek SPOCQ tepki sağlar. Bir ışığa duyarlı prob kullanılıyorsa, alüminyum folyo ile reaksiyon gemi kapsar.
6. etiketli GFP saflaştırılması
- 50 mM Na2HPO4 (pH 8.0) içeren bir fosfat tampon ekleyerek SPOCQ reaksiyon karışımı sulandırmak ve 300 mM NaCl, 500 µL.
- Seyreltik çözüm bir santrifüj filtre spin sütuna aktarmak. Spin sütun sırasında 14.000 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi ve akışı aracılığıyla atın. Bu 3 x herhangi bir aşırı Cy5.5 ADIBO kaldırmak için adımları yineleyin.
- Arıtılmış örnek spin sütundan bir 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın.
- Alternatif olarak, aynı tampon karşı diyaliz tarafından bir saflaştırma taşımak.
- Arıtılmış GFP 4 ° C'de depolayın
7. SDS-sayfa analizi ve floresan jel tarama
- Protein örnekleri 5 µL protein örnek arabelleği ekleyerek SDS-sayfa analizi için hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek) ve DTT (1.00 M) 2 µL arıtılmış veya ham, 13 µL için etiketli GFP (13,6 µM veya 0,38 mg/mL). Oligomeric GFP bir analizi için GFP (67.8 µM veya 1,9 mg/mL) daha yüksek bir konsantrasyon kullanın. Onları 95 ° c 10 min için kuluçka proteinler denatüre.
- Elektroforez için % 4 - % 12 Bis-Tris SDS-sayfa jel kaset (satın alınan, hazır jel kaset) yerleştirin ve çalışan bir arabellek ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek). Protein örnekleri ve molekül ağırlığı marker yükleyin. 35-40 dk Elektroforez 200 V çalıştırın.
Not: fotoğraf ağartma-floresan probe en aza indirmek için karanlıkta tüm işlemler gerçekleştirerek gün ışığına protein örneklerinin herhangi bir yay. - Bir floresan tarayıcı floresans görüntüleme için kullanın. Protein jel elektroforez üzerinden sarın ve bir floresan tarayıcıya yerleştirin. Jel bir uygun dalga boyu ayarını kullanarak tarayın. Cy5.5 için tarayıcı yazılımını sağlanan Cy5 modunu seçin.
- Jel reaktif boyama ticari bir protein ile leke.
8. MALDI-TOF MS Analizi tripsin sindirim tarafından
- Arıtılmış GFP-E90DOPA (2.2 mg/mL veya 80 µM) arabellekte (w/v) SDS %0,1 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), içeren ve 25 mM DTT 60 ° c için 1 h 100 µL kuluçkaya.
- Iodoacetamide (IAA, 4.0 M) H2O 1 µL ekleyin (500 eşdeğeri GFP-E90DOPA için) aynı arabellek arıtılmış GFP-E90DOPA çözüm (80 µM) için. Karışımı 30 dk ışık koruma için 25 ° C'de kuluçkaya.
- Tripsin (1: 100 proteaz-substrat protein oranı [w/w]) ekleyerek GFP-E90DOPA örnek sindirmek ve 37 ° C 4 h için tepki karisimin kuluçkaya.
- Sindirilir peptid örnek C18 spin sütunlarla desalting için standart bir yol kullanarak arındırmak.
- Alfa-cyano-4-hydroxycinnamic asit (CHCA) bir matris23kullanarak matris yardımlı Lazer Desorpsiyon/iyonlaşma uçuş zaman kütle spektrometresi (MALDI-TOF MS) için bildirilen protokolü tarafından sindirilmiş peptidler analiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
BASINCIN uzarlar bir TPL üzerinden doğrudan birleşme ifade sistem Şekil 1' de gösterilen. Gelişmiş aa-tRNA ve aaRS çifti için gen bir plazmid yerleştirilir ve 90 konumundaki sarı bir kodon içeren GFP gen (GFP-E90TAG) başka bir plazmid basıncın birleşme değerlendirmek için GFP floresans tarafından bulunur. TPL gen GFP gen içeren aynı ifade plazmid içinde yerleştirilir ve yapısal basıncın biyosentezi verimi en üst düzeye çıkarmak için dile getirdi. Bu ifade sistemi kullanarak, basıncın biyosentezi için optimal koşullar gösterildi. Bu deney yer alan 25 mM amonyak ve değişen katekol (0 - 10 mM) konsantrasyonları ile 100 mM pyruvate için kullanılan büyüme ortamı. Katekol konsantrasyonu kritik basıncın biyosentezi, amonyak ve pyruvate konsantrasyonları üzerinde 25 mM ve 100 mM, süre için sırasıyla, biyosentezi ve basıncın birleşmesiyle etkilemedi. Katekol en yüksek konsantrasyonu 10 mM, ve daha--dan 10 mM bir konsantrasyon önemli ölçüde kendi sitotoksisite nedeniyle bakteri hücre büyüme azalmıştır. Bu en iyi, basıncın TPL tarafından uzarlar onun başlangıç malzemelerden ve basıncın doğrudan GFP dahil oldu uzarlar durumdaydı. İfade mutant GFP (GFP-E90DOPA) saflaştırılmış ve SDS-PAGE tarafından (Şekil 2A) analiz. Tam uzunlukta GFP saflaştırıldı ve basıncın birleşme MALDI-TOF MS Analizi (Şekil 2B) tarafından onaylandı. Proteinin tripsin ile sindirilmiş, basıncın içeren peptid parçası analiz edildi ve basıncın yok algılanabilir Tyr ile özel birleşme veya diğer doğal amino asit birleşme sonucu gösterdi. BASINCIN uzarlar TPL tarafından Kuruluş verimliliğini 3 mM basıncın maksimum konsantrasyon nedeniyle onun sitotoksisite19yaşında basıncın birleşme verimlilikle benzerdi. 10 mM katekol orta toksisite olsa da, kültür zaman 16 h sonra hücre yoğunluğu 3-kat 3 mM basıncın varlığında daha yüksek oldu. Saf protein verim biyosentezi tarafından üç katı 3 mM basıncın (Şekil 3) kullanarak deneme daha yüksek.
Mutant GFP basıncın içeren protein konjugasyon için kullanıldı. BASINCIN L-dopaquinone hafif oksidanlar ile okside ve electrophilic quinone gergin alkynes ve nucleophiles, thiols ve aminler, gibi tepki verir ve bioconjugation (Şekil 4) için kullanılabilir. GFP-E90DOPA ile sodyum tepki SPOCQ cycloaddition için test edildi periodate, bir tedavi Cy5.5-ADIBO22ile izledi. Bu SPOCQ reaksiyon SDS-sayfa ve floresan (Şekil 5A) görüntüleme tarafından analiz edildi. Yoğun floresan bant sodyum tedavisi ile periodate ve Cy5.5-ADIBO hiçbir floresans Grup denetim reaksiyonlarda GFP-WT ile veya olmadan bir sodyum gösterildi iken, periodate tedavi, verimlilik ve özgüllüğü teyit gözlenmiştir genetik olarak eklenen basıncın ile konjugasyon reaksiyonu. Buna ek olarak, basıncın içeren GFP protein Oligomerizasyonda için kullanıldı. L-dopaquinone Lys veya Cys ile aynı protein oligomeric proteinler arasında ortaya çıkan tepki verir. GFP-E90DOPA ile tedavi sodyum periodate ve Oligomerizasyonda 48 h için yürütülen ve bir sodyum periodate olmadan tedavi (Şekil 5B) tepki ile karşılaştırıldığında bir denetimi örneğini SDS-PAGE tarafından analiz edildi. Analiz açık Oligomerizasyonda desen eşit aralıklı protein şeritli periodate tedavi örnek için sağlam protein olmadan herhangi bir diğer grup denetimi örneğini gösterdi gösterdi.
Resim 1 : Doğrudan basıncın uzarlar katekol, pyruvate ve amonyak birleşme. BASINCIN katekol, pyruvate ve amonyak büyüme orta heterologously ifade TPL tarafından uzarlar var. Gelişmiş tRNA/aaRS çifti için basıncın uzarlar basıncın hedef protein, GFP dahil etmeye birlikte ifade. TPL gen altında bir bünye organizatörü basıncın biyosentezi GFP ifade inducing önce başlatmak için yerleştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : GFP-E90DOPA tasarlanmış biyosentetik sistem tarafından ifade edilen SDS-sayfa ve MALDI-TOF MS analizleri. (A)GFP-E90DOPA 10 mM katekol, 100 mM pyruvate ve 25 mM amonyak huzurunda tasarlanmış biyosentetik sistem tarafından ifade ve Ni-NTA benzeşme Kromatografi tarafından arıtılmış. GFP-WT da karşılaştırma için analiz edildi. Örnekleri Bis-Tris % 4 - % 12 SDS-PAGE tarafından ayrı kaldık ve jel ile Coomassie parlak mavi R-250 lekeli. (B) GFP-E90DOPA, sindirim tryptic basıncın içeren peptid parçasının MALDI-TOF MS analizi. GFP-WT gelen peptid parçası artıkları 86-96 (SAMPEGYVQER) içerir. Glu GFP-WT gelen parçası içinde basıncın ile GFP-E90DOPA gelen peptid parçası yerine geldi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Doğrudan ortaklığın uzarlar basıncın basıncın bir genel genetik birleşme ile karşılaştırılması. Bu paneller GFP-E90DOPA tarafından tasarlanmış biyosentetik sistemi ve genetik birleşme 3 mM basıncın ek pyruvate, amonyak ve katekol olmadan huzurunda ifade göster. (A) protein saf GFP-E90DOPA, ve (B) hücre yoğunluğu 16 h sonra indüksiyon ölçüldü verimleri elde edilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Reaksiyon şeması GFP-E90DOPA bioconjugation. GFP-E90DOPA basıncın dopaquinone dönüştürmek için okside. Dopaquinone içeren protein gergin alkin ile reaksiyon siteye özel protein etiketleme elde eder. Kuluçka dopaquinone içeren protein yüksek bir konsantrasyon uzun bir süre (48 s) adlı protein kendini konjugasyon protein reaksiyonlar üretmek neden olur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Bioconjugation basıncın içeren mutasyona uğramış proteinlerin. (A) SPOCQ reaksiyonlar basıncın içeren protein ile gergin Alkin, ADIBO-Cy5.5. GFP-WT ve GFP-E90DOPA sodyum ile tedavi periodate ve ADIBO-Cy5.5 ile 60 dk için tepki gösterdi. Tepkiler SDS-sayfa ve Coomassie lekeli (üst) tarafından analiz edildi ve floresan (alt) görüntü gösterilir. GFP-E90DOPA (B) Oligomerizasyonda. BASINCIN içeren GFP sodyum ile tedavi edildi periodate ve için 48 saat inkübe. Reaksiyon karışımı SDS-PAGE tarafından analiz edildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol için biyosentezi ve basıncın doğrudan birleşme açıklanmıştır. Bu yöntemde kullanılan bakteri hücre sentez ek bir amino asit ve protein sentezi için doğal olmayan bir yapı taşı olarak kullanabilirsiniz. Doğal olmayan amino asitler genetik birleşme genişletilmiş bir genetik kod ile doğal olmayan organizma gelişimi için anahtar bir teknoloji olmuştur. Ancak, bu yöntem Teknik olarak eksik oldu ve birleşme verimliliği artırmak ve pertürbasyon endojen çeviri sistemleri için en aza indirmek için değişiklik. Son zamanlarda, Yöntem önemli gelişmeler kodon24,25 doğal olmayan amino asitler ve mühendislik ortogonal translasyonel bileşenleri26,27,28 için yeniden atama tarafından elde edilmiş ,29. Ek olarak bu gelişmeler, burada açıklanan sistem genişletilmiş bir genetik kod ile doğal olmayan bir organizma için başka bir yeteneği sunar: doğal olmayan bir amino asit biyosentezi. Bu yeteneği doğal olmayan sistem genişletilmiş bir genetik repertuar ile bir organizma olarak daha fazla bağımsızlık verir. Ayrıca, basıncın düşük protein verim sonuçlanan kullanılan bu yöntemde ve 3 mM basıncın, hücre büyümesi önemli ölçüde azalmış, bakteriyel zorlanma orta toksisite gösterir. Doğrudan birleşme sistemini kullanarak, toksisite düşürüldü ve üç katı protein verimi arttı.
BASINCIN genetik birleşme için kullanılan aaRS mutant orta düzeyde verimlilik ve sadakat vardır ve basıncın düşük bir konsantrasyon Tyr içerir. 18 bu nedenle, basıncın bakteri hücreleri içinde biyosentezi Tyr birleşme önlemek için etkin olması gerekir. TPL tarafından basıncın biyosentezi katekol, amonyak ve pyruvate tersinir bir tepkidir ve başlangıç malzemeleri yüksek konsantrasyonda verimli bir sentezi için gereklidir. Ancak, bu protokol için kullanılan bakteriyel zorlanma için zehirli olduğundan katekol 10 mM üzerinde kullanılamaz. DTT konsantrasyonu da bu protokol için önemlidir. BASINCIN gösterir onun toksisite L-dopaquinone dönüştürülür ve DTT oksidasyon hızı azaltmak için büyüme aracı olarak eklenir. DTT konsantrasyon 300'den fazla µM yaşındayken hücre büyümesini bir düşüş görülmektedir. Bu nedenle, bir en iyi biyosentezi ve basıncın birleşme için bileşenleri (özellikle katekol ve DTT) kültür orta için uygun konsantrasyonlarda bu protokol için açıklandığı gibi kullanılmalıdır.
Bu iletişim kuralı ayrıca siteye özel protein konjugasyon için basıncın içeren proteinlerin uygulamaları açıklar. L-dopaquinone basıncın oksidasyon tarafından etkili bir şekilde oluşturulan bir biyokimyasal sonda bağlantılı bir gergin alkin ile tepki verir. Bu cycloaddition reaksiyon genellikle nükleofilik ek reaksiyonlar aminler veya thiols göre daha hızlıdır. Yine de, basıncın oksidasyonunu basıncın içeren protein ve nükleofilik ek nucleophiles proteini içerisinde en aza indirmek için gergin bir Alkin, varlığında yapılmalıdır. Bu nedenle, reaktifleri ilavesi bu reaksiyon için sırası önemlidir.
Birçok doğal olmayan amino asitler protein konjugasyon için mevcut olup bazıları bir hızlı reaksiyon hızı ve mükemmel konjugasyon verimliliği30,31,32,33ulaşmak. Bu amino asitler biorthogonal fonksiyonel grupların azides, alkynes, gergin alkenes veya alkynes ve tetrazines gibi içerir. Onlar siteye özel protein konjugasyon için yararlı olmasına rağmen hangi uygulamalarında, özellikle büyük ölçekli proteinler arayanlar sınırlar pahalı veya ticari olarak erişilemeyen çoğu. Bu nedenle, basıncın biyosentezi ucuz başlangıç malzeme ve onun doğrudan birleşme biyokimyasal bir sonda veya bir ilaç (antikor-ilaç içeren büyük ölçekli mutasyona uğramış proteinlerin gerektiren ilaç ve endüstriyel uygulamalar için faydalı olacaktır eşlenik, ADC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu araştırma genel sınır araştırma programı (NMK-2015M3A6A8065833) tarafından desteklenen ve temel bilim araştırma programı (2018R1A6A1A03024940) aracılığıyla Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (NMG) Kore hükümeti tarafından finanse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Plasmid Construction | |||
| Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG | optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
| Plasmid pEvol-DHPRS2 | 1. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018). | ||
| DH10β | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
| Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
| Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500 g |
| Ethidium bromide | Alfa Aesar | L07482 | 1 g |
| LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
| 2. Culture preparation | |||
| 2.1) Electroporation | |||
| Micro pulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50 |
| Ampicillin Sodium | Wako | 018-10372 | 25 g |
| Chloramphenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25 g |
| Agar | SAMCHUN | 214230 | 500 g |
| SOC medium | Sigma | S1797 | 100 mL |
| 3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system | |||
| 3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system | |||
| L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100 g |
| Pyrocatechol, 99% | SAMCHUN | P1387 | 25 g |
| Ammonium sulfate, 99% | SAMCHUN | A0943 | 500 g |
| pyruvic acid, 98% | Alfa Aesar | A13875 | 100 g |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99% | SAMCHUN | S0891 | 1 kg |
| Potassium phophate, monobasic, 99% | SAMCHUN | P1127 | 1 kg |
| Magnesium sulfate, anhydrous, 99% | SAMCHUN | M0146 | 1 kg |
| D(+)-Glucose, anhydrous, 99% | SAMCHUN | D0092 | 500 g |
| Glycerol, 99% | SAMCHUN | G0269 | 1 kg |
| Trace metal mix a5 with co | Sigma | 92949 | 25 mL |
| L-Proline, 99% | SAMCHUN | P1257 | 25 g |
| L-Phenylalanine, 98.5% | SAMCHUN | P1982 | 25 g |
| L-Tryptophane | JUNSEI | 49550-0310 | 25 g |
| L-Arginine, 98% | SAMCHUN | A1149 | 25 g |
| L-Glutamine, 98% | JUNSEI | 27340-0310 | 25 g |
| L-Asparagine monohydrate, 99% | SAMCHUN | A1198 | 25 g |
| L-Methionine | JUNSEI | 73190-0410 | 25 g |
| L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99% | SAMCHUN | H0604 | 25 g |
| L-Threonine, 99% | SAMCHUN | T2938 | 25 g |
| L-Leucine | JUNSEI | 87070-0310 | 25 g |
| Glycine, 99% | SAMCHUN | G0286 | 25 g |
| L-Glutamic acid, 99% | SAMCHUN | G0233 | 25 g |
| L-Alanine, 99% | SAMCHUN | A1543 | 25 g |
| L-Isoleucine, 99% | SAMCHUN | I1049 | 25 g |
| L-Valine, 99% | SAMCHUN | V0088 | 25 g |
| L-Serine | SAMCHUN | S2447 | 25 g |
| L-Aspartic acid | SAMCHUN | A1205 | 25 g |
| L-Lysine monohydrochloride, 99% | SAMCHUN | L0592 | 25 g |
| 3.2 Cell lysis | |||
| Imidazole, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1kg |
| Sodium phosphate monobasic, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1 kg |
| Sodium Chloride, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1 kg |
| Ultrasonic Processor - 150 microliters to 150 milliliters | SONIC & MATERIALS | VCX130 | |
| 3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography | |||
| Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | 25 mL |
| Polypropylene column | QIAGEN | 34924 | 50/pack, 1 mL capacity |
| 4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA | |||
| Sodium periodate, 99.8& | Acros | 419610050 | 5 g |
| 5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ) | |||
| Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1mg |
| 6. Purification of Labeled GFP | |||
| Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters | MILLIPORE | UFC500396 | 96/pack, 500ul capacity |
| 7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning | |||
| 1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % | Sigma | 10708984001 | 10 g |
| NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X | Thermofisher | NP0007 | 10 mL |
| MES running buffer | Thermofisher | NP0002 | 500 mL |
| Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels | Thermofisher | NO0321 | 12 well |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25 g |
| G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging System | Syngene | G BOX Chemi XT4 | |
| 8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion | |||
| 8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500 g |
| Hydrochloric acid, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500 mL |
| Dodecyl sulfate sodium salt, 85% | SAMCHUN | D1070 | 250 g |
| Iodoacetamide | Sigma | I6125 | 5 g |
| Trypsin Protease, MS Grade | Thermofisher | 90057 | 5 x 20 µg/pack |
| C-18 spin columns | Thermofisher | 89870 | 25/pack, 200 µL capacity |
| 8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF | |||
| Acetonitirile, 99.5% | SAMCHUN | A0125 | 500 mL |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma | C2020 | 10 g |
| Trifluoroacetic acid, 99% | SAMCHUN | T1666 | 100 g |
| MTP 384 target plate ground steel BC targets | Bruker | 8280784 | |
| Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker |
References
- Nagatsu, T., Levitt, M., Udenfriend, S. Tyrosine hydroxylase: The initial step in norepinephrine biosynthesis. Journal of Biological Chemistry. 239, 2910-2917 (1964).
- Pinder, R. M. Possible dopamine derivatives capable of crossing the blood-brain barrier in relation to parkinsonism. Nature. 228 (5269), 358 (1970).
- Waite, J. H., Tanzer, M. L. Polyphenolic substance of mytilus edulis: novel adhesive containing L-DOPA and hydroxyproline. Science. 212 (4498), 1038-1040 (1981).
- Lee, H., Scherer, N. F., Messersmith, P. B. Single-molecule mechanics of mussel adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 12999-13003 (2006).
- Papov, V. V., Diamond, T. V., Biemann, K., Waite, J. H. Hydroxyarginine-containing polyphenolic proteins in the adhesive plaques of the marine mussel Mytilus edulis. Journal of Biological Chemistry. 270 (34), 20183-20192 (1995).
- Waite, J. H., Qin, X. Polyphosphoprotein from the adhesive pads of Mytilus edulis. Biochemistry. 40 (9), 2887-2893 (2001).
- Nicklisch, S. C., Waite, J. H. Mini-review: The role of redox in DOPA-mediated marine adhesion. Biofouling. 28 (8), 865-877 (2012).
- Silverman, H. G., Roberto, F. Understanding marine mussel adhesion. Marine Biotechnology. 9 (6), 661-681 (2007).
- Lee, B. P., Messersmith, P. B., Israelachvili, J. N., Waite, J. H. Mussel-inspired adhesives and coatings. Annual Review of Materials Research. 41, 99-132 (2011).
- Umeda, A., Thibodeux, G. N., Zhu, J., Lee, Y., Zhang, Z. J. Site-specific protein cross-linking with genetically incorporated 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine. ChemBioChem. 10 (8), 1302-1304 (2009).
- Umeda, A., Thibodeux, G. N., Moncivais, K., Jiang, F., Zhang, Z. J. A versatile approach to transform low-affinity peptides into protein probes with cotranslationally expressed chemical cross-linker. Analytical Biochemistry. 405 (1), 82-88 (2010).
- Xu, J., Tack, D., Hughes, R. A., Ellington, A. D., Gray, J. J. Structure-based non-canonical amino acid design to covalently crosslink an antibody-antigen complex. Journal of Structural Biology. 185 (2), 215-222 (2014).
- Burdine, L., Gillette, T. G., Lin, H. J., Kodadek, T. Periodate-triggered cross-linking of DOPA-containing peptide-protein complexes. Journal of the American Chemical Society. 126 (37), 11442-11443 (2004).
- Borrmann, E., et al. Strain-promoted oxidation-controlled cyclooctyne-1,2-quinone cycloaddition (SPOCQ) for fast and activatable protein conjugation. Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 257-261 (2015).
- Ayyadurai, N., et al. Development of a selective, sensitive, and reversible biosensor by the genetic incorporation of a metal-binding site into green fluorescent protein. Angewandte Chemie International Edition. 50 (29), 6534-6537 (2011).
- Kim, B. J., Cheong, H., Hwang, B. H., Cha, H. J. Mussel-inspired protein nanoparticles containing iron(III)-DOPA complexes for pH-responsive drug delivery. Angewandte Chemie International Edition. 54 (25), 7318-7322 (2015).
- Alfonta, L., Zhang, Z., Uryu, S., Loo, J. A., Schultz, P. G. Site-specific incorporation of a redox-active amino acid into proteins. Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14662-14663 (2003).
- Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chemical Communications. 54 (24), 3002-3005 (2018).
- Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
- Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41 (1), 207-234 (2005).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Jang, S., Sachin, K., Lee, H. J., Kim, D. W., Lee, H. S. Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis. Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2256-2261 (2012).
- Gobom, J., et al. Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid affinity sample preparation. A protocol for MALDI-MS peptide analysis in proteomics. Analytical Chemistry. 73 (3), 434-438 (2001).
- Mukai, T., et al. Highly reproductive Escherichia coli cells with no specific assignment to the UAG codon. Scientific Reports. 5, 9699 (2015).
- Lajoie, M. J., et al. Genomically recoded organisms expand biological functions. Science. 342 (6156), 357-360 (2013).
- Bryson, D. I., et al. Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases. Nature Chemical Biology. 13 (12), 1253-1260 (2017).
- Guo, J., Melancon, C. E., Lee, H. S., Groff, D., Schultz, P. G. Evolution of amber suppressor tRNAs for efficient bacterial production of proteins containing nonnatural amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 48 (48), 9148-9151 (2009).
- Lee, S., et al. A facile strategy for selective phosphoserine incorporation in histones. Angewandte Chemie International Edition. 52 (22), 5771-5775 (2013).
- Neumann, H., Wang, K., Davis, L., Garcia-Alai, M., Chin, J. W. Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome. Nature. 464 (7287), 441-444 (2010).
- Lang, K., Chin, J. W. Bioorthogonal reactions for labeling proteins. ACS Chemical Biology. 9 (1), 16-20 (2014).
- Lang, K., Chin, J. W. Cellular Incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
- Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angewandte Chemie International Edition. 50 (17), 3878-3881 (2011).
- Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. Journal of the American Chemical Society. 134 (6), 2898-2901 (2012).
