Isolatie van volwassen ruggenmerg kernen voor Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing
Summary
Hier presenteren we een protocol om snel isoleren kwalitatief hoogwaardige kernen uit de verse of bevroren weefsel voor downstream massaal parallelle RNA sequencing. Wij omvatten wasmiddel-mechanische en hypotone-mechanische weefsel verstoring en cel lysis van de opties, die beide kunnen worden gebruikt voor isolatie van kernen.
Abstract
Een afzonderlijke cel genexpressie indringende maakt de identificatie van celtype en cel staat. Eencellige RNA sequencing heeft ontpopt als een krachtig hulpmiddel voor de studie van transcriptionele profielen van cellen, met name in heterogene weefsels zoals het centrale zenuwstelsel. Echter, dissociatie methoden die nodig zijn voor het eencellige rangschikken kunnen leiden tot experimentele wijzigingen in de gen-expressie en cel dood. Bovendien, deze methoden zijn over het algemeen beperkt aan verse weefsel, waarbinnen de studies over de archivering en bio-bank materiaal te beperken. Enkele kern RNA sequencing (snRNA-Seq) is een aantrekkelijk alternatief voor transcriptionele studies, gezien het feit dat het nauwkeurig identificeert celtypes, vergunningen van de studie van weefsel dat is bevroren of moeilijk te distantiëren, en vermindert dissociatie-geïnduceerde transcriptie. Hier presenteren we een protocol hoge gegevensdoorvoer voor snelle Isolatievan kernen voor downstream snRNA-Seq. Deze methode maakt Isolatievan kernen van vers of bevroren ruggenmerg monsters en kan gecombineerd worden met twee massaal parallelle druppel inkapseling platforms.
Introduction
Het zenuwstelsel bestaat uit heterogene groepen van cellen die een veelzijdige elektrofysiologische, morfologische en biochemische eigenschappen worden weergegeven. Terwijl de bulk RNA sequencing is nuttig voor het bepalen van weefsel bestrijkende veranderingen in de genexpressie onder verschillende omstandigheden, het verzet zich tegen de detectie van transcriptionele veranderingen op het niveau van één cel. Recente vooruitgang in de eencellige transcriptionele analyse de indeling van heterogene cellen in functionele groepen op basis van hun moleculaire repertoire hebt ingeschakeld en zelfs kunnen worden benut voor het detecteren van sets van neuronen die had onlangs actief geweest. 1 , 2 , 3 , 4 de afgelopen tien jaar heeft de ontwikkeling van eencellige RNA sequencing (scRNA-Seq) de studie van genexpressie in afzonderlijke cellen, die een mening wordt celtype diversiteit. 5
De opkomst van schaalbare benaderingen zoals Seq-massively parallel scRNA, heeft verstrekt platformen op volgorde heterogene weefsels, met inbegrip van vele regio’s in het centrale zenuwstelsel. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 echter eencellige dissociatie methoden kunnen leiden tot de dood van de cel, evenals de experimentele wijzigingen in genexpressie. 16 recent werk heeft aangepast methodes van eencellige sequencing zodat behoud van endogene transcriptionele profielen. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 deze strategieën zijn bijzonder geschikt voor het opsporen van onmiddellijke vroege (IEG) genexpressie na zintuiglijke prikkel of gedrag. 3 , 4 In de toekomst deze strategie kan ook worden gebruikt om dynamische veranderingen in weefsels in ziekte staten of in reactie op spanning te bestuderen. Van deze methoden, één kern RNA sequencing (snRNA-Seq) is een veelbelovende aanpak die geen stress-inducerende cel dissociatie en kan gebruikt worden op de moeilijk te distantiëren van weefsel (zoals het ruggenmerg), evenals bevroren weefsel. 4 , 17 , 18 , 19 aangepast uit de vorige kernen isolatie methoden,20,21,22,23,25 snRNA-Seq meestal maakt gebruik van verstoring van de snelle weefsel en cel Lysis onder koude omstandigheden, centrifugeren en scheiding van de kernen van cellulaire puin. 4 kernen kunnen worden geïsoleerd voor de downstream sequencing van de volgende generatie op meerdere microfluidic druppel inkapseling platformen. 4 , 7 , 24 , 25 deze methode zorgt voor een momentopname van de transcriptionele activiteit van duizenden cellen op een moment.
Er zijn meerdere strategieën voor het vrijgeven van de kernen van cellen voor isolatie en sequencing, elk met hun eigen voor- en nadelen. Hier, we beschrijven en vergelijken van twee protocollen om te schakelen van de isolatie van de kernen van de volwassen ruggenmerg voor de downstream massively parallel snRNA-Seq: wasmiddel-mechanische lysis en hypotone-mechanische lysis. Wasmiddel-mechanische lysis biedt volledige weefsel verstoring en een hogere uiteindelijke opbrengst van kernen. Hypotone mechanische-lysis omvat een beheersbare mate van verstoring van de weefsel, een mogelijkheid voor het selecteren van een evenwicht tussen de hoeveelheid en de zuiverheid van het definitieve nucleaire rendement bieden. Deze benaderingen bieden vergelijkbare RNA opbrengst, gedetecteerde aantal genen per celkern, en celtype profilering en ook kunnen zowel worden gebruikt met succes voor snRNA-Seq.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het uiteindelijke doel van dit protocol is te isoleren van de kernen met kwalitatief hoogwaardige RNA voor downstream transcriptionele analyse. We snRNA-Seq methoden aangepast om alle van de celtypes in het ruggenmerg profile. Aanvankelijk vonden we dat typische cel dissociatie methoden ineffectief voor eencellige RNA sequencing, waren zoals ruggenmerg neuronen bijzonder kwetsbaar voor de dood van de cel zijn. Bovendien veroorzaken cel dissociatie methoden expressie van genen die diverse activiteiten – en stressrespons d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de intramurale programma van NINDS (1 ZIA NS003153 02) en NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Wij danken L. Li en C.I. Dobrott voor hun technische ondersteuning en nuttige discussies en C. Kathe voor de herziening van het manuscript.
Materials
| Sucrose | Invitrogen | 15503-022 | |
| 1 M HEPES (pH = 8.0) | Gibco | 15630-080 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| MgAc | Sigma Aldrich | M1028-10X1ML | |
| 0.5 M EDTA (pH = 8.0) | Corning | MT-46034CI | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 10197777001 | Add DTT just prior to use |
| Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Nuclease-free water | Crystalgen | 221-238-10 | |
| 1 M Tris-HCl (pH = 7.4) | Sigma Aldrich | T2194 | |
| 5 M NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
| 1 M MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Nonidet P40 | Sigma Aldrich | 74385 | |
| Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
| Glutamax (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| B27 (50X) | Gibco | 17504-044 | |
| 1X PBS | Crystalgen | 221-133-10 | |
| 0.04% BSA | New England Biolabs | B9000S | |
| 0.2 U/μL RNAse Inhibitor | Lucigen | 30281-1 | |
| Oak Ridge Centrifuge Tube | Thermo Scientific | 3118-0050 | |
| Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-8B | |
| Glass Tissue Dounce (2 ml) | Kimble | 885303-002 | |
| Glass large clearance pestle | Kimble | 885301-0002 | |
| Glass small clearance pestle | Kimble | 885302-002 | |
| T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer | IKA | 3737001 | |
| Dispersing tool (S 10 N – 5G) | IKA | 3304000 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| MACS SmartStrainers, 30 μm | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Conical tubes | Denville Scientific | 1000799 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004505 | |
| Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor | Thermo Fisher Scientific | 75003698 | |
| Sterological Pipettes: 5 ml, 10 ml | Denville Scientific | P7127 | |
| Hemocytometer | Daigger Scientific | EF16034F | |
| Chemgenes Barcoding Beads | Chemgenes | Macosko-2011-10 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μm) | Corning | 352235 | |
| MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10X Genomics | 120262 | |
| Chromium Single Cell 3’ Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns | 10X Genomics | 120267 | |
| Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns | 10X Genomics | ||
| Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) | Corning | 353002 |
References
- Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).
- Hu, P., et al. Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq. Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).
- Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq. Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).
- Sathyamurthy, A., et al. Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior. Cell Reports. 22 (8), 2216-2225 (2018).
- Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).
- Campbell, J. N., et al. A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types. Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity. Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).
- Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
- Li, C. L., et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Research. 26 (8), 967 (2016).
- Shin, J., et al. Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).
- Villani, A. C., et al. Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors. Science. 356 (6335), (2017).
- Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).
- Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7, 11022 (2016).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).
- Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
- Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
- Halder, R., et al. DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory. Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- . Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing (2018)
- 10X Genomics. . Single Cell 3′ Reagent Kits v2 User Guide. , (2018).
- Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord. Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).
- Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 6031 (2017).
- Bakken, T. E. Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing. bioRxiv. , (2018).
- Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
