Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Visualisering og sporing endogene mRNAs i levende Drosophila melanogaster ægge kamre

Published: June 4, 2019 doi: 10.3791/58545
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1,2
1Biological Sciences Department Hunter College, City University of New York, 2Program in Molecular, Cellular, and Developmental Biology, Graduate Center, City University of New York

Summary

Her præsenterer vi en protokol for visualisering, afsløring, analyse og sporing af endogene mRNA handel i levende Drosophila melanogaster æg kammer ved hjælp af molekylære beacons, spinning Disc confokal mikroskopi, og open source-analyse Software.

Abstract

Fluorescens baserede billedbehandlings teknikker har i kombination med udviklingen i let mikroskopi revolutioneret, hvordan celle biologer gennemfører levende celle billedbehandlings undersøgelser. Metoder til påvisning af RNAs er vokset betydeligt, siden skelsættende studier har kædet den stedspecifikke mRNA-lokalisering sammen med forordningen om genekspression. Dynamiske mRNA-processer kan nu visualiseres via tilgange, der registrerer mRNAs, kombineret med mikroskopi-opsætninger, der er hurtige nok til at fange det dynamiske område af Molekylær opførsel. Molekylær Beacon-teknologien er en hybridiserings baseret tilgang, der er i stand til direkte at påvise endogene udskrifter i levende celler. Molekylære beacons er hårnål-formet, internt quenched, enkelt-nukleotid diskriminerende nukleinsyre sonder, som fluorescerer kun ved hybridisering til en unik Target sekvens. Når det kombineres med avanceret Fluorescens mikroskopi og høj opløsning billeddannelse, de gør det muligt for en til at udføre rumlig og tidsmæssig sporing af intracellulære bevægelse af mRNAs. Selv om denne teknologi er den eneste metode, der er i stand til at afsløre endogene udskrifter, har celle biologer endnu ikke fuldt ud omfavnet denne teknologi på grund af vanskeligheder med at designe sådanne sonder til live Cell Imaging. En ny software applikation, pinmol, giver mulighed for forbedret og hurtig design af sonder bedst egnet til effektivt hybridisere til mRNA mål regioner i en levende celle. Hertil kommer, at høj opløsning, real-time image erhvervelse og nuværende, open source billedanalyse software giver mulighed for en raffineret data output, hvilket fører til en finere vurdering af kompleksiteten underliggende de dynamiske processer, der er involveret i Mrna's livscyklus.

Her præsenterer vi en omfattende protokol til design og levering af molekylære beacons til Drosophila melanogaster ægge kamre. Direkte og meget specifik detektion og visualisering af endogene maternel mRNAs udføres via spinning Disc confokal mikroskopi. Billeddata behandles og analyseres ved hjælp af objekt detektering og sporing i isnende software for at indhente oplysninger om den dynamiske bevægelse af mRNAs, som transporteres og lokaliserede til specialiserede områder inden for oocyte.

Introduction

Cellebiologi undersøgelser, der visualiserer dynamiske hændelser med rumlig og tidsmæssig opløsning, er blevet muliggjort af udviklingen af fluorescens baserede Live Cell Imaging teknikker. I øjeblikket, in vivo mRNA visualisering opnås via teknologier, der er baseret på RNA aptamer-protein interaktioner, RNA aptamer-induceret fluorescens af organiske farvestoffer og nukleinsyre sonde udglødning1,2, 3. de alle tilbyder høj specificitet, følsomhed og signal-til-baggrund ratio. Men RNA aptamer-centrerede tilgange kræver omfattende genetisk manipulation, hvor en transgene er konstrueret til at udtrykke et RNA med kunstige strukturelle motiver, der er nødvendige for protein eller organisk farvestof binding. For eksempel kræver MS2/MCP-systemet Co-ekspression af et transgen, der udtrykker en RNA-konstruktion, som indeholder flere tandem gentagelser af bindings sekvensen for bakteriophage MS2 coat-proteinet (MCP), og et andet transgen, som indkoder et fluorescerende protein smeltet til MCP4,5. Tilføjelsen af sådanne sekundære strukturelle motiver til RNA, sammen med en voluminøse fluorescently Tagged protein, har rejst bekymring for, at indfødte RNA processer kan blive påvirket6. En teknologi, der behandler denne bekymring og tilbyder yderligere unikke fordele er den nukleinsyre-baserede tilgang, molekyle beacons (MBs). MBS giver mulighed for multiplex påvisning af endogene mRNAs, diskrimination af enkelt nukleotid variationer, og hurtig kinetik af hybridisering med mål mRNA7,8. MBs er oligonukleotidprober, der forbliver i en slukket hårnål fold, før de gennemgår en fluorogen konformationel ændring, når de hybridiserer til deres mål (figur 1c)9. Flere grupper har haft succes med at bruge MBS til at detektere både ikke-kodning RNAs (micrornas og lncrnas)10,11,12,13, RNA retrovira14 og dynamisk DNA-protein interaktioner15. De er blevet anvendt med succes til billeddannelse i forskellige organismer og væv, såsom Zebra embryoner16, neuroner13, tumor væv17, differentiere kardiomyocytter18, og salmonella 19.

Her beskriver vi design, levering og detektion tilgang til endogene mRNAs i Living D. melanogaster ægge kamre kombineret med en mikroskopi set-up, der er hurtig nok til at fange den dynamiske række af aktive molekyle transport. D. melanogaster Egg Chamber har fungeret som et ideelt flercellet model system til en bred vifte af udviklingsmæssige undersøgelser, fra tidlig kimcelle stamcelle division og maternel genekspression til generationen af segmental Body plan20, 21. Ægge kamre er let isolerede, store og gennemsigtige, og i stand til at modstå timer af ex vivo analyse, hvilket gør dem meget modtagelig for billeddannelse eksperimenter. Meget arbejde har fokuseret på den asymmetriske lokalisering af mødres udskrifter til diskrete subcellulære regioner forud for at blive aktivt oversat. Især skal Oskar mRNA lokalisering og den efterfølgende oversættelse til oocyte posterior pole ske på en stramt reguleret måde for at undgå et dødbringende, bicaudal embryo fænotype22. Oskar mRNA er transkriberet i de 15 kimcelle celler, kaldet sygeplejerske celler, og aktivt transporteres gennem cytoplasmiske broer, kaldet ring kanaler, i oocyte, den kimcelle celle, der bliver den modne æg og er i sidste ende befrugtet (figur 1a ). Den betydelige mængde oplysninger, der allerede er til rådighed om den dynamiske rekruttering og udveksling af protein faktorer til og fra Oskar mRNP, samt dens langtrækkende intracellulære rejse, gør Oskar til en foretrukken kandidat til at studere de mange processer i mRNA livscyklus. MBs har været medvirkende til at afsløre detaljer om processen med mRNA lokalisering og dechifrere regulering og funktion af protein faktorer, der styrer mRNA transport under Drosophila oogenesis. Især ved mikroindsprøjtning af MBS i sygeplejerske celler og udfører levende celle billeddannelse eksperimenter, sporing af endogene mRNAs er muligt8,23.

Den køreplan, der præsenteres her, indeholder trinnene i en komplet proces, fra udførelse af et live Cell Imaging-eksperiment ved hjælp af MBs, erhvervelse af billeddata, til at udføre dataanalyse for at spore endogene mRNA i dets oprindelige cellulære miljø. Trinene kan ændres og yderligere optimeret til at opfylde behovene hos forskere, der arbejder med andre væv/celletyper inden for deres egen Lab indstilling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. design af MBs til live Cell Imaging

  1. Fold MÅLRNA-sekvensen for at forudsige mRNA-målets sekundære struktur ved hjælp af "RNA-formen" fra mfold -serveren (http://unafold.RNA.Albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-form).
    1. Indsæt/upload målsekvensen i fasta format, Vælg 5 eller 10% sub-Optimality (strukturer med en fri energi til at folde inden for 5 eller 10% af MFE værdi, henholdsvis), og justere det maksimale antal af beregnede foldninger i overensstemmelse hermed (f. eks større for 10% sub-optimalitet).
      Bemærk: medtagelse af sub-optimale sekundære strukturer ved udformning af MBs gør det muligt at identificere regioner inden for målet mRNA, der kan være mere fleksible eller mere stive end som forudset for den mindste frie energi (MFE) struktur alene, hvilket forbedrer samlet design af MBs, som egner sig til levende celle billeder.
    2. Vælg et "øjeblikkeligt job" for mRNA-mål på 800 nukleotider (NT) eller et "batchjob" for mRNA-længder mellem 801 og 8.000 NT. Gem filen "SS-count" som en simpel tekstfil.
  2. Brug "SS-count" fil opnået i trin 1,1 som input til pinmol programmet (https://bratulab.wordpress.com/software/) med de ønskede parametre, at designe flere MBS for mRNA Target (Se tutorials beskriver brugen af pinmol program 24 på https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-Mac/).
    1. Bestem specificiteten af udvalgte MBs ved at udføre BLAST analyse: brug "blastn" med den relevante database (f. eks. for Oskar mRNA-specifikke MBS skal du bruge "refseq-RNA"-databasen og Drosophila melanogaster organismen).
    2. Identificer eventuelle vævsspecifikke udtryk for mRNA-mål (f. eks. for Oskar mRNA flybase > data for højkapacitets ekspression ≫ Flyatlas Anatomy microarray eller modENCODE Anatomy RNA-Seq; http://flybase.org/reports/FBgn0003015) og Sammenlign med nogen positive BLAST hits. Eliminer sonder, der viser > 50% Cross-Homology med andre mRNAs, der også udtrykkes i væv/celle af interesse.
  3. Vælg det fluoroforet-og QUENCHER-par, der passer til den mikroskopi, som er tilgængelig til at udføre Live Cell Imaging (f. eks. Cy5/BHQ2)25.

2. MB syntese, rensning, og karakterisering

  1. Brug in-House syntese og rensning som tidligere beskrevet7, eller tjenester fra kommercielle udbydere, at syntetisere og rense en til fem MBS (se ovenfor note), ved hjælp af følgende mærkningsordning: [5 ' (Fluorophore)-(C3 eller C6 linker)-(2 '-O -methyl MB-sekvens)-(QUENCHER) 3 ']. Rense MBs ved hjælp af reverse-fase HPLC, i hus eller ved hjælp af tjenester fra den kommercielle udbyder.
    Bemærk: De phosphoramiditer, der anvendes til automatiseret sonde syntese skal have 2 '-O-methyl ribonucleotid modifikation. Man kan også bruge kimærer af alternerende låste-nukleinsyre (LNA) og 2 '-O-methyl modifikationer til at øge stabiliteten af en hybrid mellem en kortere MB og dens mål mRNA26.
  2. Syntetisere DNA-oligonukleotider, der matcher sekvensen af den målrettede RNA-region og dermed supplerer sonde regionen MBs, til brug i in vitro -karakterisering (se trin 2,3 til 2,5; ovenfor note). Maksimer hybridisering af MB med DNA-oligonucleotid Target Mimic, ved at medtage i hver ende af DNA Target fire yderligere nukleotider, som findes i målet mRNA sekvens.
    Bemærk: en mere stringent karakterisering af MB effektivitet til at detektere den målrettede sekvens kan udføres ved hjælp in vitro syntetiserede RNA mål i stedet for komplementære DNA oligonukleotider8.
  3. Udfør termisk denaturering af MB alene, mål dens smeltetemperatur (TM), og Bekræft, at MB antager den ønskede hårnål form ved fysiologisk temperatur. Vi har observeret TM værdier mellem 60 og 90 °C.
  4. Udføre termisk denaturering af MB i nærværelse af DNA-oligonucleotid mål og måle MB: DNA Target hybrid TM, som tidligere beskrevet7. En TM mellem 55 og 60 °C ønskes for MB: DNA hybrid.
  5. Udfør in vitro-hybridiserings reaktioner med det tilsvarende DNA-oligonukleotidmål, og bestem effektiviteten af MB: DNA-hybrid dannelse ved fysiologisk temperatur, som tidligere beskrevet7. Hurtig hybridiseringkinetik med DNA-målet efterligne er ønsket, men MBs, der ikke udviser høj hybridiserings effektivitet med DNA-mål, kan have en bedre ydeevne med målet mRNA in vitro og/eller in vivo.

3. dissektion og tilberedning af individuelle Ægkamre til mikroinjektion

  1. Foder nyklækkede, parret hunner i 2-3 dage med frisk gær pasta.
  2. Anæstetize flyver på en CO2 pad og, ved hjælp af fine pincet (Dumont #5), Overfør 1-2 hunner til en dråbe Halocarbon olie 700 på en glas Cover slip.
  3. Ved hjælp af et par pincet, orientere flue med Rygsiden op under en stereomicroscope. Dissekere den kvindelige mave ved at lave et lille snit ved den bageste ende og forsigtigt klemme parret æggestokke i olien.
  4. Forklaringen æggestokkene på en olie dråbe på en ny dækseddel. Hold forsigtigt en æggestok med en pincet, mens du klemte de yngste stadier af ovariet med den anden pincet. Oskar mRNA er aktivt lokaliseret på og efter Mid-oogenesis (etaper > 7), og yngre ægge kamre (etaper < 7) er sværere at injicere og ikke overleve så længe. Træk langsomt på dæksedlen (med en nedadgående bevægelse), indtil de enkelte ovarioler eller ægge kamre er isoleret og justeret lodret. Yderligere adskille enkelt ægge kamre ved at forlede de uønskede stadier fra ovariole æg kæde.
    Bemærk: Sørg for, at individuelt drillede ægkamre ikke flyder i olien, og at de holder sig til dæksedlen. Dette er vigtigt for både vellykket mikroinjektion og billed erhvervelse.

4. mikroinjektion af MBs i sygeplejerske cellerne i ægge kamre

  1. Tilbered MB-opløsningen ved hjælp af et molekyle Beacon (f. eks. osk2216Cy5) eller en blanding af to Mb'er, der er målrettet mod forskellige Mrna'er, og som er mærket med spektralt adskilte fluorophorer (f. eks. osk2216Cy5 og drongo1111Cy3). Brug en koncentration på 200-300 ng/μL hver MB i HybBuffer (50 mM Tris-HCl-pH 7,5, 1,5 mM MgCl2 og 100 mm NaCl). For en cocktail af fire MBS mærket med samme fluoroforet, der er rettet mod den samme mRNA ved 200 ng/μl hver i hybbuffer (f. eks. osk82, osk1236, osk2216). Skru ned for MB-opløsningen umiddelbart før pålæsningen af nålen til mikroinjektion.
  2. Vælg målsætningen. En 40x olie mål anbefales for at finde en passende ægge kammer og til at udføre mikroinjektion.
  3. Monter dæksedlen med dissekeret ægge kammer på mikroskop stadiet. Opdrage målet i fokus position og identificere et ægge kammer i en midt-til-sen udviklingsmæssige fase, der er korrekt orienteret til mikroinjektion (dvs. med AàP aksen vinkelret på nålen spidsen for at give mulighed for nem injektion i en sygeplejerske celle proksimal til oocyt).
  4. Læg en nål (kommerciel eller forberedt i hus27) med ~ 1 μl MB opløsning (Se trin 4,1) og Tilslut den til mikroinjektoren. For mikroinjektioner i D. melanogaster ægge kamre, orientere nålen (Se tabel over materialer) i en vinkel < 45 ° til mikroskopet scenen (f. eks 30 °) for at undgå punktering flere sygeplejerske celler.
  5. Injektoren med indsprøjtningstryk på 500-1000 hPa og et kompensations Tryk på 100-250 hPa (Se tabel over materialer).
  6. Langsomt flytte scenen for at bringe i synsfeltet et område af olie dråbe tomrum af ægge kamre.
  7. Brug micromanipulator joystick, forsigtigt sænke nålen ind i olie dråbe og bringe sin spids i fokus mod periferien af synsfeltet.
  8. Udfør en ' Clean ' funktion for at fjerne luften fra spidsen af nålen og for at sikre, at der er strøm fra nålen.
  9. Bring nålen til hjemmet position og fokusere på ægge kammeret skal microinjiceres, derefter bringe nålen tilbage i fokus og placere den nær kanten af ægget kammer.
  10. Foretag en finjustering af målsætningen Z-position, således at membranen, der adskiller follikel cellerne fra sygeplejerske cellerne, er i fokus.
  11. Indsæt nålen i en sygeplejerske celle og udføre injektion for 2-5 s.
  12. Fjern forsigtigt nålen og træk den tilbage til hjemmepositionen.
  13. Ændre målet til den ønskede forstørrelse for billed erhvervelse (60-63x eller 100x), fokus på ægge kammeret, og begynde erhvervelse.

5. erhvervelse af data ved hjælp af en roterende Disc Confokale mikroskop opsætning

Bemærk: Se tabel over materialer til vores specifikke opsætning.

  1. Konfigurer anskaffelses protokol for at indspille en XYZCt-stak med 8-16-bit-billeder (XYZ = lydstyrke, C = kanal, t = tid).
  2. Vælg laserlinjer til de ønskede kanaler (f. eks. 641 nm laser til Cy5 og 491 nm til GFP) og erhverve kanalerne sekventielt: først fluorescens signalet i hver kanal og derefter ændre Z-positionen for at give mulighed for korrekt samlokaliserings analyse.
  3. Vælg Z-trinnet (f. eks. 0,3 μm) og de øverste og nederste Z-grænser (f. eks. -2 μm til 2 μm).
  4. Indtast anskaffelsestidspunkt og samplingfrekvens (f. eks. hver 15-30 s i op til 1 time).
  5. Indlede erhvervelse.

6. behandling, data analyse for at indhente sporings-og Samlokaliserings oplysninger og udarbejdelse af video filer

  1. Billedbehandling
    1. Download, Udpak og Åbn Icy, en åben fællesskabsplatform for BioImage Informatics (http://icy.bioimageanalysis.org/)
    2. Åbn XYZCt stack erhvervet i trin 5: billede/sekvens > fil > åben.
    3. Konverter stak til ImageJ: ImageJ > værktøjer > konvertere til IJ, har løsrevet tilstand slået til.
    4. Lav en under stak (et udvalg af Z-trin og tidspunkter, der skal analyseres yderligere): ImageJ > Billede > stakke > værktøjer > gøre under stak...; Vælg de ønskede kanaler, Z-trin og tidspunkter.
    5. Gem under stakken som TIFF-fil: ImageJ > fil > Gem som > TIFF...; Brug denne fil til efterfølgende trin.
    6. Opdelte kanaler: ImageJ > Billede > farve > opdelte kanaler.
    7. Fratræk baggrund enten ved hjælp af en baggrunds stak: ImageJ > proces > billed beregner..., eller ved hjælp af rulle bolden option: ImageJ > proces > trække baggrund..., skal du vælge den rullende kugle radius. Få vist billedet for den valgte radius, før du vælger "Accepter".
      Bemærk: baggrunds signalet vil primært opstå som følge af forkert slukning af flurorophore. Signalet: baggrunds forholdet (s:b) bruges ofte som en indikator for en MB "lysstyrke", og det måles fra in vitro hybridisering eksperimenter af MB og DNA-mål oligonukleotid. F. eks. har MBs osk1236 og osk2216 henholdsvis en S:B på ~ 81 og ~ 120.
    8. Juster lysstyrken og kontrasten for hver kanal: ImageJ > Billede > justere > lysstyrke/kontrast, skal du vælge Anvend.
    9. Gem hver kanal som en separat TIFF-fil: ImageJ > fil > Gem som > TIFF....
    10. Flet de to kanaler: ImageJ > Billede > farve > flette kanaler...; Vælg kanalerne. Gem den nye stak som en ny TIFF-fil (Se trin 6.1.8).
  2. Spot detektering og sporing
    1. Konverter tilbage til Icy: ImageJ > værktøjer > konvertere til Icy.
    2. En skala bar er automatisk overlagt på stakken ved konvertering til Icy, hvis skalaen bar plugin er installeret [Søg ved hjælp af plugins > Setup > online plugin]. Hvis det er nødvendigt, redigere skalaen bar via inspektør vindue (højre side af skærmen) > fanen lag > navn > skala bar.
    3. Fravælg/Deaktiver ikonet for "Eye" for skala linje fra fanen lag > navn for at fjerne skaleringslinjen fra den oprindelige stak. Det kan genaktiveres på den endelige stak.
    4. Gem den nyligt behandlede stak ved at tage et screenshot ved hjælp af "kamera" ikonet fra billedvinduets menulinje, "Tag et screenshot af nuværende visning" og fil > gemme som > TIFF....
    5. Bestem staffage følsomhed, hvis spot følsomheds parametrene allerede er fastlagt, skal du gå til trin 6.2.7.
    6. Find pletter: Vælg det vindue med billedet eller stakken, der skal analyseres, detektering & sporing > detektion > spot detektor, og udfyld indstillingerne parametre:
      1. For input skal du vælge "currentSequenceInputDetection" (standard).
      2. Til forbehandling skal du vælge "kanal 0" (standard) eller den ønskede kanal ved at krydsreferere tallet i vinduet Inspector > sekvens fane.
      3. For detektor, Vælg "Find Bright spot over mørk baggrund;" brug "Force brug af 2D bøller til 3D" kun hvis der ikke er nok Z-skiver i stakke til at udføre analysen. Vælg "Scale (s)" og "følsomhed" for hver skala (Tilføj flere skalaer for større pletter). Skalaen og følsomheden (jo større tallet er, jo mere følsom er detektionsværdien, et maksimum på 140 foreslås af isnende) er prøve-og fejl variabler, der skal kontrolleres visuelt bagefter og besluttes.
      4. For region af interesse, brug "ROIfromSequence" (standard).
      5. Til filtrering skal du bruge "Nofiltrering" (standard) eller vælge "SizeFiltering" for at definere "rækken af accepterede objekter (i pixels)".
      6. Output: Vælg XLS eller XML output indstilling (Vælg XML-format, når du bruger 2007 MS Excel eller tidligere, og der er > 65000 pletter). Hvis spot detektorens resultater bruges til sporings analysen, skal du også vælge "Eksporter til SwimmingPool".
      7. Gentagelse påvisning af pletter ved hjælp af forskellige skala/følsomhed værdier, indtil alle eller de fleste af pletter er detekteret. Optag alle de endelige parametre.
      8. For samlokaliserings analyse skal du gentage spot registrering for den anden kanal.
    7. Hvis du vil spore pletter, skal du vælge registrering & sporing > sporing > spot sporing > køre spot detektoren med parametre fra trin 6.2.6., eller Brug rullemenuen "Vælg detekterings resultater her" for at vælge et eksisterende datasæt (for dette skal du holde spot detektor vinduet åben fra trin 6.2.5). Tryk på knappen "estimat parametre", og vælg den ønskede bevægelses bevægelse i pop op-vinduet med parametre, der estimerer (f. eks. "er både diffusiv og instrueret"). Tryk på knappen "Kør sporing".
    8. Gentag spot registrering og sporing for andre kanaler ved sporing af pletter på flere kanal stakke, efter trin 6.2.6 og 6.2.7, begyndende med stakken genereret fra trin 6.2.7.
    9. Hvis du vil visualisere spor, skal du vælge registrering & sporing > sporing > track Manager – dette vindue åbnes automatisk, når der er udført en sporings kørsel. For "farve spor processor" skal du vælge "Aktivér" og vælge den ønskede gengivelse af farve til sporene. Relevante spor processorer kan tilgås via "Tilføj track processor..." rullemenu (f. eks. Vælg "track processor time Clip", Aktivér vinduet "track Clipper", og vælg det ønskede antal detektioner, der skal vises før og efter det aktuelle tidspunkt.)
    10. Gem spor oplysninger som en XML-sporfil: registrering & sporing > sporing > track Manager > fil > Gem som....
    11. Gem resultater ved at tage et screenshot ved hjælp af "kamera"-ikonet fra billedvinduets menulinje, "Tag et screenshot af aktuel visning". Screenshots kan tages med de fundne pletter og/eller sporene blot ved at aktivere/deaktivere det tilsvarende øjeikon (r) fundet i Inspector vindue > Layer fanen > navn > overlay wrapper.
    12. Installer tidsstempel overlay plugin: plugins > Setup > online plugin > tidsstempel overlay > installere.
    13. Tilføj tidsstempel: plugins > tidsstempel overlay (ny). Følg instruktionerne i pop op-vinduet (nederste højre hjørne af skærmen) for anvisninger om placering og formatering af tidsstemplet. Tidsintervallet kan tilføjes/ændres i vinduet Inspector > sekvens fanen > sekvens egenskaber > redigere.
    14. Gem resultater ved at tage et andet skærmbillede. Gem billede som 1) TIFF-format, og 2) som AVI-format; for AVI format først konvertere til RGB rendering (billede/sekvens > rendering > RGB-billede).
    15. Roter billede til den ønskede retning: inspektør vindue > sekvens fane > lærred > rotation.
    16. Gem roteret billede ved at "tage et screenshot af den aktuelle visning". Sørg for, at "Eye" ikonet for skala bjælken er fravalgt, da det også vil rotere med billedet.
    17. Vælg og Beskær ROI: Vælg område af interesse > 2D ROI > Vælg ROI Shape og derefter oprette/tegne ROI på billedet; Billede/sekvens > plan (XY) > fast afgrøde.
  3. Analyse af samlokalisering
    1. Udarbejde en samlokaliserings protokol; der findes flere eksempler på det iskolde websted (http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/List) (Se supplerende materialer).
    2. Indlæs samlokaliserings protokol: værktøjer > scripting > protokoller > indlæse og justere parametre i de interagerende blokke (f. eks. i "Wavelet spot afsløring"-parametre for brug af blokke, som er fastlagt i trin 6.2.6.).
    3. Mål størrelsen af en partikel i pixels, bestem samlokaliserings afstanden og input den til "Colocalizer" blok som "Max distance."
      Bemærk: Størrelsen af partiklen i pixels afhænger af detekterings systemet. For at målestørrelse, zoome ind på en enkelt partikel og manuelt tælle de pixels, der spænder over bredden af signalet på tværs. Gennemsnitlige målinger fra mindst tre partikler. Den maksimale afstand, der skal indstilles for samlokalisering, er partikelstørrelsen i pixels (dette repræsenterer den maksimale sum af radius af to partikler, der rører).
    4. Hvis det ønskes, skal du vælge en eller flere ROIs til samlokaliserings analyse: interesseområde > 2D ROI > vælge ROI Shape > tegne ROI på billedet.
    5. Afgrøde ROI (s): image/sekvens > plane (XY) > fast afgrøde.
    6. Udfør samlokalisering: protokoller Editor vindue > valgte protokol fane > køre. Den sidste blok i protokoller Editor vindue vil indeholde samlede samlokaliserings procent baseret på spot Detection, mens oplysninger på hvert tidspunkt kan findes i vinduet Inspector > output fane.
    7. Spor colokaliserede og enkelte partikler ved at følge trin 6.2.7 (spor pletter).
    8. Gem som beskrevet i trin 6.2.16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjælp af Pinmolkan flere mb'er designes til ét mRNA-mål (figur 1b-C). Efter syntese og rensning er de valgte MBs karakteriseret og sammenlignet ved hjælp af in vitro-analyse.

Figure 1
Figur 1: Beskrivelse af teknik og væv til levende celle billeder af endogene Mrna'er. (A) skildring af en mid-Stage Drosophila ægge kammer anvendes til mikroinjektion. Mikroinjektionsnål (grøn) leverer en cocktail af molekylære beacons, der er specifikke for Oskar mRNA. En hurtig injektion i en sygeplejerske celle muliggør påvisning af mRNAs i transit til oocyte, samt visualisering af allerede lokaliseret mRNA ved posterior cortex. (B) pinmol software output af Molekylær Beacon ranking for målretning Oskar mRNA (C) sekundær struktur region inden for Oskar mRNA målrettet af en molekyle Beacon. (C ') Sekvens og foldning af Oskar-specifikke molekylære Beacon, osk2216. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Efter optimal ydeevne af MBs er bekræftet via in vitro karakterisering, sonder anvendes til levende visualisering af endogene mål mRNA (s). Det er muligt at visualisere mønstre af Oskar mRNA transport og lokalisering på forskellige stadier af oogenesis, og især på og efter Mid-oogenesis (7-10) (figur 2a-B). På grund af deres lille størrelse, er det vanskeligt at injicere ægge kamre i meget tidlige stadier (1-4). Når de indsprøjtes individuelt i samme fase, præsenterer Oskar-specifikke MBS de samme lokaliseringsmønstre (figur 2, osk1236 vs osk2216).

Figure 2
Figur 2: tidssekvens af Oskar mRNA i vildtype ægge kammer ved t = 0, 10, og 30 min tid point, efter påbegyndelse af erhvervelse. Sygeplejerske celle injektioner af to Oskar-specifikke molekylære beacons (osk1236 og osk2216) i (A) Stage 6-7 ægge kamre og (B) Stage 9 ægge kamre. Skala bjælke = 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Forskellige mRNA-mål kan samvisualiseres ved hjælp af spektralt adskilte fluorescently-mærkede MBs (figur 3). MB-opløsningen kan mikroinjiceres i en sygeplejerske celle (figur 3a) eller i oocyt (figur 3b). MBs injiceres i en sygeplejerske cellens cytoplasma vil frit diffus i de andre sygeplejerske celler samt i oocyte, og dermed er i stand til at finde deres mål og generere fluorescens signal på andre steder end mikroinjektion site. For eksempel, når du udfører mikroinjektioner i en sygeplejerske celle i en sen oogenesen Stage (9-10) ægge kammer, det meste af fluorescens signalet visualiseret i oocyt genereres af den allerede lokaliseret Oskar mRNA, og mindre ved aktivt transporteret udskrifter, som er mere udbredte i tidligere faser (7-8). Bemærk, at klassiske MBs vil give anledning til ikke-specifik signal inden for kerner, derfor begrænser analysen til de cytoplasmiske regioner i ægge kammeret. Yderligere modifikationer, såsom neutravidin eller guld nanopartikler, har været ansat til at reducere eller eliminere dette ikke-specifikke signal28,29. På trods af dette nukleare ikke-specifikke signal, er specificiteten af MBs for in vivo påvisning af Oskar mRNA blevet fastlagt ved hjælp af en fret approach8, og MB Co-injektion med in vitro transkriberet Oskar mRNA mærket med en fluoroforet spectrally adskiller sig fra MB s etiket23.

Figure 3
Figur 3: Co-visualisering af to mRNA-arter i levende ægge kamre. Co-injektioner af Oskar-og Drongo-specifikke molekylære beacons i (A) sygeplejerske celle og (B) oocyt af Stage 8-9 ægge kamre. Oskar (rød) og Drongo (grøn) mRNAs colocalize ved den bageste ende af oocyt (Asterix), og Drongo viser også dorso-anterior akkumulering (Arrowhead). Skala bjælke = 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

For mRNA-mål, der viser lave ekspressionsniveauer, øges fluorescens signalet pr. mRNA-molekyle ved at injicere en cocktail opløsning, der indeholder mindst to Mb'er, som hver binder sig til forskellige målregioner (figur 4 og 5).

Figure 4
Figur 4: visualisering af Oskar mRNA med både MBS og MS2-gfp-system. Mikroinjektioner af en MB cocktail Solution (MB) i et ægge kammer, der udtrykker OSK-MS2:: MCP-gfp30 (gfp). Efter mikroinjektion af en sygeplejerske celle, blev billeder erhvervet hver 30 s for 20 min. To regioner af interesse blev udvalgt, en ROI i en sygeplejerske celle og en i oocyte. Forskellige følsomhed blev brugt for hver ROI til at detektere pletter. ROI sygeplejerske celle: skala 2, følsomhed 100 for GFP og MB. ROI oocyte: skala 2, følsomhed 50 for GFP og 110 for MB. Samlokaliserings afstanden er 4 pixels for begge ROIs. Hele ægge kammeret og zoom ind på sygeplejerske cellen vises ved 12 minutters tidspunkt, og zoom ind på oocyt vises på 14 minutters tidspunkt. MB pletter (røde cirkler) og GFP pletter (grønne cirkler) identificerer Oskar mRNA partikler detekteret af hver tilgang, og de colokaliserede partikler (gul) angiver, hvor MB og gfp pletter er højst 4 pixels fra hinanden. XY-projektioner af 14 Z optiske skiver ved 0,3 μm trin. Erhvervet som 16-bit data med en 63x mål (olie, NA = 1,4), XY = 0,24 μm, eksponeringstid 500 MS, på 5,23 og 5,39 mW Laser effekt for henholdsvis 641 nm og 491 nm laser. Scale bar = 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: sporings analyse i oocyte, efter sygeplejerske celle mikroinjektion med Oskar mRNA-specifikke MBS. Der blev fundet MB partikler i skala 2 med følsomhed 110, og 8 tidspunkter vises før/efter den aktuelle tidsramme. MB pletter (røde cirkler) spores i volumen af oocyte; spor repræsenterer detekterings oplysninger fra 8 tidspunkter før/efter den viste 12 minutters tidspunkt. Hver farve repræsenterer et individuelt spor. XY-projektioner af 14 Z optiske skiver ved 0,3 μm trin. Scale bar = 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Når man sammenligner handel med Oskar mRNA som detekteret med MBS vs MS2/MCP, er fluorescens signalet genereret af Oskar-specifikke MBS trofast dokumenter om transport og lokalisering af transgene Oskar mRNA mærket med 10 gfp molekyler via MS2/MCP-systemet (figur 4). I Oskar-MS2/MCP-GFP transgene Egg Chambers ved Mid oogenesis, analyse af anskaffelses data viste omfattende samlokalisering mellem fluorescerende signaler af genetisk manipulerede Oskar-MS2 mRNA detekteret ved hjælp af MBS og gfp-tagging . Ved 12 og 14 min efter injektion, 57% (7 MB-objekter og 13 GFP-objekter, med 4 colokaliserede objekter) og 93% (30 MB-objekter og 51 GFP-objekter, med 28 colokaliserede objekter) af detekterede MB partikler colokaliserede med GFP partikler i sygeplejerske celler og oocyte, Henholdsvis. Vores analyse giver 31% og 55% colokaliserings procenter af Oskar-MS2 mRNA med Oskar mRNA detekteret med MBS inden for cytoplasmaet i en sygeplejerske celle og oocyte, hhv. Desuden, 5D-stakke kan analyseres yderligere for at bestemme Oskar mRNA forløbskurver for langdistance transport i både sygeplejerske celle og oocyt cytoplasma (figur 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Live visualisering af endogene mRNA-handel i Drosophila Egg Chambers er afhængig af brugen af specifikke, effektive og nukleaseresistente MBS, som nu let kan designes med pinmol -software. MBs er specifikke sonder designet til at detektere unikke sekvenser inden for et mål mRNA (fortrinsvis regioner fri for sekundær struktur), hvilket gør det muligt meget løst påvisning af en udskrift. Den eneste begrænsning, når der vedtages denne teknik/protokol for andre væv/celletyper er effektiviteten af MB levering til prøven af interesse. Mens andre tilgange kræver genetisk manipulation af vævet til at udtrykke en aptamer og et RNA-bindende protein mærket med et fluorescerende protein til at visualisere et mål mRNA (f. eks MS2/MCP system), multiplexing er muligt for, højst, to udskrifter. MB teknologi står alene for at opdage endogene mRNAs i levende celler, og det er den eneste teknik, der tillader Co-visualisering af mere end to mRNA arter.

MBS kan mærkes med en bred vifte af fluorescerende fugt og er stabile i det cellulære miljø, når syntetiseres fra modificerede nukleotider såsom 2 '-O-methylribonucleotides eller låste-nukleinsyrer26,31. Disse backbone modifikationer også øge MBs ' affinitet for deres mål. Flere MBs kan nemt designes til mål mRNAs af gennemsnitlig længde. Der kan dog forekomme visse begrænsninger for korte og/eller meget strukturerede mål. Dette kan overvindes ved at vedtage vores små molekylære beacons, for hvilke Probe regionen er omtrent halvdelen af længden af en klassisk MB sonde31. Afhængigt af prøve typen leveres MBS til celler via elektroporation, der linker til celle penetratingspeptider, lipofection eller mikroinjektion23,32,33,34. En MB ydeevne effektivitet i levende celle billeddannelse eksperimenter hælder på evnen af sonde sekvensen at hybridisere til den tilsvarende komplementære sekvens inden mRNA mål, som bestemmes af målstrukturen. Den forudsagte MFE RNA sekundær struktur opnået ved hjælp af i n vitro målt termodynamik parametre er værdifuldt i vurderingen af Target tilgængelighed, men i sidste ende er det in vivo Target struktur og Target interaktion med andre cellulære faktorer, der vil bestemme MB ' s egnethed til live Cell Imaging. Genom-dækkende analyse af RNA sekundær struktur tyder på, at mange RNAs er mindre struktureret in vivo end in vitro35. Selvom effektiviteten af in vivo Target Detection ved hjælp af MBs hovedsageligt afhænger af tilgængeligheden af bindingsstedet, vil optimering af visse MB-funktioner sikre en forbedret visualisering af mRNA-målet. Specifikt skal der udføres en omhyggelig udvælgelse af følgende parametre: 1) sonde længden kan variere mellem 18 og 26, således at sondens nukleotidsammensætning er mellem 31 og 55% GC-par i målet: MB hybrid, 2) 5 BP Stem-sekvensen skal være G/C rig, at opretholde hårnål form i fravær af mRNA mål og for at give mismatch forskelsbehandling, 3) en modificeret rygrad bør anvendes til beskyttelse mod nukleaser af både MB og Target: MB hybrid, 4) fluorophore/QUENCHER pair kan tilbyde en ekstra moderat stabilitet til MB 's stilk, og 5) fluoroforet skal være stabil under lange billedtids intervaller. Desuden, klassiske MBs normalt genererer et nukleart ikke-specifikt signal34, som i vores tilfælde kun moderat påvirker databehandling og analyse. Men for mRNA handel visualisering på cellulær niveau, kan dette ikke-specifikke signal blive problematisk. Flere grupper har foreslået modifikationer eller Tags, såsom tRNA, peptider og nanopartikler, som forhindrer levering af MBS i kernen og dermed eliminere dette mulige ikke-specifikke signal33,36.

Den største ulempe ved denne tilgang har været den manuelle udformning af MBs for Live Cell Imaging. For at løse dette, har vi skrevet et Python-baseret program (pinmol), der let identificerer tilgængelige mål sites inden for en mRNA ved at overveje suboptimale sekundære strukturer i tillæg til MFE, samt designs hårnål sonder, som er bedst egnet til påvisning af mRNAs i levende celler24. Pinmol bruger strukturelle oplysninger fra sekundære strukturer af Target RNA forudsagt via energi minimering tilgange, og ved at medtage oplysninger fra suboptimale strukturer, fleksibilitet eller stivhed i specifikke målrettede regioner er vurderes ved design af MBs. Det tager hensyn til tilgængeligheden af de målrettede regioner, samt de Inter-og intramolekoleculære interaktioner af hver udvalgt sonde. Desuden bør stærkt regulerede strækninger af RNA (f. eks. bindingssteder for Mikrornaer eller RNA-bindende proteiner) ikke betragtes som målområder, når der vælges sonder, da disse regioner kan medføre ineffektiv binding af MBs. Brugeren kan evaluere og eliminere sonder rettet mod disse websteder eller begrænse målområdet, som Pinmol bruger til at designe sonder, så det ikke omfatter sådanne websteder. Den relative kapacitet af pinmol blev påvist ved at sammenligne rangeringen af pinmol -designede MBS med de eksperimentelle resultater af manuelt designede MBS24. Pinmol udvalgte og designede MBS for lignende målregioner samt identificerede nye tilgængelige steder på mRNA. Dette er afgørende for påvisning af lav kopiantal udskrifter, hvor det fluorescerende signal skal øges over baggrunden. Ved at skalere op MB numre, der effektivt hybridisere til flere tilgængelige steder på et mål mRNA, signal forstærkning kan opnås. Derfor, dette program letter en hurtig tilgang til at designe flere MBs per mål mRNA, og samtidig visualisere talrige mRNAs i en levende celle.

For at opnå høj kvalitet 5D (XYZCt) erhvervelse data af transporterede mRNAs i ægget kammer, korrekt dissektion af individuelle ægge kamre og effektiv mikroinjektion i sygeplejerske celler er kritiske. For undersøgelser i de tidlige stadier af udviklingen kan mikroinjektion være skadelig for ægkammerets levedygtighed, og dermed forkortes længden af et levende celle billedbehandlings eksperiment (< 20 min). En øget succesrate for mikroinjektion eksperimenter kan sikres ved hjælp af kommercielt tilgængelige ultrafine nåle. Desuden er en hurtig opsætning af anskaffelses indstillingerne vigtig, så de tidlige tidspunkter efter injektionen kan fanges. Kvaliteten af spot detekterings-og sporingsdata vil kun være så god som kvaliteten af de erhvervede billeder.

Ved billed erhvervelse er det vigtigt, at de efterfølgende analyse trin også gennemføres omhyggeligt og præcist. Selv om behandling og analyse efter anskaffelsen giver deres egne vanskeligheder, kan de strømlines ved at vælge den relevante software til ens særlige eksperiment eller prøve. Nuværende eksisterende programmer omfatter Volocity (PerkinElmer), Imaris (Bitplane), ImageJ/Fiji og Icy37. Af de tre, er Icy tilbyder flere fordele, da det er en åben fællesskabsplatform, der giver mulighed for, både behandling (via ImageJ) og analyse af billeddannelse data. Her beskriver vi de trin, som er nødvendige for effektiv behandling og analyse af RNA-billeddata ved hjælp af isnende. Vores resultater er repræsentative for data opnået ved at medvisual Isere to mRNA-arter i et helt ægge kammer og ved at spore en mRNA via MB-teknologien og MS2/MCP-systemet.

Behandlingen efter anskaffelsen med Icy software giver brugeren fleksibilitet i billedbehandlingen (f. eks. lysstyrke, kontrast) og analyse (f. eks. tærsklerne/cut-offs-indstillingerne for følsomhed for påvisning af fluorescerende partikler som pletter) . Icy gør det også muligt for kontrol relevante parametre inden for hver blok af protokollerne Editor Run (f. eks bestemme lokaliseringen afstand og bruge det som "Max distance" i "Colocalizer" blok). Icy software er opdateret ved lanceringen, og har pålidelig online support til fejlfinding af eventuelle problemer. Den beskrevne protokol blev designet til påvisning af Oskar mRNA, og de repræsentative resultater blev opnået ved hjælp af parametre, der er optimeret til den slags mRNA-partikel, der skal detekteres og spores. For eksempel er Oskar mRNA en rigelig afskrift, der overvejende transporteres i midten af oogenesis, udnytte mikrotubulus netværk og dynamisk at knytte med forskellige protein faktorer i hele udviklingen af oocyte. Vi rapporterede tidligere, at Oskar mRNP gennemgår omfattende remodeling under transport fra sygeplejerske cellerne til oocyt23. Desuden, ved hjælp af MBs vi karakteriserede de tidsmæssige og rumlige karakteristika af endogene Oskar mRNA handel, og fandt, at hundredvis af Oskar afskrift eksemplarer kan inkorporeres til at danne store Oskar mrnps.

Analyse efter erhvervelse for samlokalisering og sporing kan også udføres ved hjælp af anden software som Imaris, ImageJ/Fiji og Volocity. Icy blev valgt for sin evne til at tærskel og anmærkere fluorescerende partikler med høj følsomhed og tracking kapaciteter. Her beskriver vi objekt baseret samlokalisering, men samlokalisering, omend uden sporing, kan også kvantificeres ved at bestemme overlapningen og graden af samlokalisering ved hjælp af PCC (Costes)-analyse ved hjælp af Icy og ImageJ plugins (Colokaliserings Studio, JACoP) 38 , 39.

I fremtiden, en optimeret, langsigtet Imaging protokol ønskes for at sikre udvidet æg kammer overlevelse. Dette ville give længere erhvervelse med henblik på at analysere data vedrørende langtrækkende mRNA handel undersøgelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikt at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Salvatore A.E. Marras (Public Health Research Institute Center, Rutgers University) for syntese, mærkning og rensning af molekylære beacons, og Daniel St Johnston (Gurdon Institute, University of Cambridge) for Oskar-MS2/ MCP-GFP transgene flyve bestand. Dette arbejde blev støttet af en National Science Foundation CAREER Award 1149738 og en professionel personale kongres-CUNY Award til DPB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectrofluorometer Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon n/a Photon counting spectrofluorometer
Quartz cuvette Fireflysci (former Precision Cells Inc.) 701MFL
Dumont #5 tweezer World Precision Instruments 501985 Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers
Halocarbon oil 700 Sigma-Aldrich H8898
Cover slip No.1 22 mm x 40 mm VWR 48393-048
Dissecting microscope Leica MZ6 Leica Microsystems Inc. n/a
CO2 fruit fly anesthesia pad Genesee Scienific 59-114
Tris-HCL pH 7.5 Sigma-Aldrich 1185-53-1
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 7791-18-6
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
Spinning disc confocal microscope Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc. n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera Hamamatsu n/a
PatchMan NP 2 Micromanipulator Eppendorf Inc. 920000037
FemtoJet Microinjector Eppendorf Inc. 920010504
Injection needle: Femtotips II Eppendorf Inc. 930000043
Loading tip: 20 μL Microloader Eppendorf Inc. 930001007
Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22 mm x 40 mm VWR 48393-026; 48393-172
Dry yeast Any grocery store n/a
Computer, > 20 GB RAM Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nature Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
  2. Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 11, 25-47 (2009).
  3. Mannack, L. V., Eising, S., Rentmeister, A. Current techniques for visualizing RNA in cells. F1000Research. 5, (2016).
  4. Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene. Science. 332 (6028), 475-478 (2011).
  5. Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
  6. Garcia, J. F., Parker, R. MS2 coat proteins bound to yeast mRNAs block 5' to 3' degradation and trap mRNA decay products: implications for the localization of mRNAs by MS2-MCP system. RNA. 21 (8), 1393-1395 (2015).
  7. Bratu, D. P. Molecular beacons: Fluorescent probes for detection of endogenous mRNAs in living cells. Methods in Molecular Biology. 319, 1-14 (2006).
  8. Bratu, D. P., Cha, B. J., Mhlanga, M. M., Kramer, F. R., Tyagi, S. Visualizing the distribution and transport of mRNAs in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 100 (23), 13308-13313 (2003).
  9. Tyagi, S., Kramer, F. R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nature Biotechnology. 14 (3), 303-308 (1996).
  10. Chen, M., et al. A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level. Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).
  11. Liu, Y., et al. Multiplex detection of microRNAs by combining molecular beacon probes with T7 exonuclease-assisted cyclic amplification reaction. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 107-114 (2017).
  12. Baker, M. B., Bao, G., Searles, C. D. In vitro quantification of specific microRNA using molecular beacons. Nucleic Acids Research. 40 (2), e13 (2012).
  13. Ko, H. Y., et al. A color-tunable molecular beacon to sense miRNA-9 expression during neurogenesis. Scientific Reports. 4, 4626 (2014).
  14. Vet, J. A., et al. Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 96 (11), 6394-6399 (1999).
  15. Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. Molecular beacons for protein-DNA interaction studies. Methods in Molecular Biology. 429, 209-224 (2008).
  16. Li, W. M., Chan, C. M., Miller, A. L., Lee, C. H. Dual Functional Roles of Molecular Beacon as a MicroRNA Detector and Inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3568-3580 (2017).
  17. Kuang, T., Chang, L., Peng, X., Hu, X., Gallego-Perez, D. Molecular Beacon Nano-Sensors for Probing Living Cancer Cells. Trends in Biotechnology. 35 (4), 347-359 (2017).
  18. Ban, K., et al. Non-genetic Purification of Ventricular Cardiomyocytes from Differentiating Embryonic Stem Cells through Molecular Beacons Targeting IRX-4. Stem Cell Reports. 5 (6), 1239-1249 (2015).
  19. Hadjinicolaou, A. V., Demetriou, V. L., Emmanuel, M. A., Kakoyiannis, C. K., Kostrikis, L. G. Molecular beacon-based real-time PCR detection of primary isolates of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis in environmental and clinical samples. BMC Microbiology. 9, 97 (2009).
  20. McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. Drosophila melanogaster Oogenesis: An Overview. Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).
  21. Bastock, R., St Johnston, D. Drosophila oogenesis. Current Biology. 18 (23), R1082-R1087 (2008).
  22. Rongo, C., Gavis, E. R., Lehmann, R. Localization of oskar RNA regulates oskar translation and requires Oskar protein. Development. 121 (9), 2737-2746 (1995).
  23. Mhlanga, M. M., et al. In vivo colocalisation of oskar mRNA and trans-acting proteins revealed by quantitative imaging of the Drosophila oocyte. PLoS One. 4 (7), e6241 (2009).
  24. Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P., Catrina, I. E. PinMol: Python application for designing molecular beacons for live cell imaging of endogenous mRNAs. bioRxiv. , (2018).
  25. Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes. Nucleic Acids Research. 30 (21), e122 (2002).
  26. Bratu, D. P., Catrina, I. E., Marras, S. A. Tiny molecular beacons for in vivo mRNA detection. Methods in Molecular Biology. 714, 141-157 (2011).
  27. Dean, D. A. Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection. Cold Spring Harbor. 2006 (7), (2006).
  28. Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
  29. Jackson, S. R., et al. Applications of Hairpin DNA-Functionalized Gold Nanoparticles for Imaging mRNA in Living Cells. Methods in Enzymology. 572, 87-103 (2016).
  30. Zimyanin, V. L., et al. In vivo imaging of oskar mRNA transport reveals the mechanism of posterior localization. Cell. 134 (5), 843-853 (2008).
  31. Catrina, I. E., Marras, S. A., Bratu, D. P. Tiny molecular beacons: LNA/2'-O-methyl RNA chimeric probes for imaging dynamic mRNA processes in living cells. ACS Chemical Biology. 7 (9), 1586-1595 (2012).
  32. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA. Nucleic Acids Research. 36 (12), e69 (2008).
  33. Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Research. 32 (6), e58 (2004).
  34. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells. Nucleic Acids Research. 35 (16), e105 (2007).
  35. Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review of Genetics. 50, 235-266 (2016).
  36. Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).
  37. Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).
  38. Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
  39. Trcek, T., et al. Drosophila germ granules are structured and contain homotypic mRNA clusters. Nature Commununications. 6, 7962 (2015).

Tags

Biologi Molekylær Beacon Live Cell Imaging endogene mRNA visualisering mRNA trafficking Drosophila melanogaster ægge kammer æg kammer mikroinjektion samlokalisering partikel sporing.
Visualisering og sporing endogene mRNAs i levende <em>Drosophila melanogaster</em> ægge kamre
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar,… More

Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers. J. Vis. Exp. (148), e58545, doi:10.3791/58545 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter