Her præsenterer vi en protokol for visualisering, afsløring, analyse og sporing af endogene mRNA handel i levende Drosophila melanogaster æg kammer ved hjælp af molekylære beacons, spinning Disc confokal mikroskopi, og open source-analyse Software.
Fluorescens baserede billedbehandlings teknikker har i kombination med udviklingen i let mikroskopi revolutioneret, hvordan celle biologer gennemfører levende celle billedbehandlings undersøgelser. Metoder til påvisning af RNAs er vokset betydeligt, siden skelsættende studier har kædet den stedspecifikke mRNA-lokalisering sammen med forordningen om genekspression. Dynamiske mRNA-processer kan nu visualiseres via tilgange, der registrerer mRNAs, kombineret med mikroskopi-opsætninger, der er hurtige nok til at fange det dynamiske område af Molekylær opførsel. Molekylær Beacon-teknologien er en hybridiserings baseret tilgang, der er i stand til direkte at påvise endogene udskrifter i levende celler. Molekylære beacons er hårnål-formet, internt quenched, enkelt-nukleotid diskriminerende nukleinsyre sonder, som fluorescerer kun ved hybridisering til en unik Target sekvens. Når det kombineres med avanceret Fluorescens mikroskopi og høj opløsning billeddannelse, de gør det muligt for en til at udføre rumlig og tidsmæssig sporing af intracellulære bevægelse af mRNAs. Selv om denne teknologi er den eneste metode, der er i stand til at afsløre endogene udskrifter, har celle biologer endnu ikke fuldt ud omfavnet denne teknologi på grund af vanskeligheder med at designe sådanne sonder til live Cell Imaging. En ny software applikation, pinmol, giver mulighed for forbedret og hurtig design af sonder bedst egnet til effektivt hybridisere til mRNA mål regioner i en levende celle. Hertil kommer, at høj opløsning, real-time image erhvervelse og nuværende, open source billedanalyse software giver mulighed for en raffineret data output, hvilket fører til en finere vurdering af kompleksiteten underliggende de dynamiske processer, der er involveret i Mrna’s livscyklus.
Her præsenterer vi en omfattende protokol til design og levering af molekylære beacons til Drosophila melanogaster ægge kamre. Direkte og meget specifik detektion og visualisering af endogene maternel mRNAs udføres via spinning Disc confokal mikroskopi. Billeddata behandles og analyseres ved hjælp af objekt detektering og sporing i isnende software for at indhente oplysninger om den dynamiske bevægelse af mRNAs, som transporteres og lokaliserede til specialiserede områder inden for oocyte.
Cellebiologi undersøgelser, der visualiserer dynamiske hændelser med rumlig og tidsmæssig opløsning, er blevet muliggjort af udviklingen af fluorescens baserede Live Cell Imaging teknikker. I øjeblikket, in vivo mRNA visualisering opnås via teknologier, der er baseret på RNA aptamer-protein interaktioner, RNA aptamer-induceret fluorescens af organiske farvestoffer og nukleinsyre sonde udglødning1,2, 3. de alle tilbyder høj specificitet, følsomhed og signal-til-baggrund ratio. Men RNA aptamer-centrerede tilgange kræver omfattende genetisk manipulation, hvor en transgene er konstrueret til at udtrykke et RNA med kunstige strukturelle motiver, der er nødvendige for protein eller organisk farvestof binding. For eksempel kræver MS2/MCP-systemet Co-ekspression af et transgen, der udtrykker en RNA-konstruktion, som indeholder flere tandem gentagelser af bindings sekvensen for bakteriophage MS2 coat-proteinet (MCP), og et andet transgen, som indkoder et fluorescerende protein smeltet til MCP4,5. Tilføjelsen af sådanne sekundære strukturelle motiver til RNA, sammen med en voluminøse fluorescently Tagged protein, har rejst bekymring for, at indfødte RNA processer kan blive påvirket6. En teknologi, der behandler denne bekymring og tilbyder yderligere unikke fordele er den nukleinsyre-baserede tilgang, molekyle beacons (MBs). MBS giver mulighed for multiplex påvisning af endogene mRNAs, diskrimination af enkelt nukleotid variationer, og hurtig kinetik af hybridisering med mål mRNA7,8. MBs er oligonukleotidprober, der forbliver i en slukket hårnål fold, før de gennemgår en fluorogen konformationel ændring, når de hybridiserer til deres mål (figur 1c)9. Flere grupper har haft succes med at bruge MBS til at detektere både ikke-kodning RNAs (micrornas og lncrnas)10,11,12,13, RNA retrovira14 og dynamisk DNA-protein interaktioner15. De er blevet anvendt med succes til billeddannelse i forskellige organismer og væv, såsom Zebra embryoner16, neuroner13, tumor væv17, differentiere kardiomyocytter18, og salmonella 19.
Her beskriver vi design, levering og detektion tilgang til endogene mRNAs i Living D. melanogaster ægge kamre kombineret med en mikroskopi set-up, der er hurtig nok til at fange den dynamiske række af aktive molekyle transport. D. melanogaster Egg Chamber har fungeret som et ideelt flercellet model system til en bred vifte af udviklingsmæssige undersøgelser, fra tidlig kimcelle stamcelle division og maternel genekspression til generationen af segmental Body plan20, 21. Ægge kamre er let isolerede, store og gennemsigtige, og i stand til at modstå timer af ex vivo analyse, hvilket gør dem meget modtagelig for billeddannelse eksperimenter. Meget arbejde har fokuseret på den asymmetriske lokalisering af mødres udskrifter til diskrete subcellulære regioner forud for at blive aktivt oversat. Især skal Oskar mRNA lokalisering og den efterfølgende oversættelse til oocyte posterior pole ske på en stramt reguleret måde for at undgå et dødbringende, bicaudal embryo fænotype22. Oskar mRNA er transkriberet i de 15 kimcelle celler, kaldet sygeplejerske celler, og aktivt transporteres gennem cytoplasmiske broer, kaldet ring kanaler, i oocyte, den kimcelle celle, der bliver den modne æg og er i sidste ende befrugtet (figur 1a ). Den betydelige mængde oplysninger, der allerede er til rådighed om den dynamiske rekruttering og udveksling af protein faktorer til og fra Oskar mRNP, samt dens langtrækkende intracellulære rejse, gør Oskar til en foretrukken kandidat til at studere de mange processer i mRNA livscyklus. MBs har været medvirkende til at afsløre detaljer om processen med mRNA lokalisering og dechifrere regulering og funktion af protein faktorer, der styrer mRNA transport under Drosophila oogenesis. Især ved mikroindsprøjtning af MBS i sygeplejerske celler og udfører levende celle billeddannelse eksperimenter, sporing af endogene mRNAs er muligt8,23.
Den køreplan, der præsenteres her, indeholder trinnene i en komplet proces, fra udførelse af et live Cell Imaging-eksperiment ved hjælp af MBs, erhvervelse af billeddata, til at udføre dataanalyse for at spore endogene mRNA i dets oprindelige cellulære miljø. Trinene kan ændres og yderligere optimeret til at opfylde behovene hos forskere, der arbejder med andre væv/celletyper inden for deres egen Lab indstilling.
Live visualisering af endogene mRNA-handel i Drosophila Egg Chambers er afhængig af brugen af specifikke, effektive og nukleaseresistente MBS, som nu let kan designes med pinmol -software. MBs er specifikke sonder designet til at detektere unikke sekvenser inden for et mål mRNA (fortrinsvis regioner fri for sekundær struktur), hvilket gør det muligt meget løst påvisning af en udskrift. Den eneste begrænsning, når der vedtages denne teknik/protokol for andre væv/celletyper er effektiviteten af M…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Salvatore A.E. Marras (Public Health Research Institute Center, Rutgers University) for syntese, mærkning og rensning af molekylære beacons, og Daniel St Johnston (Gurdon Institute, University of Cambridge) for Oskar-MS2/ MCP-GFP transgene flyve bestand. Dette arbejde blev støttet af en National Science Foundation CAREER Award 1149738 og en professionel personale kongres-CUNY Award til DPB.
Spectrofluorometer | Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon | n/a | Photon counting spectrofluorometer |
Quartz cuvette | Fireflysci (former Precision Cells Inc.) | 701MFL | |
Dumont #5 tweezer | World Precision Instruments | 501985 | Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers |
Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
Cover slip No.1 22 x 40mm | VWR | 48393-048 | |
Dissecting microscope | Leica MZ6 Leica Microsystems Inc. | n/a | |
CO2 fruit fly anesthesia pad | Genesee Scienific | 59-114 | |
Tris-HCL pH7.5 | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
Spinning disc confocal microscope | Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc. | n/a | |
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera | Hamamatsu | n/a | |
PatchMan NP 2 Micromanipulator | Eppendorf Inc. | 920000037 | |
FemtoJet Microinjector | Eppendorf Inc. | 920010504 | |
Injection needle: Femtotips II | Eppendorf Inc. | 930000043 | |
Loading tip: 20ul Microloader | Eppendorf Inc. | 930001007 | |
Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22x40mm | VWR | 48393-026; 48393-172 | |
Dry yeast | Any grocery store | n/a | |
Computer, > 20 GB RAM | Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing |