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Biology

दृश्य और ट्रैकिंग अंतर्जात MRNAs में लाइव Drosophila मेलेनोगैस्टर अंडे मंडलों

Published: June 4, 2019 doi: 10.3791/58545
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1,2
1Biological Sciences Department Hunter College, City University of New York, 2Program in Molecular, Cellular, and Developmental Biology, Graduate Center, City University of New York

Summary

यहाँ, हम आणविक बीकन का उपयोग कर रहते Drosophila melanogaster अंडे कक्ष में अंतर्जात MRNA तस्करी के दृश्य, पता लगाने, विश्लेषण और ट्रैकिंग के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं, कताई डिस्क confocal माइक्रोस्कोपी, और खुला स्रोत विश्लेषण सॉफ्टवेयर.

Abstract

फ्लोरोसेंट आधारित इमेजिंग तकनीक, प्रकाश माइक्रोस्कोपी में विकास के साथ संयोजन में, कैसे सेल जीवविज्ञानी लाइव सेल इमेजिंग अध्ययन का संचालन क्रांति की है. RNAs का पता लगाने के लिए तरीके बहुत विस्तार किया है के बाद से मौलिक अध्ययन जीन अभिव्यक्ति विनियमन के लिए साइट-विशिष्ट MRNA स्थानीयकरण से जुड़े. गतिशील MRNA प्रक्रियाओं अब दृष्टिकोण है कि mRNAs का पता लगाने के माध्यम से कल्पना की जा सकती है, माइक्रोस्कोपी सेट अप है कि काफी तेजी से आणविक व्यवहार के गतिशील रेंज पर कब्जा करने के साथ युग्मित. आण्विक बीकन प्रौद्योगिकी एक संकरीकरण-आधारित दृष्टिकोण है जो जीवित कोशिकाओं में अंतर्जात प्रतिलिपिओं का प्रत्यक्ष पता लगाने में सक्षम है। आण्विक बीकन हैं हेयरपिन के आकार का, आंतरिक रूप से मज्जशीतन, एकल न्यूक्लिओटाइड विभेदकारी न्यूक्लिक एसिड जांच, जो केवल एक अद्वितीय लक्ष्य अनुक्रम के लिए संकरीकरण पर fluoresce. जब उन्नत फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और उच्च संकल्प इमेजिंग के साथ युग्मित, वे एक mRNAs के intracellular आंदोलन के स्थानिक और लौकिक ट्रैकिंग प्रदर्शन करने के लिए सक्षम. हालांकि इस तकनीक अंतर्जात प्रतिलिपि का पता लगाने में सक्षम एकमात्र तरीका है, सेल जीवविज्ञानियों अभी तक पूरी तरह से लाइव सेल इमेजिंग के लिए इस तरह की जांच डिजाइन करने में कठिनाइयों के कारण इस तकनीक को गले नहीं लगाया है. एक नया सॉफ्टवेयर अनुप्रयोग, PinMol,सबसे अच्छा कुशलता से एक जीवित सेल के भीतर MRNA लक्ष्य क्षेत्रों को संकरित करने के लिए उपयुक्त जांच के बढ़ाया और तेजी से डिजाइन के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, उच्च संकल्प, वास्तविक समय छवि अधिग्रहण और वर्तमान, खुला स्रोत छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर एक परिष्कृत डेटा उत्पादन के लिए अनुमति देते हैं, जटिलता की एक बेहतर मूल्यांकन करने के लिए अग्रणी गतिशील MRNA के जीवन चक्र में शामिल प्रक्रियाओं अंतर्निहित.

यहाँ हम डिजाइन और Drosophila melanogaster अंडे कक्षों में आणविक बीकन देने के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. अंतर्जात मातृ MRNAs के प्रत्यक्ष और अत्यधिक विशिष्ट पता लगाने और दृश्य कताई डिस्क confocal माइक्रोस्कोपी के माध्यम से किया जाता है. इमेजिंग डेटा संसाधित और Icy सॉफ्टवेयर में वस्तु का पता लगाने और ट्रैकिंग का उपयोग कर mRNAs, जो ले जाया जाता है और oocyte के भीतर विशेष क्षेत्रों के लिए स्थानीयकृत के गतिशील आंदोलन के बारे में विवरण प्राप्त करने के लिए विश्लेषण किया है।

Introduction

कोशिका जीव विज्ञान अध्ययन है कि स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ गतिशील घटनाओं कल्पना फ्लोरोसेंट आधारित लाइव सेल इमेजिंग तकनीक के विकास के द्वारा संभव बनाया गया है. वर्तमान में, विवो एमएमआरएनए दृश्य में प्रौद्योगिकियों के माध्यम से हासिल किया जाता है जो आरएनए एप्टीमर-प्रोटीन इंटरैक्शन पर आधारित होती हैं, आरएनए एप्टीमर-प्रेरित फ्लोरोसेंट कार्बनिक रंगों और न्यूक्लिक एसिड जांच के अनीलन1,2, 3. वे सभी उच्च विशिष्टता, संवेदनशीलता और संकेत-से-पृष्ठभूमि अनुपात प्रदान करते हैं। हालांकि, आरएनए aptamer केंद्रित दृष्टिकोण व्यापक आनुवंशिक हेरफेर की आवश्यकता है, जहां एक transgene कृत्रिम संरचनात्मक रूपांकनों कि प्रोटीन या कार्बनिक डाई बाइंडिंग के लिए आवश्यक हैं के साथ एक आरएनए व्यक्त करने के लिए इंजीनियर है. उदाहरण के लिए, MS2/MCP प्रणाली एक transgene के सह-अभिव्यक्ति की आवश्यकता है एक आरएनए निर्माण बैक्टीरियोफेज MS2 कोट प्रोटीन (MCP) के लिए बाध्यकारी अनुक्रम के कई अग्रानुक्रम दोहराता युक्त व्यक्त, और एक और transgene एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन एन्कोडिंग एमसीपी 4,5के लिए जुड़े . आरएनए में इस तरह के माध्यमिक संरचनात्मक रूपांकनों के अलावा, एक भारी फ्लोरोसेंटी टैग प्रोटीन के साथ, चिंता व्यक्त की है कि देशी आरएनए प्रक्रियाओं प्रभावित हो सकता है6. एक तकनीक है कि इस चिंता का समाधान और अतिरिक्त अद्वितीय लाभ प्रदान करता है न्यूक्लिक एसिड आधारित दृष्टिकोण, आणविक बीकन (MBs) है. एम बी अंतर्जात एमआरएनए के मल्टीप्लेक्स का पता लगाने के लिए अनुमति देते हैं, एकल न्यूक्लिओटाइड विविधताओं के भेदभाव, और लक्ष्य MRNA7,8के साथ संकरीकरण के तेजी से गतिकीय. एम बी ओलिगोन्यूक्लिओटाइड जांच कर रहे हैं जो एक बार वे अपने लक्ष्यों को संकरित करने के बाद एक फ्लोरोजेनिक अनुरूप परिवर्तन से गुजरने से पहले एक शंकाबाल पिन गुना में रहते हैं (चित्र 1 सी)9. कई समूहों दोनों गैर-कोडिंग आरएनए (microRNAs और lncRNAs)10,11,12,13, आरएनए रेट्रोवायरस14 और गतिशील डीएनए प्रोटीन का पता लगाने के लिए MBs का उपयोग करने में सफलता मिली है बातचीत15| वे सफलतापूर्वक विभिन्न जीवों और ऊतकों में इमेजिंग के लिए नियोजित किया गया है, जैसे ज़ेब्राफ़िश भ्रूण16, न्यूरॉन्स13, ट्यूमर ऊतक17, भेद कार्डियोमायोसाइट्स18, और साल्मोनेला 19.

यहाँ हम एक माइक्रोस्कोपी सेट अप है कि सक्रिय आणविक परिवहन के गतिशील रेंज पर कब्जा करने के लिए पर्याप्त है के साथ मिलकर रहने वाले डी मेलेनोगैस्टर अंडे कक्षों में अंतर्जात MRNAs के लिए डिजाइन, वितरण और पता लगाने के दृष्टिकोण का वर्णन. डी मेलेनोगैस्टर अंडा चैम्बर ने विकास अध्ययनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए एक आदर्श बहुकोशिकीय मॉडल प्रणाली के रूप में कार्य किया है, प्रारंभिक जर्मलाइन स्टेम सेल डिवीजन और मातृ जीन अभिव्यक्ति से खंडीय शरीर योजना20के उत्पादन के लिए, 21| अंडे कक्षों आसानी से अलग कर रहे हैं, बड़े और पारदर्शी, और पूर्व vivo विश्लेषण के घंटे का सामना करने में सक्षम, उन्हें अत्यधिक इमेजिंग प्रयोगों के लिए अनुकूल बना रही है. बहुत काम सक्रिय रूप से अनुवाद किया जा रहा से पहले असतत subcellular क्षेत्रों के लिए मातृ प्रतिलिपि के असममित स्थानीयकरण पर ध्यान केंद्रित किया है. विशेष रूप से, oskar MRNA स्थानीयकरण और oocyte के पीछे पोल पर इसके बाद अनुवाद एक कसकर विनियमित तरीके से एक घातक bicaudal भ्रूण phenotype22से बचने के लिए होना चाहिए. ऑस्कर एनआरएनए को 15 जर्मलाइन कोशिकाओं में लिखा जाता है, जिसे नर्स कोशिकाएं कहा जाता है, और सक्रिय रूप से कोशिकाद्रव्यी पुलों के माध्यम से ले जाया जाता है, जिसे वलय नहरों कहा जाता है, अंडाणु में, जर्मलाइन कोशिका जो परिपक्व अंडा बन जाती है और अंततः निषेचित होती है (चित्र 1क ). गतिशील भर्ती और oskar MRNP से करने के लिए और से प्रोटीन कारकों के आदान-प्रदान के बारे में पहले से ही उपलब्ध जानकारी की काफी राशि, अपनी लंबी दूरी की intracellular यात्रा के साथ, oskar अध्ययन करने के लिए एक पसंदीदा उम्मीदवार बनाते हैं MRNA जीवन चक्र की कई प्रक्रियाओं. MBs MRNA स्थानीयकरण की प्रक्रिया के बारे में विवरण खुलासा करने और प्रोटीन कारकों है कि Drosophila oogenesis के दौरान MRNA परिवहन को नियंत्रित करने के विनियमन और समारोह को समझने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है. विशेष रूप से, नर्स कोशिकाओं में MBs microin्यइजेक्टिंग और लाइव सेल इमेजिंग प्रयोगों प्रदर्शन द्वारा, अंतर्जात mRNAs की ट्रैकिंग संभव है8,23.

यहाँ प्रस्तुत रोडमैप एक पूरी प्रक्रिया के कदम प्रदान करता है, एक जीवित सेल इमेजिंग प्रयोग बाहर ले जाने से MBs का उपयोग कर, इमेजिंग डेटा प्राप्त करने के लिए, डेटा विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए अपने मूल सेलुलर वातावरण में अंतर्जात MRNA ट्रैक. कदम संशोधित किया जा सकता है और आगे अपने स्वयं के प्रयोगशाला सेटिंग के भीतर अन्य ऊतकों / सेल प्रकार के साथ काम कर रहे शोधकर्ताओं की जरूरतों को पूरा करने के लिए अनुकूलित.

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Protocol

1. लाइव सेल इमेजिंग के लिए MBs के डिजाइन

  1. mfold सर्वर (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form) से "RNA फार्म" का उपयोग कर MRNA लक्ष्य की माध्यमिक संरचना की भविष्यवाणी करने के लिए लक्ष्य आरएनए अनुक्रम मोड़ें।
    1. फास्टा प्रारूप में लक्ष्य अनुक्रम पेस्ट/अपलोड करें, 5 या 10% उप-ऑप्टिमिटी (एमएफई मान के 5 या 10% के भीतर तह की मुक्त ऊर्जा के साथ संरचना), और तदनुसार गणना की गई फोल्डिंग की अधिकतम संख्या को समायोजित करें (उदाहरण के लिए 10% के लिए बड़ा उप-ऑप्टिमलिटी)।
      नोट: जब MBs डिजाइन MBs डिजाइन उप इष्टतम माध्यमिक संरचनाओं का समावेशलक्ष्य MRNA के भीतर क्षेत्रों की पहचान के लिए अनुमति देता है कि अधिक लचीला या अधिक कठोर हो सकता है की तुलना में न्यूनतम मुक्त ऊर्जा (MFE) संरचना के लिए भविष्यवाणी की अकेले, जो सुधार लाइव सेल इमेजिंग के लिए उपयुक्त MBs के समग्र डिजाइन.
    2. 800 न्यूक्लियोटाइड्स (nt) के MRNA लक्ष्यों के लिए एक "तुरंत नौकरी" का चयन करें, या 801 और 8,000 nt के बीच MRNA लंबाई के लिए एक "बैच नौकरी" सरल पाठ फ़ाइल के रूप में सहेजें "ss-गिनती" फ़ाइल सहेजें.
  2. MRNA लक्ष्य के लिए कई MBs डिजाइन करने के लिए, वांछित मापदंडों के साथ PinMol कार्यक्रम (https://bratulab.wordpress.com/software/) के लिए इनपुट के रूप में चरण 1.1 में प्राप्त "ss-गिनती" फ़ाइल का उपयोग करें (PinMol प्रोग्राम के उपयोग का वर्णन ट्यूटोरियल देखें) 24 https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/) में).
    1. BLAST विश्लेषण प्रदर्शन करके चयनित MBs की विशिष्टता का निर्धारण: उपयुक्त डेटाबेस के साथ "ब्लास्टन" का उपयोग करें (उदाहरण के लिए oskar MRNA-विशिष्ट MBs का उपयोग करें "refseQ-rna" डेटाबेस और Drosophila मेलेनोगास्टर जीव).
    2. MRNA लक्ष्य के किसी भी ऊतक-विशिष्ट अभिव्यक्ति की पहचान करें (उदाहरण के लिए oskar MRNA Flybase के लिए ; उच्च-Throughput अभिव्यक्ति डेटा और FlyAtlas एनाटॉमी माइक्रोरेरे या modencode एनाटॉमी आरएनए-सेक; http://flybase.org/reports/FBgn0003015) और तुलना के साथ किसी भी सकारात्मक विस्फोट हिट. जांच को हटा दें जो अन्य mRNAs के साथ 50% क्रॉस-होमोलॉजी को हटा दें जो ऊतक/ब्याज की कोशिका में भी व्यक्त किए जाते हैं।
  3. लाइव सेल इमेजिंग (उदा. Cy5/BHQ2)25प्रदर्शन करने के लिए उपलब्ध माइक्रोस्कोपी सेट-अप के लिए उपयुक्त फ्लोरोफोर और क्वेन्चर युग्म का चयन करें।

2. एमबी संश्लेषण, शुद्धि, और विशेषता

  1. पहले वर्णित7के रूप में घर में संश्लेषण और शुद्धि का उपयोग करें , या वाणिज्यिक प्रदाताओं से सेवाओं, संश्लेषित और पांच MBs के लिए एक को शुद्ध करने के लिए (ऊपर नोट देखें), निम्नलिखित लेबलिंग योजना का उपयोग कर: $5' (Fluorophore)-(C3 या C6 linker)-(2'-O -मेथिल एमबी अनुक्रम)-(Quencher)3']. रिवर्स चरण HPLC का उपयोग कर MBs को शुद्ध, घर में या वाणिज्यिक प्रदाता की सेवाओं का उपयोग कर.
    नोट: स्वचालित जांच संश्लेषण के लिए उपयोग किए जानेवाले फॉस्फोरामिडीज में 2'- ओ-मेथिल राइबोन्यूक्लिओटाइड संशोधन होना चाहिए। एक भी बारी बंद न्यूक्लिक एसिड (LNA) और 2'-ओ-मेथिल संशोधनों के झंकार का उपयोग करने के लिए एक छोटी एमबी और उसके लक्ष्य MRNA26के बीच एक संकर की स्थिरता को बढ़ाने के लिए कर सकते हैं.
  2. लक्षित आरएनए क्षेत्र के अनुक्रम से मेल खाने वाले डीएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स को संश्लेषित करें और इस प्रकार एमबी के जांच क्षेत्र के पूरक हैं, इन विट्रो विशेषता में उपयोग के लिए (देखें चरण 2.3 से 2.5; ऊपर ध्यान दें)। डीएनए-ओलिगोन्यूक्लिओटाइड लक्ष्य नकल के साथ एमबी के संकरीकरण को अधिकतम, डीएनए लक्ष्य चार अतिरिक्त न्यूक्लिओटाइड के प्रत्येक छोर पर शामिल करके, के रूप में लक्ष्य MRNA अनुक्रम में पाया.
    नोट: लक्षित अनुक्रम का पता लगाने के लिए एमबी की दक्षता का एक और अधिक कठोर लक्षण पूरक डीएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स8के बजाय विट्रो संश्लेषित आरएनए लक्ष्यों में उपयोग किया जा सकता है।
  3. अकेले एमबी के थर्मल विकृतीकरण प्रदर्शन, इसके पिघलने के तापमान (टीएम) को मापने, और पुष्टि करें कि एमबी शारीरिक तापमान पर वांछित हेयरपिन आकार ग्रहण करता है। हमने 60 से 90 डिग्री सेल्सियस के बीच टीएम मूल्यों का अवलोकन किया है।
  4. डीएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड लक्ष्य की उपस्थिति में एमबी के थर्मल विकृतीकरण प्रदर्शन और एमबी को मापने: डीएनए लक्ष्य संकर के Tm, जैसा कि पहले वर्णित7. एमबी:डीएनए हाइब्रिड के लिए 55 से 60 डिग्री सेल्सियस के बीच एक टीएम वांछित है।
  5. इसी डीएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड लक्ष्य के साथ इन विट्रो संकरण प्रतिक्रियाओं में प्रदर्शन करें, और शारीरिक तापमान पर एमबी:डीएनए संकर गठन की दक्षता का निर्धारण करें, जैसा कि पहले वर्णित7। डीएनए लक्ष्य नकल के साथ तेजी से संकरीकरण गतिज वांछित है, लेकिन एमबीए कि डीएनए लक्ष्यों के साथ उच्च संकरण दक्षता नहीं दिखा तेजाब इन विट्रो में लक्ष्य MRNA के साथ एक बेहतर प्रदर्शन हो सकता है और /

3. विच्छेदन और माइक्रोइंजेक्शन के लिए अलग-अलग अंडे मंडलों की तैयारी

  1. ताजा खमीर पेस्ट के साथ 2-3 दिनों के लिए नए पैदा हुए, mated महिलाओं फ़ीड.
  2. Anesthetize एक सीओ2 पैड पर मक्खियों और, ठीक tweezers (dumont #5) का उपयोग कर, एक गिलास कवर पर्ची पर हेलोकार्बन तेल 700 की एक बूंद में 1-2 महिलाओं को स्थानांतरित.
  3. चने की एक जोड़ी का उपयोग करना, एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत पृष्ठीय पक्ष के साथ मक्खी उन्मुख. पीछे के छोर पर एक छोटा सा चीरा बनाकर मादा पेट को अलग करें और धीरे से अंडाशय की जोड़ी को तेल में निचोड़ें।
  4. एक नए कवरस्लिप पर एक तेल ड्रॉप पर अंडाशय को बढ़ाएं। अन्य ट्वीजर के साथ ओवेरियोल के सबसे कम उम्र के चरणों को काटते समय एक अंडाशय को एक ट्वीजर के साथ धीरे से पकड़ें। oskar MRNA सक्रिय रूप से पर और मध्य oogenesis के बाद स्थानीयकृत है (चरणों और 7), और छोटे अंडे कक्षों (चरणों और lt; 7) इंजेक्ट करने के लिए और अधिक कठिन हैं और लंबे समय के रूप में जीवित नहीं है. धीरे-धीरे कवर स्लिप (नीचे की ओर आंदोलन के साथ) पर खींचें जब तक कि व्यक्तिगत ओवेरियोल्स या अंडे के कक्ष अलग और ऊर्ध्वाधर गठबंधन न हों। इसके अलावा ओवेरियोल अंडे श्रृंखला से अवांछित चरणों को विस्थापित करके अलग एकल अंडा कक्षों।
    नोट: सुनिश्चित करें कि व्यक्तिगत रूप से छेड़ा अंडा कक्षों तेल में नाव नहीं है, और है कि वे कवर पर्ची का पालन करें. यह दोनों सफल microinsection और छवि अधिग्रहण के लिए महत्वपूर्ण है.

4. अंडे मंडलों की नर्स कोशिकाओं में MBs का माइक्रोइंजेक्शन

  1. एमबी समाधान तैयार, एक आणविक बीकन का उपयोग कर (जैसे osk2216Cy5), या दो MBs का एक मिश्रण है कि लक्ष्य विभिन्न mRNAs और जो वर्णक्रमीय अलग फ्लोरोफोर (जैसे osk216Cy5 और drongo111Cy3) के साथ लेबल कर रहे हैं. HybBuffer में 200-300 एनजी / जेडएल प्रत्येक एमबी की एकाग्रता का उपयोग करें (50 एमएम Tris-HCl - पीएच 7.5, 1.5 एमएम MgCl2 और 100 एम एम NaCl). एक ही फ्लोरोफोर के साथ लेबल किए गए चार MBs के कॉकटेल के लिए जो हाइबबफर में 200 एनजी/जेडएल प्रत्येक पर एक ही MRNA को लक्षित कर रहे हैं (उदाहरण के लिए osk82, osk1236, osk2216)। माइक्रोइंजेक्शन के लिए सुई को लोड करने से तुरंत पहले एमबी समाधान को स्पिन करें।
  2. उद्देश्य का चयन करें. एक 40x तेल उद्देश्य एक उपयुक्त अंडा कक्ष खोजने के लिए और microinctions प्रदर्शन के लिए सिफारिश की है.
  3. माइक्रोस्कोप चरण पर विच्छेदन अंडे कक्ष के साथ कवरस्लिप माउंट करें। फोकस स्थिति में उद्देश्य को ऊपर लाने और एक मध्य करने के लिए देर से विकास के चरण में एक अंडा कक्ष की पहचान, कि ठीक से microinctions के लिए उन्मुख है (यानी, सुई टिप के लिए सीधा A$P अक्ष के साथ एक नर्स के भीतर आसान इंजेक्शन के लिए अनुमति देने के लिए ऊसाइट के निकट कोशिका।
  4. एक सुई लोड (वाणिज्यिक या घर में तैयार27 ) के साथ $1 $L एमबी समाधान (चरण 4.1 देखें) और यह microinstoor करने के लिए कनेक्ट. डी मेलेनोगैस्टर अंडे कक्षों में माइक्रोइंजेक्शन के लिए, सुई को एक कोण पर उन्मुख करें और माइक्रोस्कोप चरण के लिए 45 डिग्री (उदाहरण के लिए 30 डिग्री) कई नर्स कोशिकाओं को puncturing से बचने के लिए।
  5. 500-1,000 एचपीए के इंजेक्शन दबाव और 100-250 एचपीए के मुआवजे के दबाव के साथ इंजेक्टर सेट अप करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
  6. धीरे धीरे मंच ले जाने के लिए देखने के क्षेत्र में अंडे कक्षों के तेल ड्रॉप शून्य के एक क्षेत्र में लाने के लिए.
  7. micromanipulator जॉयस्टिक का उपयोग करना, धीरे तेल की बूंद में सुई कम और देखने के क्षेत्र की परिधि की ओर ध्यान में अपनी टिप ले आओ.
  8. सुई की नोक से हवा को हटाने के लिए और सुई से प्रवाह है कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक 'साफ' समारोह प्रदर्शन करते हैं।
  9. घर की स्थिति के लिए सुई लाने के लिए और सूक्ष्म इंजेक्शन किया जा करने के लिए अंडे के कक्ष पर ध्यान केंद्रित है, तो ध्यान में वापस सुई लाने के लिए और यह अंडे कक्ष के किनारे के पास की स्थिति।
  10. उद्देश्य की स्थिति का एक अच्छा समायोजन इस तरह है कि नर्स कोशिकाओं से कूप कोशिकाओं को अलग झिल्ली ध्यान में है प्रदर्शन.
  11. एक नर्स सेल में सुई डालें और 2-5 s के लिए इंजेक्शन प्रदर्शन.
  12. धीरे से सुई को हटाने और यह घर की स्थिति को वापस लेने.
  13. छवि अधिग्रहण (60-63x या 100x) के लिए वांछित आवर्धन के उद्देश्य को बदलें, अंडे के कक्ष पर ध्यान केंद्रित, और अधिग्रहण शुरू करते हैं.

5. एक स्पिनिंग डिस्क Confocal माइक्रोस्कोप सेटअप का उपयोग कर डेटा का अधिग्रहण

नोट: हमारे विशिष्ट सेटअप के लिए सामग्री की तालिका देखें.

  1. 8-16-बिट छवियों (XY$ $ मात्रा, C ] चैनल, t ] समय) की एक XY$Ct स्टैक रिकॉर्ड करने के लिए अधिग्रहण प्रोटोकॉल सेट अप करें।
  2. वांछित चैनलों के लिए लेजर लाइनों का चयन करें (उदाहरण के लिए 641 एनएम Cy5 और GFP के लिए 491 एनएम के लिए) और चैनलों को क्रमिक रूप से प्राप्त करें: पहले प्रत्येक चैनल में फ्लोरोसेंट सिग्नल और फिर उचित colocalization विश्लेषण के लिए अनुमति देने के लिए , $ स्थिति बदल जाते हैं।
  3. $ चरण (उदा. 0.3 $m) और ऊपर और नीचे की सीमाओं(उदा. -2 $m से 2 उ) का चयन करें.
  4. प्राप्ति समय और नमूना दर इनपुट करें (उदा. 1 h तक के लिए हर 15-30 s).
  5. अधिग्रहण शुरू करें.

6. प्रसंस्करण, डेटा विश्लेषण ट्रैकिंग और Colocalization जानकारी प्राप्त करने के लिए, और वीडियो फ़ाइलों की तैयारी

  1. छवि प्रसंस्करण
    1. डाउनलोड, खोल, और खुला Icy, bioimage informatics के लिए एक खुला समुदाय मंच (http://icy.bioimageanalysis.org/)
    2. चरण 5: छवि / अनुक्रम में प्राप्त XY$Ct स्टैक खोलें
    3. ImageJ करने के लिए ढेर कन्वर्ट: ImageJ gt; उपकरण और IJ करने के लिए कन्वर्ट, Detached मोड पर है.
    4. एक substack बनाओ (एक की एक श्रृंखला की एक चयन $ कदम और समय अंक आगे विश्लेषण किया जा करने के लिए): ImageJ gt; छवि gt; Stacks और उपकरण बनाओ Substack ...; वांछित चैनलों, जेड कदम और समय अंक का चयन करें।
    5. TIFF फ़ाइल के रूप में substack सहेजें: ImageJ gt; फ़ाइल और सहेजें के रूप में gt; Tiff...; अनुवर्ती चरणों के लिए इस फ़ाइल का उपयोग करें.
    6. स्प्लिट चैनल: ImageJ gt; छवि और रंग और विभाजित चैनल।
    7. पृष्ठभूमि या तो एक पृष्ठभूमि ढेर का उपयोग कर घटाना: ImageJ gt; प्रक्रिया gt; छवि कैलक्यूलेटर ..., या रोलिंग गेंद विकल्प का उपयोग कर: ImageJ और प्रक्रिया और पृष्ठभूमि घटाना ..., रोलिंग गेंद त्रिज्या का चयन करें। "स्वीकार करें" चुनने से पहले चयनित दायरे के लिए चित्र का पूर्वावलोकन करें.
      नोट: पृष्ठभूमि संकेत मुख्य रूप से flurophore के अनुचित शमन से पैदा होगा. संकेत: पृष्ठभूमि अनुपात (एस:बी) अक्सर एक एमबी के लिए एक संकेतक के रूप में प्रयोग किया जाता है "चमक", और यह एमबी और डीएनए लक्ष्य oligonucleotide के इन विट्रो संकरीकरण प्रयोगों में से मापा जाता है. उदाहरण के लिए, MBs osk1236 और osk2216 क्रमशः $81 और $120 का S:B है।
    8. प्रत्येक चैनल के लिए चमक और इसके विपरीत समायोजित करें: ImageJ gt; छवि और समायोजित करें और चमक /
    9. एक अलग झगड़ा फ़ाइल के रूप में प्रत्येक चैनल को बचाओ: ImageJ gt;File ]gt; के रूप में सहेजें gt;Tiff ....
    10. दो चैनलों को मर्ज करें: ImageJ gt; Image चैनलों का चयन करें. नए स्टैक को एक नई TIFF फ़ाइल के रूप में सहेजें (चरण 6.1.8) देखें.
  2. स्पॉट डिटेक्शन और ट्रैकिंग
    1. Icy करने के लिए वापस कन्वर्ट: ImageJ gt; उपकरण और Icy करने के लिए परिवर्तित करें।
    2. एक पैमाने पर बार स्वचालित रूप से Icy करने के लिए रूपांतरण पर ढेर पर मढ़ा है, अगर पैमाने बार प्लगइन स्थापित किया गया है [Plugins का उपयोग कर खोज ]gt; सेटअप और ऑनलाइन प्लगइन]. यदि आवश्यक हो, तो निरीक्षक विंडो (स्क्रीन के दाईं ओर) के माध्यम से स्केल बार संपादित करें;लेयर टैब और नाम और स्केल बार।
    3. मूल स्टैक से स्केल बार को निकालने के लिए Layer टैब से स्केल बार के लिए 'आंख' चिह्न को अचयनित करें/ यह अंतिम स्टैक पर पुनः सक्रिय किया जा सकता है।
    4. छवि विंडो के मेनू पट्टी से "कैमरा" आइकन का उपयोग कर एक स्क्रीनशॉट लेने के द्वारा नए संसाधित ढेर सहेजें, "वर्तमान दृश्य के एक स्क्रीनशॉट ले लो" और फ़ाइल के रूप में सहेजें और Tiff ....
    5. स्थान संवेदनशीलता का निर्धारण, अगर स्पॉट संवेदनशीलता पैरामीटर पहले से ही चरण 6.2.7 पर ले जाने के लिए निर्धारित किया गया है.
    6. स्पॉट का पता लगाने: विश्लेषण किया जा करने के लिए छवि या ढेर के साथ खिड़की का चयन करें, जांच और ट्रैकिंग और पता लगाने और स्पॉट डिटेक्टर, और सेटिंग्स मापदंडों में भरें:
      1. इनपुट के लिए, "CurrentSecienceInputDetection" (डिफ़ॉल्ट) का चयन करें।
      2. पूर्व प्रसंस्करण के लिए, "चैनल 0" (डिफ़ॉल्ट) का चयन करें, या निरीक्षक विंडो में संख्या को क्रॉस-संदर्भ देकर वांछित चैनल का चयन करें।
      3. डिटेक्टर के लिए, का चयन करें "अंधेरे पृष्ठभूमि पर उज्ज्वल स्थान का पता लगाने;" का उपयोग करें "3 डी के लिए 2 डी वेलेट्स के बल का उपयोग करें" केवल अगर वहाँ पर्याप्त नहीं हैं - विश्लेषण करने के लिए ढेर में slices. प्रत्येक पैमाने के लिए "स्केल(स्केल)" और "संवेदनशीलता" का चयन करें (बड़े धब्बे के लिए और अधिक तराजू जोड़ें)। स्केल और संवेदनशीलता (अधिक संवेदनशील संख्या का पता लगाने है, 140 की एक अधिकतम Icy द्वारा सुझाव दिया है) परीक्षण और त्रुटि चर रहे हैं, कि नेत्रहीन बाद में जाँच की जानी चाहिए और पर फैसला किया.
      4. रुचि के क्षेत्र के लिए, "ROIfromSecience" (डिफ़ॉल्ट) का उपयोग करें।
      5. फ़िल्टरिंग के लिए, "NoFiltering" (डिफ़ॉल्ट) का उपयोग करें, या "आकार फ़िल्टरिंग" का चयन "स्वीकृत ऑब्जेक्ट्स की श्रेणी (पिक्सेल में)" निर्धारित करने के लिए करें।
      6. आउटपुट: XLS या XML आउटपुट सेटिंग का चयन करें (2007 MS Excel या पहले का उपयोग करते समय XML स्वरूप का चयन करें और वहाँ हैं $gt;65,000 स्पॉट). यदि स्पॉट डिटेक्टर परिणाम ट्रैकिंग विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है, यह भी चुनें "SwimmingPool करने के लिए निर्यात".
      7. विभिन्न पैमाने/संवेदनशीलता मूल्यों का उपयोग करके धब्बों का दोहराने का पता लगाना जब तक कि सभी या अधिकांश स्पॉट का पता नहीं चलता है। सभी अंतिम पैरामीटर रिकॉर्ड करें.
      8. colocalization विश्लेषण के लिए, अन्य चैनल के लिए स्थान का पता लगाने दोहराएँ.
    7. स्पॉट ट्रैक करने के लिए, डिटेक्शन और ट्रैकिंग का चयन करें और ट्रैकिंग और ट्रैकिंग और स्पॉट ट्रैकिंग और चरण 6.2.6. से मानकों के साथ स्पॉट डिटेक्टर चलाएँ, या एक मौजूदा डेटासेट का चयन करने के लिए "यहाँ का पता लगाने के परिणाम का चयन करें" पुल-डाउन मेनू का उपयोग करें (इस के लिए, स्पॉट डिटेक्टर विंडो रखें चरण 6.2.5) से खुला है. "अनुमान पैरामीटर" बटन दबाएँ और पैरामीटर अनुमान पॉप-अप विंडो में वांछित लक्ष्य गति का चयन करें (उदा. "दोनों diffusive और निर्देशित है")। "रन ट्रैकिंग" बटन दबाएँ.
    8. मल्टीचैनल स्टैक के स्थानों पर नज़र रखने, चरण 6.2.7 से उत्पन्न स्टैक के साथ शुरुआत, चरणों 6.2.6 और 6.2.7 का अनुसरण करते समय अन्य चैनलों के लिए स्पॉट का पता लगाने और ट्रैकिंग दोहराएँ.
    9. पटरियों कल्पना करने के लिए, का चयन करें जांच और ट्रैकिंग और ट्रैकिंग - ट्रैकिंग प्रबंधक - इस विंडो पर नज़र रखने के चलाने के पूरा होने पर स्वचालित रूप से खुलता है. "रंग ट्रैक प्रोसेसर" के लिए, "सक्षम" का चयन करें और पटरियों के लिए रंग की वांछित प्रतिनिधित्व का चयन करें. प्रासंगिक ट्रैक प्रोसेसर "ट्रैक प्रोसेसर जोड़ें..." के माध्यम से पहुँचा जा सकता है पुल-डाउन मेनू (उदा. "ट्रैक प्रोसेसर टाइम क्लिप" का चयन करें, "ट्रैक क्लिपर" विंडो सक्षम करें, और वर्तमान समय बिंदु से पहले और बाद में प्रदर्शित होने के लिए डिटेक्शन की वांछित संख्या चुनें।
    10. एक XML ट्रैक फ़ाइल के रूप में पटरियों जानकारी सहेजें: पता लगाना और ट्रैकिंग और ट्रैकिंग और ट्रैक प्रबंधक gt; फ़ाइल और के रूप में सहेजें ....
    11. छवि विंडो के मेनू पट्टी से "कैमरा" आइकन का उपयोग करके एक स्क्रीनशॉट लेने के द्वारा परिणामों को बचाओ, "वर्तमान दृश्य के एक स्क्रीनशॉट ले लो". स्क्रीनशॉट का पता चला स्पॉट के साथ लिया जा सकता है और / या पटरियों बस सक्रिय करने के द्वारा /
    12. TimeStamp ओवरले प्लगइन स्थापित करें: Plugins और सेटअप और ऑनलाइन प्लगइन और TimeStamp ओवरले और स्थापित करें.
    13. टाइमस्टैम्प जोड़ें: Plugins और TimeStamp ओवरले (नया). समय स्टाम्प रखने और स्वरूपण करने के निर्देशों के लिए पॉप-अप विंडो (स्क्रीन के निचले दाएं कोने) पर निर्देशों का पालन करें. समय अंतराल जोड़ा जा सकता है / निरीक्षक विंडो में बदल दिया जा सकता है और अनुक्रम टैब और अनुक्रम गुण और संपादित करें.
    14. एक और स्क्रीनशॉट लेने के द्वारा परिणामों को बचाओ. छवि को 1) Tiff स्वरूप के रूप में सहेजें, और 2) AVI स्वरूप के रूप में; AVI प्रारूप के लिए पहले आरजीबी प्रतिपादन में परिवर्तित (छवि /
    15. वांछित अभिविन्यास के लिए छवि घुमाएँ: निरीक्षक विंडो gt; अनुक्रम टैब gt; कैनवास और रोटेशन।
    16. "वर्तमान दृश्य का स्क्रीनशॉट लें" द्वारा घुमाई गई छवि सहेजें. यह भी छवि के साथ बारी बारी से होगा के रूप में पैमाने पर पट्टी के लिए "आंख" आइकन, deselected है सुनिश्चित करें.
    17. चुनें और फसल ROI: ब्याज के क्षेत्र का चयन करें gt;2D ROI और ROI आकार चुनें और फिर छवि पर आरओआई बनाएं/ Image/Seuence ]gt; विमान (XY)
  3. सहस्थानीकरण विश्लेषण
    1. एक सहस्थानीकरण प्रोटोकॉल तैयार करें; कई उदाहरण Icy वेबसाइट पर प्रदान की जाती हैं (http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/List) पूरक सामग्रीदेखें).
    2. लोड colocalization प्रोटोकॉल: उपकरण और पटकथा और Protocols और लोड, और बातचीत ब्लॉकों में पैरामीटर समायोजित (जैसे में "वेलेट स्पॉट का पता लगाने" ब्लॉक उपयोग पैरामीटर चरण 6.2.6 में निर्धारित).
    3. पिक्सेल में एक कण के आकार को मापने, colocalization दूरी निर्धारित करने और यह में इनपुट "Colocalizer" ब्लॉक के रूप में "अधिकतम दूरी."
      नोट: पिक्सल में कण का आकार पता लगाने प्रणाली पर निर्भर करता है। आकार को मापने के लिए, एक एकल कण में ज़ूम और मैन्युअल रूप से भर में संकेत की चौड़ाई अवधि कि पिक्सल गिनती। औसत कम से कम तीन कणों से माप. colocalization के लिए निर्धारित किया जा करने के लिए अधिकतम दूरी पिक्सेल में कण का आकार है (यह दो कणों को छूने की त्रिज्या की अधिकतम राशि का प्रतिनिधित्व करता है).।
    4. यदि वांछित हो, तो सहस्थानीकरण विश्लेषण के लिए एक या अधिक ROIs का चयन करें: रुचि का क्षेत्र और 2D ROI और छवि पर ROI चुनें; ROI ड्रा करें.
    5. फसल ROI(s): छवि / अनुक्रम और विमान (XY)
    6. सहस्थानीकरण निष्पादित करें: प्रोटोकॉल संपादक विंडो और चुना प्रोटोकॉल टैब प्रोटोकॉल संपादक विंडो में अंतिम ब्लॉक में स्थान का पता लगाने के आधार पर समग्र सहस्थानीकरण प्रतिशत होगा, जबकि प्रत्येक समय बिंदु पर जानकारी निरीक्षक विंडो में पाई जा सकती है।
    7. ट्रैक colocalized और एकल कणों का पालन करके कदम 6.2.7 (ट्रैक स्पॉट).
    8. चरण 6.2.16 में वर्णित के रूप में सहेजें।

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Representative Results

PinMolका उपयोग करना , कई MBs एक MRNA लक्ष्य के लिए डिजाइन किया जा सकता है (चित्र 1B-C) . संश्लेषण और शुद्धि के बाद, चयनित MBs विशेषता है और इन विट्रो विश्लेषण में उपयोग की तुलना में कर रहे हैं।

Figure 1
चित्र 1: अंतर्जात MRNAs के लाइव सेल इमेजिंग के लिए तकनीक और ऊतक विवरण. (ए ) माइक्रोइंजेक्शन के लिए उपयोग किए जाने वाले मध्य चरण के ड्रोसोफिला अंडे कक्ष का वर्णन। माइक्रोइंजेक्शन सुई (हरा) ऑस्कर एमआरए के लिए विशिष्ट आणविक बीकन का एक कॉकटेल बचाता है। एक नर्स सेल में एक त्वरित इंजेक्शन oocyte के लिए पारगमन में mRNAs का पता लगाने में सक्षम बनाता है, साथ ही पीछे प्रांतस्था पर पहले से ही स्थानीयकृत MRNA के दृश्य. (ख) आणविक बीकन द्वारा लक्षित ओस्कर एमआरएनए (सी) माध्यमिक संरचना क्षेत्र के लिए आणविक बीकन रैंकिंग के पिनमॉल सॉफ्टवेयर आउटपुट। (सी ') अनुक्रम और oskarकी तह - विशिष्ट आणविक बीकन, osk216. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

MBs के इष्टतम प्रदर्शन के बाद इन विट्रो विशेषता के माध्यम से पुष्टि की है, जांच अंतर्जात लक्ष्य MRNA (एस) के लाइव दृश्य के लिए उपयोग किया जाता है. ओजेनेसिस के विभिन्न चरणों में और विशेष रूप से मध्य-ओजेनेसिस (7-10) (चित्र2ए-बी)के बाद ओस्कर एमआरएनए परिवहन और स्थानीयकरण के पैटर्न की कल्पना करना संभव है। उनके छोटे आकार के कारण, बहुत प्रारंभिक चरणों (1-4) में अंडे के कक्षों को इंजेक्ट करना मुश्किल है। जब व्यक्तिगत रूप से एक ही चरण अंडे कक्षों में इंजेक्शन, oskar-विशिष्ट MBs स्थानीयकरण के एक ही पैटर्न प्रस्तुत (चित्र 2, osk1236 बनाम osk216).

Figure 2
चित्र 2: अधिग्रहण की शुरुआत के बाद, ट 0, 10, और 30 मिनट के समय अंक पर जंगली प्रकार के अंडे के चैम्बर में oskar MRNA का समय अनुक्रम। दो oskar-विशिष्ट आणविक बीकन (osk1236 और osk2216)के नर्स सेल इंजेक्शन (ए ) चरण 6-7 अंडे कक्षों और (बी) चरण 9 अंडे कक्षों. स्केल बार ] 20 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

विभिन्न एमआरएनए लक्ष्यों को स्पेक्ट्रमी विशिष्ट फ्लोरोसेंटी लेबल वाले MBs (चित्र3) का उपयोग करके सह-दृश्यित किया जा सकता है। एमबी विलयन को नर्स सेल में सूक्ष्म रूप से माइक्रोइंजेक्ट किया जा सकता है (चित्र 3क) या अंडाणु में (चित्र 3ख) MBs एक नर्स सेल के कोशिका द्रव्य में इंजेक्शन स्वतंत्र रूप से अन्य नर्स कोशिकाओं में के रूप में अच्छी तरह से अंडाणु में फैलाना होगा, और इस प्रकार अपने लक्ष्य को खोजने के लिए और माइक्रोइंजेक्शन साइट से अन्य साइटों पर फ्लोरोसेंट संकेत उत्पन्न करने में सक्षम हैं. उदाहरण के लिए, जब एक देर oogenesis चरण (9-10) अंडे कक्ष की एक नर्स सेल में microinsइंजेक्शन प्रदर्शन, अंडाणु के भीतर कल्पना फ्लोरोसेंट संकेत के अधिकांश पहले से ही स्थानीयकृत oskar MRNA द्वारा उत्पन्न होता है, और सक्रिय रूप से ले जाया द्वारा कम ट्रांसक्रिप्ट्स, जो पहले के चरणों (7-8) में अधिक प्रचलित हैं। ध्यान दें कि शास्त्रीय MBs नाभिक के भीतर गैर विशिष्ट संकेत को जन्म दे देंगे, इसलिए अंडे कक्ष के कोशिकाद्रव्यी क्षेत्रों के लिए विश्लेषण सीमित. अतिरिक्त संशोधन, जैसे NeutrAvidin या सोने के नैनोकणों, को कम करने या इस गैर विशिष्ट संकेत को खत्म करने के लिए नियोजित किया गया है28,29. इस परमाणु गैर विशिष्ट संकेत के बावजूद, oskar MRNA के vivo का पता लगाने में के लिए MBs की विशिष्टता एक FRET दृष्टिकोण8का उपयोग कर स्थापित किया गया है , और एमबी सह इंजेक्शन इन विट्रो लिखित oskar MRNA में एमबी के लेबल23से अलग एक फ्लोरोफोर स्पेक्ट्रम के साथ लेबल |

Figure 3
चित्र 3: जीवित अंडे कक्षों में दो एमआरएनए प्रजातियों का सह-दृश्य। oskarके सह-इंजेक्शन - और drongo-विशिष्ट आणविक बीकन में (ए) नर्स सेल और (बी) मंच 8-9 अंडे कक्षों के अंडाणु. ऑस्कर (लाल) और drongo (हरा) mRNAs oocyte (asterix) के पीछे के छोर पर colocalize, और drongo भी दोरसो-पूर्व संचय (एरोहेड) से पता चलता है. स्केल बार ] 20 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

MRNA लक्ष्य है कि कम अभिव्यक्ति के स्तर को दिखाने के लिए, MRNA अणु प्रति फ्लोरोसेंट संकेत कम से कम दो MBs युक्त एक कॉकटेल समाधान इंजेक्शन द्वारा वृद्धि हुई है, विभिन्न लक्ष्य क्षेत्रों के लिए प्रत्येक बाइंडिंग (चित्र 4 और 5).

Figure 4
चित्र 4: एमबी और एमएस2-जीएफपी प्रणाली दोनों के साथ ऑस्कर एमआरनएका का दृश्यावलोकन। osk-MS2 व्यक्त एक अंडा कक्ष में एक एमबी कॉकटेल समाधान (एमबी) के माइक्रोइंजेक्शन:MCP-GFP30 (GFP). एक नर्स सेल के माइक्रोइंजेक्शन के बाद, छवियों 20 मिनट के लिए हर 30 s प्राप्त कर रहे थे. ब्याज के दो क्षेत्रों का चयन किया गया, एक नर्स सेल में रॉय और एक अंडाणु में. स्पॉट का पता लगाने के लिए प्रत्येक ROI के लिए अलग-अलग संवेदनशीलता का उपयोग किया गया था। रॉय नर्स सेल: स्केल 2, GFP और एमबी के लिए संवेदनशीलता 100. रॉय अंडाणु: स्केल 2, GFP के लिए संवेदनशीलता 50 और MB के लिए 110. Colocalization दूरी दोनों ROIs के लिए 4 पिक्सल है. पूरे अंडे कक्ष और नर्स सेल पर ज़ूम में 12 मिनट समय बिंदु पर दिखाए जाते हैं, और oocyte पर ज़ूम में 14 मिनट समय बिंदु पर दिखाया गया है. एमबी स्पॉट (लाल हलकों) और GFP स्पॉट (हरी हलकों) प्रत्येक दृष्टिकोण द्वारा पता चला oskar mRNA कणों की पहचान, और colocalized कणों (पीला) संकेत मिलता है जहां एमबी और GFP स्पॉट सबसे अधिक 4 पिक्सल के अलावा कर रहे हैं. 0ण्3 डिग्री उ चरणों पर 14 ऑप्टिकल स्लाइसों का XY-प्रक्षेप। एक 63x उद्देश्य के साथ 16 बिट डेटा के रूप में प्राप्त (तेल, एनए $ 1.4), XY $ 0.24 डिग्री, जोखिम समय 500 एमएस, पर 5.23 और 5.39 एनएम लेजर शक्ति, क्रमशः. स्केल बार ] 10 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: ओसाइट में ट्रैकिंग विश्लेषण, oskar MRNA-विशिष्ट MBs के साथ नर्स सेल माइक्रोइंजेक्शन के बाद। एमबी कणों संवेदनशीलता 110 के साथ स्केल 2 पर पाए गए थे, और 8 समय अंक से पहले / एमबी स्पॉट (लाल हलकों) अंडाणु की मात्रा में ट्रैक कर रहे हैं; पटरियों से पहले 8 समय अंक से पता लगाने की जानकारी का प्रतिनिधित्व / प्रत्येक रंग एक व्यक्तिगत ट्रैक का प्रतिनिधित्व करता है. 0ण्3 डिग्री उ चरणों पर 14 ऑप्टिकल स्लाइसों का XY-प्रक्षेप। स्केल बार ] 10 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एमएसबी बनाम एमएस 2/एमसीपी के साथ पता लगाए गए oskar MRNA के अवैध व्यापार की तुलना करते समय, oskarद्वारा उत्पन्न फ्लोरोसेंट सिग्नल -विशिष्ट MBs ईमानदारी से परिवहन और ट्रांसजेनिक oskar MRNA के स्थानीयकरण पर दस्तावेजों 10 GFP के साथ लेबल MS2/MCP प्रणाली के माध्यम से अणुओं (चित्र 4). oskar-MS2/MCP-GFP ट्रांसजेनिक अंडे कक्षों में मध्य oogenesis में, अधिग्रहण डेटा विश्लेषण आनुवंशिक रूप से इंजीनियर oskarके फ्लोरोसेंट संकेतों के बीच व्यापक colocalization दिखाया -MS2 MRNA MBs और GFP-टैगिंग का उपयोग कर का पता चला . 12 और 14 मिनट के बाद इंजेक्शन, 57% (7 MB-ऑब्जेक्ट्स और 13 GFP-ऑब्जेक्ट्स, 4 colocalized वस्तुओं के साथ) और 93% (30 MB-ऑब्जेक्टऔर 51 GFP-ऑब्जेक्ट्स, 28 colocalized वस्तुओं के साथ) का पता चला एमबी कणों नर्स कोशिकाओं और oocyte में GFP कणों के साथ colocalized, क्रमशः. हमारे विश्लेषण की पैदावार 31% और 55% oskar-MS2 MRNA के साथ oskar MRNA के प्रतिशत एक नर्स सेल और oocyte के कोशिका द्रव्य के भीतर MBs के साथ पता चला, क्रमशः. इसके अलावा, नर्स सेल और ऊसाइट कोशिकाद्रव्य दोनों में लंबी दूरी के परिवहन के लिए oskar MRNA ट्रैजेक्टरी निर्धारित करने के लिए 5D-स्टैक का और विश्लेषण किया जा सकता है (चित्र5)।

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Discussion

Drosophila अंडे कक्षों में अंतर्जात MRNA तस्करी का लाइव दृश्य अब आसानी से PinMol सॉफ्टवेयर के साथ डिजाइन किया जा सकता है, जो विशिष्ट, कुशल, और nuclease प्रतिरोधी MBs, के उपयोग पर निर्भर करता है। MBs एक लक्ष्य MRNA के भीतर अद्वितीय दृश्यों का पता लगाने के लिए डिज़ाइन विशिष्ट जांच कर रहे हैं (अधिमानतः माध्यमिक संरचना से मुक्त क्षेत्रों), संभव अत्यधिक एक प्रतिलिपि का पता लगाने का समाधान कर रही है. अन्य ऊतकों/सेल प्रकारों के लिए इस तकनीक/प्रोटोकॉल को अपनाते समय केवल एक ही सीमा ब्याज के नमूने के लिए एमबी वितरण की दक्षता है। जबकि अन्य दृष्टिकोण ऊतक के आनुवंशिक हेरफेर की आवश्यकता के लिए एक aptamer व्यक्त करने के लिए और एक आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग करने के लिए एक लक्ष्य MRNA कल्पना (उदाहरण के लिए MS2/MCP प्रणाली), मल्टीप्लेक्स के लिए संभव है, कम से कम, दो प्रतिलिपि. एमबी प्रौद्योगिकी जीवित कोशिकाओं में अंतर्जात MRNAs का पता लगाने के लिए अकेले खड़ा है, और यह केवल दो से अधिक MRNA प्रजातियों के सह दृश्य की अनुमति तकनीक है.

MBs फ्लोरोसेंट moieties की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ लेबल किया जा सकता है और सेलुलर वातावरण के भीतर स्थिर कर रहे हैं जब इस तरह के रूप में संशोधित न्यूक्लिओटाइड से संश्लेषित 2'-ओ-मिथाइलराइबोन्यूक्लिओटाइड या बंद न्यूक्लिक एसिड26,31. इन रीढ़ संशोधनों को भी अपने लक्ष्य के लिए MBs 'एफ़िनिटी में वृद्धि. कई MBs आसानी से औसत लंबाई के लक्ष्य mRNAs के लिए डिजाइन किया जा सकता है. हालांकि, कुछ सीमाओं का सामना छोटे और/या उच्च संरचित लक्ष्यों के लिए किया जा सकता है। इसे हमारे छोटे आणविक बीकनों को अपनाकर दूर किया जा सकता है , जिसके लिए जांच क्षेत्र क्लासिकल एमबी जांच31की लंबाई का लगभग आधा है. नमूना प्रकार के आधार पर, MBs इलेक्ट्रोपोरोनेशन के माध्यम से कोशिकाओं में वितरित कर रहे हैं, सेल-पेरेटिंग पेप्टाइड्स को जोड़ने, lipofection, या माइक्रोइंजेक्शन 23,32,33,34. लाइव सेल इमेजिंग प्रयोगों में एक एमबी के प्रदर्शन दक्षता MRNA लक्ष्य है, जो लक्ष्य संरचना द्वारा निर्धारित किया जाता है के भीतर इसी पूरक अनुक्रम को संकरित करने के लिए जांच अनुक्रम की क्षमता पर निर्भर करता है. in vitro मापा ऊष्मागतिकी पैरामीटर का उपयोग कर प्राप्त अनुमानित MFE आरएनए माध्यमिक संरचना लक्ष्य पहुँच का आकलन करने में मूल्यवान है, लेकिन अंततः यह vivo लक्ष्य संरचना और अन्य सेलुलर के साथ लक्ष्य बातचीत में है कारक है कि लाइव सेल इमेजिंग के लिए एमबी की उपयुक्तता का निर्धारण करेगा. आरएनए द्वितीयक संरचना के जीनोम-वाइड विश्लेषण से पता चलता है कि कई आरएनए इन विट्रो35की तुलना में विवो में कम संरचित होते हैं। हालांकि एमबी बी का उपयोग कर विवो लक्ष्य का पता लगाने में दक्षता मुख्य रूप से बाइंडिंग साइट की पहुंच पर निर्भर है, कुछ एमबी सुविधाओं का अनुकूलन MRNA लक्ष्य का एक बढ़ाया दृश्य सुनिश्चित करेगा. विशेष रूप से, निम्नलिखित मापदंडों का एक सावधान चयन किया जाना चाहिए: 1) जांच की लंबाई के बीच भिन्न हो सकते हैं 18 और 26, इस तरह है कि जांच के न्यूक्लिओटाइड संरचना के बीच है 31 और 55% GC जोड़े लक्ष्य में: MB संकर, 2) 5 बीपी स्टेम अनुक्रम G/ अमीर, MRNA लक्ष्य के अभाव में hairpin आकार बनाए रखने के लिए और बेमेल भेदभाव प्रदान करने के लिए, 3) एक संशोधित रीढ़ दोनों एमबी और लक्ष्य के nucleases के खिलाफ सुरक्षा के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए: एमबी संकर, 4) फ्लोरोफोर / एमबी के स्टेम करने के लिए मामूली स्थिरता, और 5) फ्लोरोफोर लंबी इमेजिंग समय अंतराल के दौरान स्थिर होना चाहिए। इसके अलावा, शास्त्रीय MBs आमतौर पर एक परमाणु गैर विशिष्ट संकेतउत्पन्न 34,जो हमारे मामले में केवल मामूली प्रभाव डेटा प्रसंस्करण और विश्लेषण. हालांकि, सेलुलर स्तर पर MRNA तस्करी दृश्य के लिए, इस गैर विशिष्ट संकेत समस्याग्रस्त हो सकता है. कई समूहों में संशोधन या टैग का प्रस्ताव किया है, जैसे tRNA, पेप्टाइड्स और नैनोकणों, जो नाभिक में MBs के वितरण को रोकने और इस प्रकार इस संभव गैर विशिष्ट संकेत को खत्म33,36.

इस दृष्टिकोण का सबसे बड़ा दोष लाइव सेल इमेजिंग के लिए MBs के मैनुअल डिजाइन किया गया है. इस पते पर, हम एक पायथन आधारित कार्यक्रम लिखा है (PinMol) कि आसानी से MFE के अलावा suboptimal माध्यमिक संरचनाओं पर विचार करके एक MRNA के भीतर सुलभ लक्ष्य साइटों की पहचान करता है, साथ ही डिजाइन hairpin जांच, जो सबसे अच्छा कर रहे हैं लाइव कोशिकाओं में mRNAs का पता लगाने के लिए उपयुक्त24| PinMol ऊर्जा minimization दृष्टिकोण के माध्यम से भविष्यवाणी लक्ष्य आरएनए के माध्यमिक संरचनाओं से संरचनात्मक जानकारी का उपयोग करता है, और suboptimal संरचनाओं से जानकारी सहित, लचीलापन या विशिष्ट लक्षित क्षेत्रों की कठोरता है मूल्यांकन जब MBs डिजाइन. यह लक्षित क्षेत्रों की पहुंच के साथ-साथ प्रत्येक चयनित जांच के अंतर और अंतर-अणुक अन्योन्यक्रियाओं को भी ध्यान में रखता है। इसके अतिरिक्त, आरएनए के अत्यधिक विनियमित हिस्सों (जैसे microRNAs या आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन के लिए बाध्यकारी साइटों) लक्ष्य साइटों के रूप में नहीं माना जाना चाहिए जब जांच का चयन, के रूप में इन क्षेत्रों MBs के अक्षम बाध्यकारी में परिणाम हो सकता है. उपयोगकर्ता इन साइटों को लक्षित करने वाली जांचों का मूल्यांकन और उसे समाप्त कर सकता है, या जांच डिज़ाइन करने के लिए PinMol द्वारा उपयोग किए गए लक्ष्य क्षेत्र को प्रतिबंधित कर सकता है ताकि इसमें ऐसी साइटें शामिल न हों. PinMol की सापेक्ष क्षमता मैन्युअल रूप से डिजाइन MBs24के प्रयोगात्मक परिणामों के साथ PinMol डिजाइन MBs की रैंकिंग की तुलना द्वारा प्रदर्शन किया गया था. Pinmol चयनित और इसी तरह के लक्ष्य क्षेत्रों के लिए MBs डिजाइन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से MRNA पर नए सुलभ साइटों की पहचान की. यह कम प्रतिलिपि संख्या प्रतिलिपि जहां फ्लोरोसेंट संकेत पृष्ठभूमि से ऊपर वृद्धि की जानी चाहिए का पता लगाने के लिए आवश्यक है. प्रभावी रूप से एक लक्ष्य MRNA पर कई सुलभ साइटों को संकरित जो एमबी संख्या स्केलिंग करके, संकेत प्रवर्धन प्राप्त किया जा सकता है. इसलिए, इस कार्यक्रम के लक्ष्य MRNA प्रति कई MBs डिजाइन करने के लिए एक तेजी से दृष्टिकोण की सुविधा, और एक साथ एक जीवित सेल में कई MRNAs कल्पना करने के लिए.

आदेश में उच्च गुणवत्ता 5D प्राप्त करने के लिए (XY$Ct) अंडे कक्ष के भीतर ले जाया mRNAs के अधिग्रहण डेटा, व्यक्तिगत अंडे कक्षों के उचित विच्छेदन और नर्स कोशिकाओं में प्रभावी माइक्रोइंजेक्शन महत्वपूर्ण हैं. विकास के प्रारंभिक चरणों के दौरान अध्ययन के लिए, माइक्रोइंजेक्शन अंडे कक्ष की व्यवहार्यता के लिए हानिकारक हो सकता है और इस प्रकार एक जीवित सेल इमेजिंग प्रयोग की लंबाई छोटा है (और lt;20 मिनट). माइक्रोइंजेक्शन प्रयोगों की बढ़ी हुई सफलता दर को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अल्ट्राफाइन सुइयों का उपयोग करके सुनिश्चित किया जा सकता है। इसके अलावा, अधिग्रहण सेटिंग्स का एक त्वरित सेट-अप महत्वपूर्ण है ताकि जल्दी, बाद इंजेक्शन समय अंक पर कब्जा कर लिया जा सकता है। स्थान का पता लगाने और ट्रैकिंग डेटा की गुणवत्ता केवल प्राप्त छवियों की गुणवत्ता के रूप में के रूप में अच्छा होगा.

छवि अधिग्रहण पर, यह आवश्यक है कि बाद में विश्लेषण कदम भी ध्यान से और ठीक पूरा कर रहे हैं. हालांकि बाद अधिग्रहण प्रसंस्करण और विश्लेषण कठिनाइयों के अपने स्वयं के सेट प्रदान करते हैं, वे एक विशेष प्रयोग या नमूने के लिए उपयुक्त सॉफ्टवेयर का चयन करके सुव्यवस्थित किया जा सकता है. वर्तमान मौजूदा कार्यक्रमों में Volocity (PerkinElmer), Imaris (Bitplane), ImageJ/Fifi और Icy37शामिल हैं। तीन में से, Icy कई लाभ प्रदान करता है, के रूप में यह एक खुला समुदाय मंच है कि के लिए अनुमति देता है, दोनों, प्रसंस्करण (ImageJ के माध्यम से) और इमेजिंग डेटा का विश्लेषण. यहाँ हम Icy का उपयोग कर आरएनए इमेजिंग डेटा के कुशल प्रसंस्करण और विश्लेषण के लिए आवश्यक कदम का वर्णन. हमारे परिणाम एक पूरे अंडे कक्ष में दो MRNA प्रजातियों सह visualizing द्वारा और एमबी प्रौद्योगिकी और MS2 /MCP प्रणाली के माध्यम से एक MRNA पर नज़र रखने के द्वारा प्राप्त डेटा के प्रतिनिधि हैं.

Icy सॉफ्टवेयर के साथ पोस्ट अधिग्रहण प्रसंस्करण छवि प्रसंस्करण में उपयोगकर्ता लचीलापन प्रदान करता है (जैसे चमक, इसके विपरीत) और विश्लेषण (जैसे थ्रेशोल्ड / . Icy भी प्रोटोकॉल संपादक चलाने के प्रत्येक ब्लॉक के भीतर नियंत्रण प्रासंगिक पैरामीटर सक्षम बनाता है (जैसे colocalization दूरी निर्धारित करने और "कोलोकाइज़र" ब्लॉक में "अधिकतम दूरी" के रूप में इसका इस्तेमाल). Icy सॉफ्टवेयर लांच पर अद्यतन किया जाता है, और विश्वसनीय ऑनलाइन समर्थन करने के लिए किसी भी समस्याओं का निवारण है. वर्णित प्रोटोकॉल oskar MRNA का पता लगाने के लिए डिजाइन किया गया था और प्रतिनिधि परिणाम का पता लगाया और ट्रैक किया जा करने के लिए MRNA कण की तरह के लिए अनुकूलित मानकों का उपयोग कर प्राप्त किया गया. उदाहरण के लिए, oskar mRNA एक प्रचुर मात्रा में प्रतिलिपि है कि मुख्य रूप से oogenesis के मध्य चरणों के दौरान ले जाया जाता है, microtubule नेटवर्क का उपयोग और गतिशील रूप से oocyte के विकास के दौरान विभिन्न प्रोटीन कारकों के साथ संबद्ध. हमने पहले बताया था कि ओस्कर एमआरएनपी नर्स कोशिकाओं से ओसाइट23में परिवहन के दौरान व्यापक पुन: तैयार रहता है . इसके अलावा, MBs का उपयोग कर हम अंतर्जात oskar MRNA तस्करी के लौकिक और स्थानिक विशेषताओं की विशेषता है, और पाया कि oskar प्रतिलिपि प्रतियां के सैकड़ों बड़े oskar MRNPs फार्म शामिल किया जा सकता है.

colocalization और ट्रैकिंग के लिए पोस्ट अधिग्रहण विश्लेषण भी Imaris, ImageJ/Fifi और Volocity के रूप में अन्य सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया जा सकता है. Icy सीमा और उच्च संवेदनशीलता और ट्रैकिंग क्षमताओं के साथ फ्लोरोसेंट कणों एनोटेट करने के लिए अपनी क्षमता के लिए चुना गया था. यहाँ, हम वस्तु आधारित colocalization का वर्णन है, लेकिन colocalization, हालांकि ट्रैकिंग के बिना, भी ओवरलैप और colocalization की डिग्री का निर्धारण करके मात्रा निर्धारित किया जा सकता है पीसीसी (Costes) विश्लेषण Icy और ImageJ plugins का उपयोग कर (Colocalization स्टूडियो, JACOP) 38 , 39.

भविष्य में, एक अनुकूलित, लंबी अवधि के इमेजिंग प्रोटोकॉल विस्तारित अंडा कक्ष अस्तित्व सुनिश्चित करने के लिए वांछित है। यह लंबी दूरी के एमआरएनए तस्करी अध्ययनों से संबंधित आंकड़ों का विश्लेषण करने के लिए लंबे समय तक अधिग्रहण प्रदान करेगा।

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Disclosures

लेखकों के हित का कोई टकराव का खुलासा नहीं है.

Acknowledgments

हम ऑसकर-MS2 के लिए Salvatore A.E. Marras (सार्वजनिक स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान केंद्र, Rutgers विश्वविद्यालय) के संश्लेषण, लेबलिंग और आणविक बीकन के शुद्धिकरण के लिए धन्यवाद, और डैनियल सेंट जॉन्स्टन (गर्दन संस्थान, कैम्ब्रिज विश्वविद्यालय) के लिए MCP-GFP ट्रांसजेनिक मक्खी स्टॉक. इस काम को एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन केअर अवार्ड 1149738 और डीपीबी को व्यावसायिक स्टाफ कांग्रेस-CUNY पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectrofluorometer Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon n/a Photon counting spectrofluorometer
Quartz cuvette Fireflysci (former Precision Cells Inc.) 701MFL
Dumont #5 tweezer World Precision Instruments 501985 Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers
Halocarbon oil 700 Sigma-Aldrich H8898
Cover slip No.1 22 mm x 40 mm VWR 48393-048
Dissecting microscope Leica MZ6 Leica Microsystems Inc. n/a
CO2 fruit fly anesthesia pad Genesee Scienific 59-114
Tris-HCL pH 7.5 Sigma-Aldrich 1185-53-1
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 7791-18-6
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
Spinning disc confocal microscope Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc. n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera Hamamatsu n/a
PatchMan NP 2 Micromanipulator Eppendorf Inc. 920000037
FemtoJet Microinjector Eppendorf Inc. 920010504
Injection needle: Femtotips II Eppendorf Inc. 930000043
Loading tip: 20 μL Microloader Eppendorf Inc. 930001007
Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22 mm x 40 mm VWR 48393-026; 48393-172
Dry yeast Any grocery store n/a
Computer, > 20 GB RAM Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing

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References

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जीव विज्ञान अंक 148 आणविक बीकन लाइव सेल इमेजिंग अंतर्जात MRNA दृश्य MRNA तस्करी Drosophila मेलेनोगैस्टर अंडा कक्ष अंडा कक्ष microinsinctions colocalization कण ट्रैकिंग.
दृश्य और ट्रैकिंग अंतर्जात MRNAs में लाइव <em>Drosophila मेलेनोगैस्टर</em> अंडे मंडलों
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Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers. J. Vis. Exp. (148), e58545, doi:10.3791/58545 (2019).

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