Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Visualisera och spåra endogena mRNAs i levande Drosophila melanogaster ägg kammare

Published: June 4, 2019 doi: 10.3791/58545
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1,2
1Biological Sciences Department Hunter College, City University of New York, 2Program in Molecular, Cellular, and Developmental Biology, Graduate Center, City University of New York

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för visualisering, detektering, analys och spårning av endogent mRNA-handel i levande Drosophila melanogaster ägg kammare med hjälp av molekylära beacons, spinning Disc konfokalmikroskopi, och öppen källkod analys Programvara.

Abstract

Fluorescence-baserade avbildningstekniker, i kombination med utvecklingen i ljusmikroskopi, har revolutionerat hur cell biologer genomföra levande cell avbildning studier. Metoder för att upptäcka rnas har expanderat kraftigt sedan nyskapande studier länkade platsspecifika mRNA lokalisering till gen uttrycks reglering. Dynamiska mRNA-processer kan nu visualiseras via metoder som detekterar mRNAs, tillsammans med mikroskopiuppställningar som är tillräckligt snabba för att fånga det dynamiska utbudet av molekylära beteenden. Molekylär Beacon Technology är en hybridisering-baserad metod som kan direkt detektering av endogena utskrifter i levande celler. Molekylära fyrar är hårnål-formad, internt släckt, single-nucleotide diskriminerande nukleinsyra sonder, som fluorescerar endast vid hybridisering till en unik målsekvens. I kombination med avancerad fluorescens-mikroskopi och högupplöst avbildning gör de det möjligt för en att utföra rumslig och tidsmässig spårning av mRNAs-intracellulär rörelse. Även om denna teknik är den enda metod som kan upptäcka endogena utskrifter, har cell biologer ännu inte helt anammat denna teknik på grund av svårigheter att utforma sådana sonder för levande cell avbildning. En ny programvara applikation, Pinmol, möjliggör förbättrad och snabb design av sonder bäst lämpade för att effektivt hybridisera till mRNA mål regioner inom en levande cell. Dessutom, högupplöst, realtid bild förvärv och nuvarande, öppen källkod bildanalysprogram vara möjliggör en raffinerad dataproduktion, vilket leder till en finare utvärdering av komplexiteten bakom de dynamiska processer som ingår i mRNA livscykel.

Här presenterar vi ett omfattande protokoll för att designa och leverera molekylära beacons till Drosophila melanogaster Egg Chambers. Direkt och mycket specifik detektion och visualisering av endogena maternell mRNAs utförs via spinning Disc konfokalmikroskopi. Imaging data bearbetas och analyseras med hjälp av objektdetektering och spårning i isiga programvara för att få information om den dynamiska rörelsen hos mRNAs, som transporteras och lokaliseras till specialiserade regioner inom äggocyten.

Introduction

Cellbiologi studier som visualiserar dynamiska händelser med rumslig och tidsmässig upplösning har möjliggjorts genom utveckling av fluorescensbaserade tekniker för levande cell avbildning. För närvarande, in vivo mRNA visualisering uppnås via teknik som är baserade på RNA aptamer-proteininteraktioner, RNA aptamer-inducerad fluorescens av organiska färgämnen och nukleinsyra sond glödgning1,2, 3. de erbjuder alla hög specificitet, känslighet och signal-till-bakgrund förhållande. Men RNA aptamer-centrerad metoder kräver omfattande genetisk manipulation, där en transgenens är konstruerad för att uttrycka ett RNA med konstgjorda strukturella motiv som krävs för protein eller organiska färgämnes bindning. Till exempel kräver MS2/MCP-systemet ett co-Expression av en transgenens som uttrycker en RNA-konstruktion som innehåller flera tandem upprepningar av bindningssekvens för bakteriofagen MS2 Coat protein (MCP), och en annan transgenens som kodar för ett fluorescerande protein smält till MCP4,5. Tillsatsen av sådana sekundära strukturella motiv till RNA, tillsammans med en skrymmande Fluorescent märkta protein, har väckt farhågor om att infödda RNA processer kan påverkas6. En teknik som tar itu med denna oro och erbjuder ytterligare unika fördelar är den nukleinsyra-baserade metoden, molekylära beacons (MBs). MBS möjliggör multiplex detektion av endogena mRNA, diskriminering av enstaka nukleotid variationer, och snabb kinetik av hybridisering med mål mrná7,8. MBs är oligonukleotid sonder som stannar kvar i en släckt hårnål gånger innan de genomgår en fluorogena konformationsförändring när de hybridisera sina mål (figur 1c)9. Flera grupper har haft framgång med att använda MBS för att detektera både icke-kodning av rnas (micrornas och lncrnas)10,11,12,13, RNA retrovirus14 och Dynamic DNA-protein interaktioner15. De har framgångsrikt använts för avbildning i olika organismer och vävnader, såsom zebrafiskar embryon16, nervceller13, tumör vävnad17, differentiera kardiomyocyter18, och salmonella 19.

Här beskriver vi utformningen, leveransen och detekterings metoden för endogena mRNAs i Living D. melanogaster ägg kammare tillsammans med en mikroskopi set-up som är tillräckligt snabb för att fånga det dynamiska utbudet av aktiva molekylära transporter. D. melanogaster Egg Chamber har fungerat som ett idealiskt flercelliga modellsystem för ett brett spektrum av utvecklingsstudier, från tidig köns cells stamcells Division och moderns genuttryck till generering av segmentell Body plan20, 21. Egg Chambers är lätt isolerade, stora och genomskinliga, och kan motstå timmar av ex vivo analys, vilket gör dem mycket mottagliga för Imaging experiment. Mycket arbete har fokuserat på asymmetrisk lokalisering av maternella utskrifter till diskreta subcellulära regioner innan de aktivt översätts. I synnerhet måste Oskar mRNA lokalisering och dess efterföljande översättning vid äggcell-stolpen ske på ett tätt reglerat sätt för att undvika en dödlig bicaudal embryonal fenotyp22. Oskar mRNA transkriberas i de 15 köns cells cellerna, kallas sjuksköterska celler, och aktivt transporteras genom cytoplasmiska broar, kallas ring kanaler, in i äggcell, den köns cells cellen som blir det mogna ägget och slutligen befruktas (figur 1a ). Den avsevärda mängd information som redan finns tillgänglig om den dynamiska rekryteringen och utbytet av protein faktorer till och från Oskar mRNP, tillsammans med dess långväga intracellulära resor, gör Oskar till föredragen kandidat för att studera de många processerna i mRNA livscykel. MBs har varit avgörande för att avslöja detaljer om processen för mRNA lokalisering och dechiffrera regleringen och funktionen av protein faktorer som styr mRNA transport under Drosophila oogenesis. I synnerhet genom att mikroinjicera MBS i sjuksköterska celler och utföra levande cell Imaging experiment, spårning av endogena mrnas är möjligt8,23.

Den färdplan som presenteras här erbjuder stegen i en komplett process, från att utföra en levande cell Imaging experiment med MBs, förvärva Imaging data, att utföra dataanalys för att spåra endogena mRNA i sin inhemska cellulära miljö. Stegen kan modifieras och optimeras ytterligare för att tillgodose behoven hos forskare som arbetar med andra vävnader/celltyper inom sin egen laboratoriemiljö.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. utformning av MBs för levande cell avbildning

  1. Vik mål RNA-sekvensen för att förutsäga mRNA Target sekundära struktur med hjälp av "RNA form" från mfold server (http://unafold.RNA.Albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-form).
    1. Klistra in/Ladda upp målsekvensen i FASTA-format, Välj 5 eller 10% sub-optimality (strukturer med en fri energi av vikning inom 5 eller 10% av MFE-värdet, respektive), och justera det maximala antalet beräknade vikningar i enlighet därmed (t. ex. större för 10% under optimalitet).
      Anmärkning: införande av suboptimala sekundära strukturer vid utformningen av MBs möjliggör identifiering av regioner inom Target mRNA som kan vara mer flexibla eller styvare än vad som förutsagts för den minsta fria energin (MFE) struktur ensam, vilket förbättrar övergripande utformningen av MBs lämpar sig för levande cell avbildning.
    2. Välj ett "omedelbart jobb" för mRNA mål på 800 nukleotider (NT), eller en "batch-jobb" för mRNA längder mellan 801 och 8 000 NT. Spara "SS-count" filen som enkel textfil.
  2. Använd "SS-count" fil som erhållits i steg 1,1 som indata för pinmol programmet (https://bratulab.wordpress.com/Software/) med de önskade parametrarna, att designa flera MBS för mRNA Target (se tutorials beskriver användning av pinmol program 24 på https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-Mac/).
    1. Bestäm specificiteten hos valda MBs genom att utföra Spräng analys: Använd "blastn" med lämplig databas (t. ex. för Oskar mRNA-specifika MBS Använd "RefSeq-RNA"-databasen och Drosophila melanogaster -organismen).
    2. Identifiera alla vävnadsspecifika uttryck för mRNA-mål (t. ex. för Oskar mRNA flybase > data med högt dataflöde ≫ Flyatlas Anatomy microarray eller modENCODE Anatomy RNA-Seq; http://flybase.org/Reports/FBgn0003015) och jämför med alla positiva BLAST träffar. Eliminera sonder som visar > 50% Cross-homologi med andra mRNA som också uttrycks i vävnaden/cellen av intresse.
  3. Välj de fluorophore-och quencherpar som är lämpliga för den mikroskopi-uppsättning som finns tillgänglig för att utföra Live-cellavbildning (t. ex. Cy5/BHQ2)25.

2. MB syntes, rening och karakterisering

  1. Använd in-House syntes och rening som tidigare beskrivits7, eller tjänster från kommersiella leverantörer, att syntetisera och rena en till fem MBS (se ovan anmärkning), med hjälp av följande märkning schema: [5 ' (fluorophore)-(C3 eller C6 Linker)-(2 '-O -metyl MB sekvens)-(quencher) 3 ']. Rena MBs med omvänd fas HPLC, i huset eller med hjälp av den kommersiella leverantörens tjänster.
    Anmärkning: Den fosforamiditer som används för automatiserad sond syntes måste ha 2 '-O-metyl ribonucleotiden modifiering. Man kan också använda chimärer av alternerande låst-nukleinsyra (LNA) och 2 '-O-metyl modifieringar för att öka stabiliteten hos en hybrid mellan en kortare MB och dess mål mRNA26.
  2. Syntetisera DNA oligonukleotides som matchar sekvensen av den riktade RNA-regionen och därmed kompletterar sonden regionen MBs, för användning i in vitro -karakterisering (se steg 2,3 till 2,5; ovanstående anmärkning). Maximera hybridisering av MB med DNA-oligonukleotide mål härma, genom att inkludera på vardera änden av DNA-målet fyra ytterligare nukleotider, som finns i målet mRNA sekvens.
    Anmärkning: en mer rigorös karakterisering av MB: s effektivitet för att upptäcka den riktade sekvensen kan utföras med in vitro syntetiserade RNA-mål i stället för kompletterande DNA oligonukleotides8.
  3. Utför termisk denaturering av enbart MB, Mät dess smälttemperatur (TM), och bekräfta att MB förutsätter önskad hårnål form vid fysiologisk temperatur. Vi har observerat TM-värden mellan 60 och 90 ° c.
  4. Utför termisk denaturering av MB i närvaro av DNA oligonukleotide mål och mäta MB: DNA Target hybrid ' s TM, som tidigare beskrivits7. En TM mellan 55 och 60 ° c önskas för MB: DNA hybrid.
  5. Utför in vitro-hybridiserings reaktioner med motsvarande DNA oligonukleotidmål, och bestäm verkningsgraden för MB: DNA-hybridbildning vid fysiologisk temperatur, som tidigare beskrivits7. Snabb hybridisering kinetik med DNA mål härma önskas, men MBs som inte visar hög hybridisering effektivitet med DNA-mål kan ha en bättre prestanda med målet mRNA in vitro-och/eller in vivo.

3. dissektion och beredning av enskilda ägg kammare för mikroinjektion

  1. Foder nykläckt, Parade Honor för 2-3 dagar med färsk jäst pasta.
  2. Anesthetize flyger på en CO2 pad och med fin pincett (Dumont #5), överföra 1-2 honor i en droppe Halocarbon olja 700 på ett glas täcka slip.
  3. Med hjälp av ett par pincett, orientera flyga med ryggsidan upp under ett stereomikroskop. Dissekera den kvinnliga buken genom att göra ett litet snitt i den bakre änden och försiktigt pressa paret av äggstockarna i oljan.
  4. Explant äggstockarna på en olje droppe på en ny täckslip. Håll försiktigt en äggstock med en pincett medan du klämmer bort de yngsta stadierna av ovariole med den andra pincett. Oskar mRNA är aktivt lokaliserad vid och efter mitten oogenesis (stadier > 7), och yngre ägg kammare (stadier < 7) är svårare att injicera och överlever inte så länge. Dra långsamt på locket slip (med en nedåtgående rörelse) tills enskilda ovarioler eller ägg kammare isoleras och justeras vertikalt. Ytterligare separata enda ägg kammare genom att tränga undan oönskade stadier från ovariole Egg Chain.
    Anmärkning: Se till att individuellt retade ägg kammare inte flyter i oljan, och att de följer täckslip. Detta är viktigt för både lyckad mikroinjektion och bild förvärv.

4. mikroinjektion av MBs i sjuksköterskans celler av ägg kammare

  1. Förbered MB-lösningen med en molekylär Beacon (t. ex. osk2216Cy5), eller en blandning av två MBs som riktar in sig på olika mRNA och som är märkta med spektralt distinkta fluoroforer (t. ex. osk2216Cy5 och drongo1111Cy3). Använd en koncentration av 200-300 ng/μL varje MB i HybBuffer (50 mM Tris-HCl-pH 7,5, 1,5 mM MgCl2 och 100 mm NaCl). För en cocktail av fyra MBs märkta med samma fluorophore som riktar sig till samma mRNA vid 200 ng/μL vardera i HybBuffer (t. ex. osk82, osk1236, osk2216). Snurra ner MB-lösningen omedelbart innan du laddar nålen för mikroinjektion.
  2. Välj mål. En 40x olja mål rekommenderas för att hitta en lämplig ägg kammare och för att utföra mikroinjektion.
  3. Montera täckglas med dissekerade ägg kammare på mikroskopet scenen. Ta upp målet i fokuspositionen och identifiera en ägg kammare vid en mitten till sent utvecklingsstadiet, som är korrekt orienterad för mikroinjektion (dvs, med AàP axeln vinkelrätt mot nålspetsen för att möjliggöra enkel injektion inom en sjuksköterska cellen proximalt för äggocyten).
  4. Ladda en nål (kommersiell eller beredd i hus27) med ~ 1 μl MB lösning (Se steg 4,1) och Anslut den till mikroinjektorn. För mikroinjektioner i D. melanogaster ägg kammare, orientera nålen (se tabell över material) i en vinkel < 45 ° till mikroskopet skede (t. ex. 30 °) för att undvika punktera flera sjuksköterska celler.
  5. Ställ in injektorn med insprutningstryck på 500-1000 hPa och kompensations tryck på 100-250 hPa (se tabell över material).
  6. Sakta flytta scenen för att få i synfältet ett område av oljan droppe tomrum ägg kammare.
  7. Använd mikromanipulatorjoysticken och sänk försiktigt in nålen i olje droppen och ta spetsen i fokus mot synfält.
  8. Utför en "ren" funktion för att ta bort luften från nålspetsen och för att säkerställa att det finns flöde från nålen.
  9. Ta nålen till hempositionen och fokusera på ägg kammaren som ska microinjected, sedan föra nålen tillbaka till fokus och placera den nära kanten av ägg kammaren.
  10. Utför en finjustering av målet Z-position så att membranet separera follikeln celler från sjuksköterska celler är i fokus.
  11. Sätt in nålen i en sjuksköterska cell och utför injektion för 2-5 s.
  12. Ta försiktigt bort nålen och dra tillbaka den till hempositionen.
  13. Ändra målet till önskad förstoring för bild förvärv (60-63x eller 100x), fokusera på ägget kammaren, och börja förvärvet.

5. förvärv av data med hjälp av en snurrande skiva Konfokal Mikroskop setup

Anmärkning: Se tabell över material för våra specifika inställningar.

  1. Ställ in anskaffnings protokoll för att spela in en XYZCt-stapel med 8-16-bitarsbilder (XYZ = volym, C = kanal, t = tid).
  2. Välj laserlinjer för önskade kanaler (t. ex. 641 nm Laser för Cy5 och 491 Nm för GFP) och förvärva kanalerna sekventiellt: först fluorescens signalen i varje kanal och sedan ändra Z position, för att möjliggöra korrekt colocalization analys.
  3. Välj Z-steg (t. ex. 0,3 μm) och de övre och nedre Z-gränserna (t. ex. -2 μm till 2 μm).
  4. Mata in förvärvs tid och samplingsfrekvens (t. ex. varje 15-30 s i upp till 1 h).
  5. Initiera förvärvet.

6. behandling, data analys för att få spårnings-och samlokalisering information, och beredning av videofiler

  1. Bildbehandling
    1. Ladda ner, packa upp och öppna Icy, en öppen community plattform för bioImage informatik (http://icy.bioimageanalysis.org/)
    2. Öppna XYZCt-stacken som du fick i steg 5: bild/sekvens > fil > öppen.
    3. Konvertera stack till ImageJ: ImageJ > Verktyg > Konvertera till IJ, har frånkopplat läge på.
    4. Gör en Substack (ett urval av ett intervall av Z-steg och tidpunkter för att ytterligare analyseras): ImageJ > Bild > stackar > Verktyg > göra Substack...; Välj önskade kanaler, Z-steg och tidspunkter.
    5. Spara Substack som TIFF-fil: ImageJ > fil > Spara som > TIFF...; Använd den här filen för efterföljande steg.
    6. Dela kanaler: ImageJ > Bild > färg > dela kanaler.
    7. Subtrahera bakgrund antingen med hjälp av en bakgrund stack: ImageJ > process > bild kalkylator..., eller använda Rolling Ball alternativ: ImageJ > process > subtrahera bakgrund..., Välj den rullande bollen radie. Förhandsgranska bilden för den radie som valts innan du väljer "Accept".
      Obs: bakgrunds signalen kommer främst att uppstå vid felaktig kylning av flurorophore. Signalen: bakgrunds förhållandet (S:B) används ofta som en indikator för en MB ' s "ljusstyrka", och det mäts från in vitro -hybridisering experiment av MB och DNA-målet oligonukleotide. Till exempel MBs osk1236 och osk2216 har en S:B av ~ 81 och ~ 120, respektive.
    8. Justera ljusstyrka och kontrast för varje kanal: ImageJ > Bild > Justera > ljusstyrka/kontrast, Välj Verkställ.
    9. Spara varje kanal som en separat TIFF-fil: ImageJ > fil > Spara som > TIFF....
    10. Sammanfoga de två kanalerna: ImageJ > Bild > färg > sammanfoga kanaler...; Välj kanalerna. Spara den nya stacken som en ny TIFF-fil (Se steg 6.1.8).
  2. Upptäcka och spåra
    1. Konvertera tillbaka till Icy: ImageJ > Verktyg > Konvertera till isiga.
    2. En Scale bar automatiskt överlagras på stacken vid konvertering till isiga, om Scale Bar plugin är installerad [Sök med hjälp av plugins > Setup > online plugin]. Om det behövs redigerar du skalstapeln via Inspector-fönstret (höger sida av skärmen) > fliken Lager > namn > Skalstapel.
    3. Avmarkera/inaktivera ikonen ' öga ' för skal fält från fliken Lager > namn för att ta bort skalstapeln från den ursprungliga stacken. Det kan återaktiveras på den slutliga stacken.
    4. Spara den nyligen bearbetade stacken genom att ta en skärmdump med hjälp av "kamera"-ikonen från bildfönstrets menyrad, "ta en skärmdump av aktuell vy" och fil > Spara som > TIFF....
    5. Bestäm dekor känslighet, om punkt känslighets parametrar redan har bestämts gå vidare till steg 6.2.7.
    6. Upptäcka fläckar: Välj fönstret med bilden eller stacken som ska analyseras, detektering & spårning > detektering > spot Detector, och fyll i inställningarna parametrar:
      1. För indata, välj "currentSequenceInputDetection" (standard).
      2. För förbehandling, välj "kanal 0" (standard), eller önskad kanal genom att korsreferera numret i Inspector-fönstret > sekvens fliken.
      3. För detektor, välj "identifiera ljuspunkt över mörk bakgrund;" Använd "tvinga användning av 2D Wavelets för 3D" endast om det inte finns tillräckligt med Z-Slices i stackarna för att utföra analysen. Välj "skala (er)" och "känslighet" för varje skala (Lägg till fler skalor för större fläckar). Skalan och känsligheten (ju större siffra desto känsligare är upptäckten, ett maximum av 140 föreslås av Icy) är Trial-och Error-variabler, som måste kontrolleras visuellt efteråt och beslutas.
      4. För region av intresse, Använd "ROIfromSequence" (standard).
      5. För filtrering, Använd "NoFiltering" (standard), eller välj "SizeFiltering" för att definiera "intervallet av accepterade objekt (i pixlar)".
      6. Output: Välj XLS eller XML-utdatainställning (Välj XML-format när du använder 2007 MS Excel eller tidigare och det finns > 65000 fläckar). Om spotdetektorns resultat används för spårnings analysen, Välj även "Exportera till SwimmingPool".
      7. Upprepad detektering av fläckar med olika skala/känslighet värden tills alla eller de flesta av fläckarna upptäcks. Registrera alla de slutgiltiga parametrarna.
      8. För samlokalisering analys, upprepa spot Detection för den andra kanalen.
    7. Om du vill spåra platser väljer du identifiering & spårning > spårning > punkt spårning > Kör plats detektorn med parametrar från steg 6.2.6., eller Använd "Välj detekterings resultat här" nedrullningsbara menyn för att välja en befintlig datauppsättning (för detta, hållpunkt detektor fönster öppna från steg 6.2.5). Tryck på knappen "uppskattnings parametrar" och välj önskad rörelse i popup-fönstret parametrar uppskattning (t. ex. "är både diffusiv och riktad"). Tryck på knappen "kör tracking".
    8. Upprepa spot-detektering och spårning för andra kanaler när du spårar punkter i flerkanaliga stackar, följer steg 6.2.6 och 6.2.7, med början med stacken som genereras från steg 6.2.7.
    9. Om du vill visualisera spår väljer du identifiering & spårning > spårning > Spårhanterare – det här fönstret öppnas automatiskt när en spårnings körning har slutförts. För "färg spår processor," Välj "Aktivera" och välj önskad representation av färg för spåren. Relevanta spår processorer kan nås via "Lägg till spår processor..." nedrullningsbara menyn (t. ex. Välj "spåra processor tid klipp," Aktivera "Track Clipper"-fönstret och välj önskat antal identifieringar som ska visas före och efter den aktuella tidspunkten.)
    10. Spara spårinformation som en XML-spårfil: identifiering & spårning > spårning > Spårhanterare > fil > Spara som....
    11. Spara resultat genom att ta en skärmbild med ikonen "kamera" från bildfönstrets menyrad, "ta en skärmbild av aktuell vy". Skärmdumpar kan tas med de upptäckta fläckar och/eller spåren helt enkelt genom att aktivera/avaktivera motsvarande öga ikon (er) som finns i inspektör fönster > fliken Lager > namn > overlay omslag.
    12. Installera tidsstämpel overlay plugin: plugins > Setup > online plugin > tidsstämpel overlay > Installera.
    13. Lägg till tidsstämpel: tillägg > tidsstämpel overlay (ny). Följ instruktionerna på popup-fönstret (nedre högra hörnet av skärmen) för anvisningar om placering och formatering av tidsstämpel. Tidsintervallet kan läggas till/ändras i fönstret granskare > sekvens > sekvens egenskaper > Redigera.
    14. Spara resultat genom att ta en annan skärmdump. Spara bild som 1) TIFF-format, och 2) som AVI-format; för AVI-format först konvertera till RGB-rendering (bild/sekvens > rendering > RGB-bild).
    15. Rotera bilden till önskad orientering: inspektör fönster > sekvens fliken > arbetsytan > rotation.
    16. Spara roterad bild med "ta en skärmdump av den aktuella vyn". Se till att "Eye"-ikonen för skalstapeln är avmarkerat, eftersom den även roterar med bilden.
    17. Välj och beskär ROI: Välj intresseområde > 2D ROI > Välj ROI-form och skapa/Rita ROI på bilden. Bild/sekvens > plan (XY) > snabb beskärning.
  3. Colocalization analys
    1. Förbered ett protokoll för colocalization; flera exempel finns på isiga hemsida (http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/List) (se kompletterande material).
    2. Ladda colocalization Protocol: Verktyg > skript > protokoll > Load, och justera parametrar i de samverkande blocken (t. ex. i "Wavelet spot upptäcka" blockera använda parametrar bestäms i steg 6.2.6.).
    3. Mät storleken på en partikel i pixlar, bestämma colocalization avstånd och mata in den i "Colocalizer" block som "Max avstånd."
      Anmärkning: Storleken på partikeln i pixlar beror på detekterings systemet. För att mäta storlek, zooma in en enda partikel och manuellt räkna pixlar som spänner över bredden av signalen över. Medelvärdet av mätningarna från minst tre partiklar. Det maximala avståndet som ska ställas in för colocalization är storleken på partikeln i pixlar (Detta motsvarar den maximala summan av radien för två partiklar som vidrör).
    4. Om du vill väljer du en eller flera ROIs för samlokalisering analys: intresseområde > 2D ROI > Välj ROI-form > Rita ROI på bilden.
    5. Gröda ROI (s): bild/sekvens > Plane (XY) > snabb skörd.
    6. Utföra colocalization: protokoll redaktör fönster > valde protokoll Tab > springa. Den final kloss i protokollen redaktör fönster vilja innehålla rock colocalization procent baserat på fläck upptäckten, fördriva tiden informationen på var tid punkt kanna bli grunda i inspektör fönster > produktionen tab.
    7. Spåra samlokaliserade och enstaka partiklar genom att följa steg 6.2.7 (spårpunkter).
    8. Spara som beskrivs i steg 6.2.16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med Pinmolkan flera MBS utformas för ett mRNA-mål (figur 1b-C). Efter syntes och rening, de valda MBs kännetecknas och jämförs med in vitro-analys.

Figure 1
Figur 1: teknik-och vävnads beskrivning för levande cell avbildning av endogena mRNAs. Aavbildning av en Drosophila ägg kammare i mellanstadiet som används för mikroinjektion. Mikroinjektionsnålen (grön) ger en cocktail av molekylära beacons som är specifika för Oskar mRNA. En snabb injektion i en sjuksköterska cell möjliggör detektion av mRNA i transit till äggocyten, samt visualisering av redan lokaliserad MRN vid den bakre cortex. (B) pinmol programvaru produktion av molekylär Beacon ranking för inriktning Oskar mRNA (C) sekundär struktur region inom Oskar mRNA riktad mot en molekylära Beacon. (C) Sekvens och vikning av Oskar-specifik molekylär beacon, osk2216. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Efter optimal prestanda av MBs bekräftas via in vitro karakterisering, sonderna används för Live visualisering av endogena Target mRNA (s). Det är möjligt att visualisera mönstren för Oskar mRNA transport och lokalisering i olika stadier av oogenesis, och i synnerhet vid och efter mitten oogenesis (7-10) (figur 2A-B). På grund av sin ringa storlek är det svårt att injicera ägg kammare i mycket tidiga skeden (1-4). När de injiceras individuellt i samma skede ägg kammare, Oskar-specifika MBS uppvisar samma mönster av lokalisering (figur 2, osk1236 vs osk2216).

Figure 2
Figur 2: tidssekvens av Oskar mRNA i vild typ ägg kammare vid t = 0, 10 och 30 min tid poäng, efter initiering av förvärvet. Sjuksköterska cell injektioner av två Oskar-specifika molekylära fyrar (osk1236 och osk2216) i (a) steg 6-7 ägg kammare och (B) steg 9 ägg kammare. Scale bar = 20 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Olika mRNA mål kan vara co-visualiseras med hjälp av spektralt distinkta överföras märkt MBS (figur 3). MB-lösningen kan mikroinjiceras i en sjuksköterska cell (figur 3a) eller i äggocyten (figur 3b). MBs injiceras i en sjuksköterska cellens cytoplasman kommer fritt sprida sig till andra sjuksköterska celler samt in i äggcell, och därmed kan hitta sina mål och generera fluorescens signal på andra platser än mikroinjektions stället. Till exempel, när du utför mikroinjektioner i en sjuksköterska cell i en sen oogenes skede (9-10) ägg kammare, de flesta av fluorescenssignalen visualiseras inom äggcell genereras av den redan lokaliserade Oskar mRNA, och mindre genom att aktivt transporteras avskrifter, som är vanligare i tidigare stadier (7-8). Observera att klassiska MBs kommer att ge upphov till icke-specifik signal inom kärror, därför begränsa analysen till cytoplasmiska regioner i ägget kammaren. Ytterligare modifieringar, såsom neutravidin eller Guldnanopartiklar, har använts för att reducera eller eliminera denna icke-specifika signal28,29. Trots denna nukleära icke-specifik signal, specificitet MBs för in vivo detektion av Oskar mRNA har upprättats med hjälp av en FRET Approach8, och MB Co-injektion med in vitro transkriberas Oskar mRNA märkt med en fluorophore spektralt skild från MB ' s Label23.

Figure 3
Figur 3: samtidig visualisering av två mRNA-arter i levande ägg kammare. Samtidig injektion av Oskar-och Drongo-specifika molekylära fyrar i (a) sjuksköterske cellen och (B) äggcell av Stadium 8-9 ägg kammare. Oskar (röd) och Drongo (grön) mrnas colocalize vid den bakre änden av äggcell (Asterix), och Drongo visar också Dorso-främre ackumulering (Arrowhead). Scale bar = 20 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

För mRNA-mål som visar låga uttrycks nivåer ökas fluorescenssignalen per mRNA-molekyl genom att en cocktail lösning som innehåller minst två MB injiceras, varje bindning till olika mål regioner (figurerna 4 och 5).

Figure 4
Figur 4: visualisering av Oskar mRNA med både MBS och MS2-GFP-systemet. Mikroinjektioner av en MB cocktail lösning (MB) i en ägg kammare som uttrycker OSK-MS2:: MCP-GFP30 (GFP). Efter görs av en sjuksköterska cell, var bilder förvärvades varje 30 s för 20 min. Två regioner av intresse valdes, en ROI i en sjuksköterska cell och en i äggcell. Olika känslighet användes för varje ROI för att upptäcka fläckar. ROI Nurse cell: skala 2, känslighet 100 för GFP och MB. ROI-oocyte: skala 2, känslighet 50 för GFP och 110 för MB. Colocalization avstånd är 4 pixlar för båda ROIs. Hela ägget kammaren och zooma in på sköterskan cellen visas på 12 min tid punkt, och zooma in på äggcell visas på 14 min tid punkt. MB fläckar (röda cirklar) och GFP fläckar (gröna cirklar) identifiera Oskar mRNA partiklar upptäcks av varje metod, och de colokaliserade partiklarna (gul) indikerar var MB och GFP fläckar är högst 4 pixlar isär. XY-projektioner av 14 Z optiska skivor vid 0,3 μm steg. Förvärvad som 16-bitarsdata med ett 63x mål (olja, NA = 1,4), XY = 0,24 μm, exponeringstid 500 ms, vid 5,23 och 5,39 mW lasereffekt för 641 nm respektive 491 nm Laser. Scale bar = 10 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: spårningsanalys i äggocyten, efter sjuksköterska cell mikroinjektion med Oskar mRNA-specifika MBS. MB-partiklar upptäcktes i skala 2 med känslighet 110, och 8 tidspunkter visas före/efter den aktuella tidsramen. MB fläckar (röda cirklar) spåras i volymen av äggcell; spår representerar identifieringsinformation från 8 tidspunkter före/efter den visade 12 min-punkten. Varje färg representerar ett enskilt spår. XY-projektioner av 14 Z optiska skivor vid 0,3 μm steg. Scale bar = 10 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

När man jämför smuggling av Oskar mRNA som upptäcks med MBS vs MS2/MCP, dokumenterar fluorescenssignalen som genereras av Oskar-Specific MBS troget dokument om transport och lokalisering av transgena Oskar mRNA med etiketten 10 GFP molekyler via MS2/MCP-systemet (figur 4). I Oskar-MS2/MCP-GFP transgena ägg kammare vid Mid oogenesis visade förvärvet dataanalys omfattande samlokalisering mellan fluorescerande signaler av genetiskt modifierade Oskar-MS2 MRNA upptäcktes med MBS och GFP-tagging . Vid 12 och 14 min efter injektion, 57% (7 MB-objekt och 13 GFP-objekt, med 4 colokaliserade objekt) och 93% (30 MB-objekt och 51 GFP-objekt, med 28 colokaliserade objekt) av upptäckta MB partiklar samlokaliserade med GFP-partiklar i sjuksköterskans celler och äggcell, Respektive. Vår analys ger 31% och 55% samlokalisering procent av Oskar-MS2 mRNA med Oskar mRNA detekteras med MBS i cytoplasman hos en sjuksköterska cell och äggcell, respektive. Dessutom kan 5D-stackar analyseras ytterligare för att bestämma Oskar mRNA banor för långväga transporter i både sjuksköterska cell och äggocyte cytoplasma (figur 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Live visualisering av endogena mRNA handel i Drosophila Egg Chambers förlitar sig på användning av specifika, effektiva, och Nuclease-resistenta MBS, som nu kan enkelt utformas med pinmol programvara. MBs är specifika sonder som utformats för att upptäcka unika sekvenser inom en Target mRNA (helst regioner som är fria från sekundär struktur), vilket gör möjligt mycket löst detektering av en avskrift. Den enda begränsningen vid antagande av denna teknik/protokoll för andra vävnader/celltyper är effektiviteten i MB leverans för den förlaga av intresse. Medan andra metoder kräver genetisk manipulation av vävnaden för att uttrycka en aptamer och ett RNA-bindande protein märkta med ett fluorescerande protein för att visualisera ett mål mRNA (t. ex. MS2/MCP-system), multiplexering är möjligt för, högst, två utskrifter. MB-tekniken står ensam för att upptäcka endogena mRNA i levande celler, och det är den enda tekniken som tillåter Co-visualisering av mer än två MRN arter.

MBS kan märkas med ett brett spektrum av fluorescerande beståndsdelarna och är stabila inom den cellulära miljön när syntetiseras från modifierade nukleotider såsom 2 '-O-metylribonukleotides eller låsta-nukleinsyror26,31. Dessa stamnäts ändringar ökar också MBs affinitet för deras mål. Flera MBs kan enkelt utformas för Target mRNAs av genomsnittlig längd. Vissa begränsningar kan dock uppstå för korta och/eller mycket strukturerade mål. Detta kan övervinnas genom att anta våra småmolekylära fyrar, för vilka sonden regionen är ungefär hälften av längden på en klassisk MB sond31. Beroende på preparat typ, MBS levereras till celler via elektroporation, länka till cell-penetrerande peptider, lipofektion, eller görs23,32,33,34. En MB prestanda effektivitet i levande cell Imaging experiment lutar på förmågan hos sonden sekvensen att hybridisera till motsvarande kompletterande sekvens inom mRNA mål, som bestäms av målstrukturen. Den förutspådda MFE-RNA sekundär struktur som erhålls med hjälp av in vitro uppmätta termodynamik parametrar är värdefull för att bedöma mål tillgängligheten, men i slutändan är det in vivo mål struktur och mål interaktion med andra cellulära faktorer som kommer att avgöra MB lämplighet för levande cell avbildning. Genomomfattande analys av RNA sekundär struktur antyder att många RNAs är mindre strukturerade in vivo än in vitro35. Även om effektiviteten hos in vivo-måldetektering med MBs huvudsakligen beror på tillgängligheten för bindnings platsen, kommer optimering av vissa MB-funktioner att säkerställa en förbättrad visualisering av mRNA-målet. Specifikt bör ett noggrant urval av följande parametrar utföras: 1) sond längden kan variera mellan 18 och 26, så att sonden nukleotid sammansättning är mellan 31 och 55% GC par i målet: MB hybrid, 2) 5 BP Stem sekvens bör vara G/C Rich, att bibehålla hårnål form i avsaknad av mRNA mål och att ge obalans diskriminering, 3) en modifierad ryggrad bör användas för skydd mot nukleaser av både MB och Target: MB hybrid, 4) paret fluorophore/quencher kan erbjuda en extra blygsam stabilitet till MB ' s Stem, och 5) fluorophore bör vara stabil under långa bilder tidsintervall. Dessutom, klassisk MBs generera vanligtvis en nukleär icke-specifik signal34, som i vårt fall endast måttligt påverkar databehandling och analys. Men för mRNA människohandel visualisering på cellulär nivå, denna icke-specifik signal kan bli problematiskt. Flera grupper har föreslagit modifieringar eller taggar, såsom tRNA, peptider och nanopartiklar, som förhindrar leverans av MBS i kärnan och därmed eliminera denna eventuella icke-specifik signal33,36.

Den största nackdelen med detta tillvägagångssätt har varit manuell utformning av MBs för levande cell avbildning. För att lösa detta, har vi skrivit ett python-baserat program (Pinmol) som lätt identifierar tillgängliga målplatser inom en mRNA genom att överväga suboptimala sekundära strukturer utöver MFE, samt mönster hårnål sonder, som är bäst lämpad för detektion av mRNAs i levande celler24. Pinmol använder strukturell information från sekundära strukturer av mål-RNA förutspådde via energiminimeringsmetoder, och genom att inkludera information från suboptimala strukturer, är flexibiliteten eller stelheten i specifika riktade regioner bedömas vid utformningen av MBs. Det tar hänsyn till tillgängligheten av de riktade regionerna, liksom Inter-och intramolekylära interaktioner för varje utvald sond. Dessutom bör mycket reglerade sträckor av RNA (t. ex. bindningsställen för mikroRNAs eller RNA-bindande proteiner) inte betraktas som målplatser när man väljer sonder, eftersom dessa regioner kan resultera i ineffektiv bindning av MBs. Användaren kan utvärdera och eliminera avsökningar som riktar sig till dessa platser, eller begränsa målregionen som används av Pinmol för att designa sonder så att den inte inkluderar sådana webbplatser. Den relativa kapaciteten hos pinmol demonstrerades genom att jämföra rangordningen av pinmol utformade MBS med experimentella resultat av manuellt utformade MBS24. Pinmol valde ut och designade MBS för liknande mål regioner samt identifierade nya tillgängliga platser på mRNA. Detta är viktigt för detektering av låg kopia antal utskrifter där den fluorescerande signalen måste ökas över bakgrunden. Genom att skala upp MB-nummer som effektivt hybridisera till flera tillgängliga platser på ett mål mRNA, kan signal förstärkning uppnås. Därför, detta program underlättar en snabb metod för att designa flera MBs per mål mRNA, och att samtidigt visualisera många mRNAs i en levande cell.

För att uppnå hög kvalitet 5D (XYZCt) förvärvs data av transporterade mRNA inom ägg kammaren, korrekt dissektion av enskilda ägg kammare och effektiv mikroinjektion i sjuksköterska celler är kritiska. För studier under tidiga stadier av utveckling, mikroinjektion kan vara skadligt för livskraften i ägget kammaren och därmed längden på en levande cell Imaging experiment förkortas (< 20 min). En ökad framgång för mikroinjektion experiment kan säkerställas genom att använda kommersiellt tillgängliga Ultrafine nålar. Dessutom är en snabb inställning av förvärvs inställningarna viktig så att de tidiga, postinsprutade tids punkterna kan fångas in. Kvaliteten på spot Detection och tracking data kommer bara att vara så bra som kvaliteten på de förvärvade bilderna.

Vid bild förvärv är det viktigt att efterföljande analys steg också slutförs noggrant och precist. Även efter förvärvet bearbetning och analys erbjuder sin egen uppsättning av svårigheter, kan de rationaliseras genom att välja lämplig programvara för ett visst experiment eller prov. Nuvarande befintliga program inkluderar Volocity (PerkinElmer), Imaris (Bitplane), ImageJ/Fiji och Icy37. Av de tre, isiga erbjuder flera fördelar, eftersom det är en öppen gemenskap plattform som möjliggör, både bearbetning (via ImageJ) och analys av Imaging data. Här beskriver vi de steg som krävs för effektiv bearbetning och analys av RNA-bilddata med isiga. Våra resultat är representativa för data som erhållits genom att co-visualisera två mRNA arter i en hel ägg kammare och genom att spåra en mRNA via MB-teknik och MS2/MCP-systemet.

Efter förvärvet bearbetning med isiga programvara ger användaren flexibilitet i bildbehandling (t. ex. ljusstyrka, kontrast) och analys (t. ex. tröskelvärden/cut-offs inställningar för känslighet detektion av fluorescerande partiklar som fläckar) . Icy gör det också möjligt att kontrollera relevanta parametrar inom varje block av protokollen Editor Run (t. ex. bestämma colocalization avstånd och använda den som "Max avstånd" i "Colocalizer" block). Icy programvara uppdateras vid lanseringen, och har tillförlitlig online-stöd för att felsöka eventuella problem. Det beskrivna protokollet utformades för att upptäcka Oskar mRNA och de representativa resultaten erhölls med hjälp av parametrar som optimerats för den typ av mRNA-partikel som ska upptäckas och spåras. Till exempel är Oskar mRNA en riklig avskrift som huvudsakligen transporteras under mitten stadier av oogenesis, utnyttja mikrotubuli nätverket och dynamiskt associera med olika protein faktorer under utvecklingen av äggcell. Vi rapporterade tidigare att Oskar mRNP genomgår omfattande ombyggnad under transporten från sjuksköterskans celler in i äggcell23. Dessutom har vi med MBs karakteriserat de tidsmässiga och rumsliga egenskaperna hos den endogena Oskar mRNA-smugglingen, och funnit att hundratals Oskar avskrift kopior kan införlivas för att bilda stora Oskar mrnps.

Efter förvärvet analys för colocalization och spårning kan också utföras med hjälp av andra program som Imaris, ImageJ/Fiji och Volocity. Icy valdes för sin förmåga att tröskel och kommentera fluorescerande partiklar med hög känslighet och spårningsmöjligheter. Här beskriver vi objektbaserad colocalization, men colocalization, om än utan spårning, kan också kvantifieras genom att fastställa överlappningen och graden av colocalization använda PCC (Costes) analys med isiga och ImageJ plugins (colocalization Studio, JACoP) 38 , 39.

I framtiden, en optimerad, långsiktig avbildning protokoll önskas för att säkerställa utökad ägg kammare överlevnad. Detta skulle ge längre förvärv för att analysera data som hänför sig till långväga mRNA människohandel studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingen intressekonflikt att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Salvatore A.E. Marras (Public Health Research Institute Center, Rutgers University) för syntes, märkning och rening av molekylära beacons, och Daniel St Johnston (The Gurdon Institute, University of Cambridge) för Oskar-MS2/ MCP-GFP transgena flug bestånd. Detta arbete stöddes av en National Science Foundation CAREER Award 1149738 och en professionell personal kongress-CUNY Award till DPB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectrofluorometer Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon n/a Photon counting spectrofluorometer
Quartz cuvette Fireflysci (former Precision Cells Inc.) 701MFL
Dumont #5 tweezer World Precision Instruments 501985 Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers
Halocarbon oil 700 Sigma-Aldrich H8898
Cover slip No.1 22 mm x 40 mm VWR 48393-048
Dissecting microscope Leica MZ6 Leica Microsystems Inc. n/a
CO2 fruit fly anesthesia pad Genesee Scienific 59-114
Tris-HCL pH 7.5 Sigma-Aldrich 1185-53-1
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 7791-18-6
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
Spinning disc confocal microscope Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc. n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera Hamamatsu n/a
PatchMan NP 2 Micromanipulator Eppendorf Inc. 920000037
FemtoJet Microinjector Eppendorf Inc. 920010504
Injection needle: Femtotips II Eppendorf Inc. 930000043
Loading tip: 20 μL Microloader Eppendorf Inc. 930001007
Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22 mm x 40 mm VWR 48393-026; 48393-172
Dry yeast Any grocery store n/a
Computer, > 20 GB RAM Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nature Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
  2. Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 11, 25-47 (2009).
  3. Mannack, L. V., Eising, S., Rentmeister, A. Current techniques for visualizing RNA in cells. F1000Research. 5, (2016).
  4. Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene. Science. 332 (6028), 475-478 (2011).
  5. Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
  6. Garcia, J. F., Parker, R. MS2 coat proteins bound to yeast mRNAs block 5' to 3' degradation and trap mRNA decay products: implications for the localization of mRNAs by MS2-MCP system. RNA. 21 (8), 1393-1395 (2015).
  7. Bratu, D. P. Molecular beacons: Fluorescent probes for detection of endogenous mRNAs in living cells. Methods in Molecular Biology. 319, 1-14 (2006).
  8. Bratu, D. P., Cha, B. J., Mhlanga, M. M., Kramer, F. R., Tyagi, S. Visualizing the distribution and transport of mRNAs in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 100 (23), 13308-13313 (2003).
  9. Tyagi, S., Kramer, F. R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nature Biotechnology. 14 (3), 303-308 (1996).
  10. Chen, M., et al. A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level. Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).
  11. Liu, Y., et al. Multiplex detection of microRNAs by combining molecular beacon probes with T7 exonuclease-assisted cyclic amplification reaction. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 107-114 (2017).
  12. Baker, M. B., Bao, G., Searles, C. D. In vitro quantification of specific microRNA using molecular beacons. Nucleic Acids Research. 40 (2), e13 (2012).
  13. Ko, H. Y., et al. A color-tunable molecular beacon to sense miRNA-9 expression during neurogenesis. Scientific Reports. 4, 4626 (2014).
  14. Vet, J. A., et al. Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 96 (11), 6394-6399 (1999).
  15. Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. Molecular beacons for protein-DNA interaction studies. Methods in Molecular Biology. 429, 209-224 (2008).
  16. Li, W. M., Chan, C. M., Miller, A. L., Lee, C. H. Dual Functional Roles of Molecular Beacon as a MicroRNA Detector and Inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3568-3580 (2017).
  17. Kuang, T., Chang, L., Peng, X., Hu, X., Gallego-Perez, D. Molecular Beacon Nano-Sensors for Probing Living Cancer Cells. Trends in Biotechnology. 35 (4), 347-359 (2017).
  18. Ban, K., et al. Non-genetic Purification of Ventricular Cardiomyocytes from Differentiating Embryonic Stem Cells through Molecular Beacons Targeting IRX-4. Stem Cell Reports. 5 (6), 1239-1249 (2015).
  19. Hadjinicolaou, A. V., Demetriou, V. L., Emmanuel, M. A., Kakoyiannis, C. K., Kostrikis, L. G. Molecular beacon-based real-time PCR detection of primary isolates of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis in environmental and clinical samples. BMC Microbiology. 9, 97 (2009).
  20. McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. Drosophila melanogaster Oogenesis: An Overview. Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).
  21. Bastock, R., St Johnston, D. Drosophila oogenesis. Current Biology. 18 (23), R1082-R1087 (2008).
  22. Rongo, C., Gavis, E. R., Lehmann, R. Localization of oskar RNA regulates oskar translation and requires Oskar protein. Development. 121 (9), 2737-2746 (1995).
  23. Mhlanga, M. M., et al. In vivo colocalisation of oskar mRNA and trans-acting proteins revealed by quantitative imaging of the Drosophila oocyte. PLoS One. 4 (7), e6241 (2009).
  24. Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P., Catrina, I. E. PinMol: Python application for designing molecular beacons for live cell imaging of endogenous mRNAs. bioRxiv. , (2018).
  25. Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes. Nucleic Acids Research. 30 (21), e122 (2002).
  26. Bratu, D. P., Catrina, I. E., Marras, S. A. Tiny molecular beacons for in vivo mRNA detection. Methods in Molecular Biology. 714, 141-157 (2011).
  27. Dean, D. A. Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection. Cold Spring Harbor. 2006 (7), (2006).
  28. Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
  29. Jackson, S. R., et al. Applications of Hairpin DNA-Functionalized Gold Nanoparticles for Imaging mRNA in Living Cells. Methods in Enzymology. 572, 87-103 (2016).
  30. Zimyanin, V. L., et al. In vivo imaging of oskar mRNA transport reveals the mechanism of posterior localization. Cell. 134 (5), 843-853 (2008).
  31. Catrina, I. E., Marras, S. A., Bratu, D. P. Tiny molecular beacons: LNA/2'-O-methyl RNA chimeric probes for imaging dynamic mRNA processes in living cells. ACS Chemical Biology. 7 (9), 1586-1595 (2012).
  32. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA. Nucleic Acids Research. 36 (12), e69 (2008).
  33. Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Research. 32 (6), e58 (2004).
  34. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells. Nucleic Acids Research. 35 (16), e105 (2007).
  35. Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review of Genetics. 50, 235-266 (2016).
  36. Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).
  37. Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).
  38. Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
  39. Trcek, T., et al. Drosophila germ granules are structured and contain homotypic mRNA clusters. Nature Commununications. 6, 7962 (2015).

Tags

Biologi molekylär beacon levande cell avbildning endogena mRNA visualisering mRNA trafficking Drosophila melanogaster ägg kammare ägg kammare mikroinjektion colocalization partikel spårning.
Visualisera och spåra endogena mRNAs i levande <em>Drosophila melanogaster</em> ägg kammare
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar,… More

Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers. J. Vis. Exp. (148), e58545, doi:10.3791/58545 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter