Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Visualisering og sporing endogene mRNAs i live Drosophila melanogaster egg Chambers

Published: June 4, 2019 doi: 10.3791/58545
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1,2
1Biological Sciences Department Hunter College, City University of New York, 2Program in Molecular, Cellular, and Developmental Biology, Graduate Center, City University of New York

Summary

Her presenterer vi en protokoll for visualisering, deteksjon, analyse og sporing av endogene mRNA smugling i live Drosophila melanogaster egg kammer ved hjelp av molekylære beacons, spinning plate konfokalmikroskopi mikroskopi, og åpen kildekodeanalyse Programvare.

Abstract

Fluorescens-baserte Imaging teknikker, i kombinasjon med utviklingen i lys mikroskopi, har revolusjonert hvordan celle biologer gjennomføre Live Cell Imaging studier. Metoder for å oppdage RNAs har utvidet mye siden banebrytende studier knyttet områdespesifikke mRNA lokalisering til genuttrykk regulering. Dynamiske mRNA-prosesser kan nå vises via tilnærminger som oppdager mRNAs, kombinert med mikroskopi oppsett som er raske nok til å fange det dynamiske spekteret av molekylær adferd. Den molekylære Beacon-teknologien er en hybridisering-basert tilnærming i stand til direkte påvisning av endogene transkripsjoner i levende celler. Molecular beacons er hæler-formet, internt slukket, Single-nukleotid diskriminerende nukleinsyre syre sonder, som fluorescerer bare på hybridisering til en unik mål sekvens. Når kombinert med avansert fluorescens mikroskopi og høy-resolution tenkelig, de sette i stand ettall å utføre romlig og Temporal oppsporer av intracellulære bevegelse av mRNAs. Selv om denne teknologien er den eneste metoden i stand til å oppdage endogene transkripsjoner, celle biologer har ennå ikke fullt omfavnet denne teknologien på grunn av vanskeligheter med å designe slike sonder for Live celle Imaging. Et nytt program, PinMol, gir forbedret og rask design av sonder best egnet til effektivt hybridize til mRNA mål regioner innenfor en levende celle. I tillegg høy oppløsning, sanntids image oppkjøp og strøm, åpen kildekode bildeanalyse programvare tillate en raffinert data utgang, som fører til en finere evaluering av kompleksiteten underliggende de dynamiske prosessene som er involvert i mRNA livssyklus.

Her presenterer vi en omfattende protokoll for å designe og levere molekylære beacons i Drosophila melanogaster egg kamre. Direkte og svært spesifikke deteksjon og visualisering av endogene mors mRNAs utføres via spinning plate konfokalmikroskopi mikroskopi. Imaging-data blir behandlet og analysert ved hjelp av objekt deteksjon og sporing i Icy Software for å få detaljer om den dynamiske bevegelsen til mRNAs, som transporteres og lokaliseres til spesialiserte områder innenfor oocyte.

Introduction

Cell Biology studier som visualisere dynamiske hendelser med romlig og timelig oppløsning har blitt gjort mulig ved utvikling av fluorescens Live Cell Imaging teknikker. I dag , in vivo mRNA visualisering oppnås via teknologier som er basert på RNA aptamer-protein interaksjoner, RNA aptamer-indusert fluorescens av organiske fargestoffer og nukleinsyre acid probeannealing 1,2, 3. They alle tilbyr høy spesifisitet, følsomhet og signal-til-bakgrunn ratio. RNA-aptamer tilnærminger krever imidlertid omfattende genetisk manipulering, hvor en transgene er konstruert for å uttrykke en RNA med kunstige strukturelle motiver som kreves for protein eller organisk fargestoff binding. MS2/MCP-systemet krever for eksempel co-uttrykk for en transgene som uttrykker en RNA-konstruksjon som inneholder flere tandem repetisjoner av bindings sekvensen for det bakteriofag MS2 pels proteinet (MCP), og en annen transgene som koder et fluorescerende protein smeltet til MCP4,5. Tillegg av slike sekundære strukturelle motiver til RNA, sammen med en omfangsrik fluorescensmerkete merket protein, har reist bekymring for at native RNA prosesser kan påvirkes6. En teknologi som tar for seg denne bekymringen og gir flere unike fordeler, er nukleinsyre syrebasert tilnærming, molekylær beacons (MBs). MBS tillate for multiplex påvisning av endogene mRNAs, diskriminering av enkelt nukleotid variasjoner, og rask Kinetics av hybridisering med mål mRNA7,8. MBs er oligonukleotid sonder som forblir i en slukket-hæler fold før gjennomgår en fluorogenic conformational endre når de hybridize til sine mål (figur 1C)9. Flere grupper har hatt suksess i å bruke MBS til å oppdage både ikke-koding RNAs (microRNAs og lncRNAs)10,11,12,13, RNA retroviruses14 og Dynamic DNA-protein interaksjoner15. De har blitt ansatt for Imaging i ulike organismer og vev, slik som sebrafisk embryo16, neurons13, tumor vev17, differensiere cardiomyocytes18, og Salmonella 19i denne.

Her beskriver vi design, levering og deteksjon tilnærming for endogene mRNAs i levende D. melanogaster egg kamre kombinert med en mikroskopi oppsett som er rask nok til å fange det dynamiske spekteret av aktiv molekylær transport. D. melanogaster egg kammer har fungert som en ideell flercellede modell system for et bredt spekter av utviklingsstudier, fra tidlig germline stilk cellen divisjon og mors genet uttrykk for generering av segmental kroppen plan20, 21i denne. Egg kamre er lett isolerte, store og gjennomsiktige, og i stand til å tåle timer med ex vivo -analyse, noe som gjør dem svært mottagelig for Imaging eksperimenter. Mye arbeid har fokusert på asymmetrisk lokalisering av mors transkripsjoner til diskrete subcellulære regioner før de blir aktivt oversatt. Spesielt, Oskar mRNA lokalisering og dens påfølgende oversettelse ved oocyte bakre Pol må forekomme i en strengt regulert måte å unngå en dødelig bicaudal embryo fenotype22. Oskar mRNA er skrives i 15 germline celler, kalt sykepleier celler, og aktivt transporteres gjennom cytoplasmatiske broer, kalt ring kanaler, inn i oocyte, den germline cellen som blir den modne egg og er til syvende og sist befruktet (figur 1a ). Den betydelige mengden informasjon som allerede er tilgjengelig om dynamisk rekruttering og utveksling av protein faktorer til og fra Oskar mRNP, sammen med sin langtrekkende intracellulære reise, gjør Oskar til en foretrukket kandidat til å studere de mange prosessene i mRNA livssyklus. MBs har vært medvirkende i avslørende detaljer om prosessen med mRNA lokalisering og tyde regulering og funksjon av protein faktorer som styrer mRNA transport under Drosophila oogenese. Spesielt ved microinjecting MBS inn sykepleier celler og utføre Live Cell Imaging eksperimenter, sporing av endogene mRNAs er mulig8,23.

Den veikart som presenteres her tilbyr trinnene i en komplett prosess, fra å gjennomføre en live celle Imaging eksperiment med MBs, anskaffe Imaging data, for å utføre dataanalyse for å spore endogene mRNA i sitt eget mobilnettet miljø. Foranstaltningene kan modifisert og fremme optimert å møte behovene av forskning arbeider med annet vev/cellen typer innen deres egen laboratorium innfatning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. design av MBs for Live Cell Imaging

  1. Brett mål-RNA-sekvensen for å forutsi mRNA sekundære struktur ved hjelp av «RNA-skjemaet» fra mfold -tjeneren (http://unafold.RNA.Albany.edu/?q=mfold/RNA-folding-form).
    1. Lim inn/Last opp mål sekvensen i FASTA-format, Velg 5 eller 10% sub-Optimality (strukturer med en fri energi av folding innen 5 eller 10% av MFE verdi, henholdsvis), og justere maksimalt antall beregnede foldings tilsvarende (f. eks større for 10% under Optimality).
      Merk: inkludering av sub-optimale sekundære strukturer ved utforming MBs tillater identifisering av regioner innenfor målet mRNA som kan være mer fleksibelt eller mer rigid enn som spådd for minimum fri energi (MFE) struktur alene, noe som forbedrer Total design av MBs egnet for levende celle bilde.
    2. Velg en "umiddelbar jobb" for mRNA mål av 800 nukleotider (NT), eller en "satsvis jobb" for mRNA lengder mellom 801 og 8 000 NT. Lagre "ss-Count"-filen som enkel tekstfil.
  2. Bruk "ss-Count"-filen innhentet i trinn 1,1 som input for PinMol program (https://bratulab.WordPress.com/software/) med de ønskede parametrene, for å designe flere MBS for mRNA målet (se opplæringsprogrammer som beskriver bruken av PinMol program 24 på https://bratulab.WordPress.com/tutorial-pinmol-Mac/).
    1. Bestem spesifisitet for valgt MBs ved å utføre BLAST analyse: Bruk "blastn" med den aktuelle databasen (for eksempel for Oskar mRNA-spesifikke MBS bruke "refseq-RNA" database og Drosophila melanogaster organisme).
    2. Identifiser eventuelle vev-spesifikke uttrykk for mRNA mål (for eksempel for Oskar mRNA flybase ≫ høy gjennomstrømming expression data ≫ FlyAtlas Anatomy Microarray eller MODENCODE Anatomy RNA-Seq; http://flybase.org/Reports/FBgn0003015) og sammenligne med noen positive BLAST treff. Eliminer sonder som viser > 50% Cross-homologi med andre mRNAs som også uttrykkes i vev/celle av interesse.
  3. Velg det fluoroforen og tørste paret som passer for mikroskopi oppsett som kan utføre direkte celle avbildning (f.eks. Cy5/BHQ2)25.

2. MB syntese, rensing, og karakterisering

  1. Bruk in-House syntese og rensing som tidligere beskrevet7, eller tjenester fra kommersielle leverandører, for å syntetisere og rense en til fem MBS (se over note), ved hjelp av følgende merking ordningen: [5 ' (fluoroforen)-(C3 eller C6 linker)-(2 '-O -methyl MB Sequence)-(tørste) 3 ']. Rens MBs bruker reverse-fase HPLC, i huset eller ved hjelp av tjenestene til den kommersielle leverandøren.
    Merk: Phosphoramidites som brukes for automatisert sonde syntese må ha 2 '-O-methyl ribonucleotide modifikasjon. Man kan også bruke chimeras av vekslende Locked-nukleinsyre acid (LNA) og 2 '-O-metyl modifikasjoner for å øke stabiliteten i en hybrid mellom en kortere MB og dens mål mRNA26.
  2. Syntetisere DNA-oligonukleotider som samsvarer med sekvensen til den målrettede RNA-regionen, og som således er utfyllende til sonde-området til MBs, for bruk i in vitro -karakterisering (se trinn 2,3 til 2,5; over note). Maksimer hybridisering av MB med DNA-oligonukleotid målet etterligne, ved å inkludere på hver ende av DNA målet fire ekstra nukleotider, som finnes i målet mRNA sekvensen.
    Merk: en mer streng karakterisering av MB effektivitet for å oppdage den målrettede sekvensen kan utføres ved hjelp av in vitro syntetisert RNA mål i stedet for komplementære DNA oligonukleotider8.
  3. Utfør termisk denaturering på MB alene, mål Smeltetemperaturen (TM), og Bekreft at MB forutsetter den ønskede formen ved fysiologisk temperatur. Vi har observert TM-verdier mellom 60 og 90 ° c.
  4. Utfør termisk denaturering av MB i nærvær av DNA oligonukleotid målet og måle MB: DNA målet hybrid ' s TM, som tidligere beskrevet7. En TM mellom 55 og 60 ° c er ønskelig for MB: DNA hybrid.
  5. Utfør in vitro hybridisering reaksjoner med tilsvarende DNA oligonukleotid mål, og bestemme effektiviteten av MB: DNA hybrid dannelse ved fysiologisk temperatur, som tidligere beskrevet7. Rask hybridisering Kinetics med DNA målet etterligne er ønskelig, men MBs som ikke viser høy hybridisering effektivitet med DNA-mål kan ha en bedre ytelse med målet mRNA in vitro og/eller in vivo.

3. disseksjon og utarbeidelse av individuelle egg Chambers for Microinjection

  1. Feed nylig klekket, paret kvinner for 2-3 dager med fersk gjær lime.
  2. Bedøve fluer på en CO2 pad og ved hjelp av fine pinsett (Dumont #5), overføre 1-2 kvinner inn i en dråpe Halocarbon olje 700 på et glass cover slip.
  3. Ved hjelp av et par pinsett, orientere fly med rygg side opp under en stereomikroskopet. Analysere den kvinnelige abdomen ved å lage et lite snitt på den bakre enden og forsiktig klem de to eggstokkene inn i oljen.
  4. Explant eggstokkene på et olje fall på en ny dekkglass. Hold en eggstokk med en TWEEZER mens du klemmer de yngste stadiene av ovariole med de andre TWEEZER. Oskar mRNA er aktivt lokalisert på og etter mid-oogenese (stadier > 7), og yngre egg kamre (stadier < 7) er vanskeligere å injisere og ikke overleve så lenge. Langsomt dra på dekselet slip (med en nedadgående bevegelse) til enkelte ovarioles eller egg kamre er isolert og justert vertikalt. Ytterligere separate enkelt egg kamre ved å fortrenge de uønskede stadier fra ovariole egg kjeden.
    Merk: Sørg for at individuelt ertet egg kamre ikke flyte i oljen, og at de holder seg til dekselet slip. Dette er viktig for både vellykket microinjection og bildeoppkjøp.

4. Microinjection av MBs inn i sykepleier celler av egg Chambers

  1. Klargjør MB-løsningen ved å bruke ett molekyl signal (f.eks. osk2216Cy5), eller en blanding av to MBs som er rettet mot forskjellige mRNAs og som er merket med Spectrally distinkte fluorophores (f.eks. osk2216Cy5 og drongo1111Cy3). Bruk en konsentrasjon på 200-300 ng/μL hver MB i HybBuffer (50 mM Tris-HCl-pH 7,5, 1,5 mM MgCl2 og 100 mm NaCl). For en cocktail med fire MBs merket med samme fluoroforen som er rettet mot samme mRNA på 200 ng/μL hver i HybBuffer (f. eks osk82, osk1236, osk2216). Spinn ned MB-løsningen umiddelbart før du legger nålen for microinjection.
  2. Velg målsettingen. En 40x olje mål er anbefalt for å finne en passende egg kammer og for å utføre microinjection.
  3. Monter dekkglass med dissekert egg kammer på scenen i mikroskopet. Ta opp målet i fokus posisjon og identifisere et egg kammer på en mid-til-sen utviklingsmessige Stadium, som er riktig orientert for microinjection (dvs. med AàP aksen vinkelrett på nålen spissen for å muliggjøre enkel injeksjon i en sykepleier celle proksimale til oocyte).
  4. Legg en nål (kommersiell eller forberedt i huset27) med ~ 1 μL MB løsning (se trinn 4,1) og koble den til microinjector. For microinjections i D. melanogaster egg kamre, orientere nålen (se tabell av materialer) i en vinkel < 45 ° til mikroskopet scenen (f. eks 30 °) for å unngå punktering flere sykepleier celler.
  5. Oppsett av injeksjonsvæske med injeksjons Trykk på 500-1000 hPa-og kompensasjons Trykk på 100-250 (se tabell over materialer).
  6. Langsomt flytte scenen for å få inn synsfelt et område av oljen slipp blottet for egg kamre.
  7. Ved hjelp av micromanipulator joystick, forsiktig senke nålen inn i olje dråpe og bringe spissen i fokus mot periferien av synsfeltet.
  8. Utfør en "ren" funksjon for å fjerne luft fra tuppen av nålen og for å sikre at det er Flow fra nålen.
  9. Bring nålen til hjemmet posisjon og fokus på egg kammer som skal microinjected, deretter bringe nålen tilbake i fokus og plassere den nær kanten av egget kammeret.
  10. Utfør en finjustering av målet er Z-posisjon slik at membranen skille hårsekken cellene fra sykepleier celler er i fokus.
  11. Sett nålen inn i en sykepleier celle og utfør injeksjon for 2-5 s.
  12. Fjern nålen forsiktig og trekk den tilbake til startposisjonen.
  13. Endre målsettingen til ønsket forstørrelse for bilde anskaffelse (60 – 63x eller 100%), Fokuser på eggkammeret, og start anskaffelsen.

5. anskaffelse av data ved hjelp av et spinnende Disc Konfokalmikroskopi mikroskop oppsett

Merk: Se tabell over materialer for vårt spesifikke oppsett.

  1. Definer anskaffelses protokollen for å spille inn en XYZCt-stabel med 8-16-biters bilder (XYZ = volum, C = kanal, t = tid).
  2. Velg laser linjer for de ønskede kanaler (f. eks 641 NM laser for Cy5 og 491 NM for GFP) og erverve kanalene sekvensielt: først fluorescens signalet i hver kanal og deretter endre Z posisjon, for å muliggjøre riktig colocalization analyse.
  3. Velg Z-trinnet (f.eks. 0,3 μm), og øvre og nedre Z-grense (f.eks. -2 μm til 2 μm).
  4. Angi anskaffelsestid og samplingsfrekvens (f.eks. hver 15-30 s for opptil 1 time).
  5. Initiere anskaffelse.

6. behandling, data analyse for å innhente sporings-og Colocalization informasjon, og utarbeidelse av video filer

  1. Bildebehandling
    1. Last ned, Pakk ut og åpne Icy, et åpent fellesskap plattform for bioimage informatikk (http://icy.bioimageanalysis.org/)
    2. Åpne XYZCt-stakken anskaffet i trinn 5: bilde/sekvens > Fil > Åpne.
    3. Konverter stakk til ImageJ: ImageJ > Verktøy > Konverter til IJ, har frakoblet modus på.
    4. Lag en substack (et utvalg av et utvalg av Z trinn og tid punkter for å bli videre analysert): ImageJ > bilde > stabler > Verktøy > gjøre Substack...; velge ønskede kanaler, Z-trinn og tids punkt.
    5. Lagre substack som TIFF-fil: ImageJ-> Fil > Lagre som > TIFF...; bruke denne filen for påfølgende trinn.
    6. Delte kanaler: ImageJ > bilde > farge > delte kanaler.
    7. Trekk fra bakgrunnen ved hjelp av en bakgrunns stabel: ImageJ > Process > image kalkulator..., eller bruke Rolling ball-alternativet: ImageJ > Process > subtrahere Background..., Velg rullende ball radius. Forhåndsvis bildet for radiusen som er valgt før du velger "godta".
      Merk: bakgrunns signalet vil i hovedsak oppstå fra uriktig slukking av flurorophore. Signalet: bakgrunn ratio (S:B) er ofte brukt som en indikator for en MB ' s "lysstyrke", og det er målt fra in vitro hybridisering eksperimenter av MB og DNA målet oligonukleotid. MBs osk1236 og osk2216 har for eksempel henholdsvis S:B på ~ 81 og ~ 120.
    8. Juster lysstyrke og kontrast for hver kanal: ImageJ > bilde > justere > lysstyrke/kontrast, velger du bruk.
    9. Lagre hver kanal som en separat TIFF-fil: ImageJ > Fil > Lagre som > TIFF....
    10. Slå sammen de to kanalene: ImageJ > bilde > farge > slå sammen kanaler...; velge kanalene. Lagre den nye stakken som en ny TIFF-fil (se trinn 6.1.8).
  2. Oppdage oppdagelse og sporing
    1. Konvertere tilbake til Icy: ImageJ > Verktøy > konvertere til Icy.
    2. En skala bar er automatisk lagt oppå stabelen ved konvertering til Icy, hvis skalaen bar plugg er installert [søk ved hjelp av plugins > Setup > online plugin]. Om nødvendig redigerer du Skalerings linjen via inspektør-vinduet (høyre side av skjermen) > Lag fane > navn > Scale bar.
    3. Fjern merket for/Deaktiver ' Eye '-ikonet for Skalerings linjen fra lag-fanen > navn for å fjerne Skalerings linjen fra den opprinnelige bunken. Den kan reaktiveres på den siste bunken.
    4. Lagre nylig behandlet stabelen ved å ta et skjermbilde ved hjelp av "kamera"-ikonet fra bildevinduet menylinjen, "ta et skjermbilde av gjeldende visning" og fil > Lagre som > TIFF....
    5. Bestem følsomhet for spot følsom het, hvis parametere for spot følsomhet allerede er fastslått, Flytt til trinn 6.2.7.
    6. Oppdage flekker: Velg vinduet med bildet eller stabelen som skal analyseres, deteksjon & Tracking > deteksjon > spot detektor, og fyll ut innstillingene parametere:
      1. Velg "currentSequenceInputDetection" (standard) for input.
      2. For pre Processing, velg "Channel 0" (standard), eller ønsket kanal ved kryss-henviser tallet i Inspector Window > sekvens kategorien.
      3. For Detector, velg "Oppdag lys flekk over mørk bakgrunn;" bruk "Tving bruk av 2D-wavelets for 3D" bare hvis det ikke er nok Z-sektorer i bunkene til å utføre analysen. Velg "Scale (s)" og "følsomhet" for hver skala (Legg til flere skalaer for større flekker). Skalaen og følsomhet (jo større tall jo mer følsom er oppdagelsen, maksimalt 140 er foreslått av Icy) er prøving og feiling variabler, som må være visuelt sjekkes etterpå og bestemt på.
      4. For region av interesse, bruk "ROIfromSequence" (standard).
      5. For filterene, bruk "NoFiltering" (retten), eller velge "SizeFiltering" å definere "omfang av akseptert emner (inne pixels)".
      6. Output: Velg XLS eller XML output innstilling (Velg XML-format når du bruker 2007 MS Excel eller tidligere, og det er > 65000 flekker). Hvis resultatene av spot detektoren brukes til sporings analysen, velger du også «Eksporter til svømmebasseng».
      7. Gjenta påvisning av flekker ved hjelp av ulike skala/følsomhet verdier til alle eller de fleste av stedene er oppdaget. Ta opp alle de endelige parametrene.
      8. For colocalization analyser gjentar du spot registrering for den andre kanalen.
    7. Hvis du vil spore flekker, velger du gjenkjenning & sporing > sporing > spot sporing > kjører spot detektoren med parametere fra trinn 6.2.6., eller Bruk rullegardinmenyen Velg gjenkjenningsresultater her for å velge et eksisterende datasett (for dette, Behold spot detektor vinduet Åpne fra trinn 6.2.5). Trykk på "estimat parametere"-knappen og velg ønsket mål bevegelse i popup-vinduet parametere estimering (for eksempel "er både diffusive og regissert"). Trykk på "Kjør sporing"-knappen.
    8. Gjentagelse flekk oppdagelsen og oppsporer for annet kanalene når oppsporer flekker av flerkanals stabler, fulgte skritt 6.2.6 og 6.2.7, begynnelse med det stabel utviklet fra steg 6.2.7.
    9. Hvis du vil visualisere spor, velger du gjenkjenning & sporing > sporing > Track Manager – dette vinduet åpnes automatisk når en sporings kjøring er fullført. For «farge spor prosessor» velger du «Aktiver» og velger ønsket fargegjengivelse for sporene. Relevant spor prosessorer kan nås via "Legg spor prosessor..." rullegardinmenyen (Velg for eksempel "spor prosessortid klipp," Aktiver "spor Clipper"-vinduet, og velg ønsket antall oppdagelser som skal vises før og etter gjeldende tidspunkt.)
    10. Lagre spor informasjon som en XML-spor fil: gjenkjenning & sporing > sporing > Track Manager > Fil > Lagre som....
    11. Lagre resultater ved å ta et skjermbilde ved hjelp av "kamera"-ikonet fra bildevinduet menylinje, "ta et skjermbilde av gjeldende visning". Screenshots kan tatt med det oppdaget flekker og/eller det spor bare av aktivere/deaktivere det tilsvarende øye ikon () grunnlegge inne inspektør Vindu > Lag tab > navnet > overlegg wrapper.
    12. Installere tidsstempel overlegg plugin: plugins > Setup > online plugin > tidsstempel overlegg > installere.
    13. Legg til tidsstempel: plugins > tidsstempel overlegg (New). Følg instruksjonene i popup-vinduet (nederst i høyre hjørne på skjermen) for anvisninger om hvordan du plasserer og formaterer tidsangivelsen. Tidsintervallet kan legges til/endres i vinduet inspeksjon > sekvens > sekvens egenskaper > Rediger.
    14. Lagre resultatene ved å ta et annet skjermbilde. Lagre bilde som 1) TIFF-format, og 2) som AVI-format; for AVI formatter for det første konvertere å RGB oversettelse (Image/orden > oversettelse > RGB image).
    15. Roter bildet til ønsket orientering: inspektør Vindu > sekvens-fanen > lerret > rotasjon.
    16. Lagre rotert bilde av "ta et skjermbilde av gjeldende visning". Kontroller at "Eye"-ikonet for Skalerings linjen ikke er valgt, da det også vil rotere med bildet.
    17. Velg og Beskjær ROI: Velg region av interesse > 2D ROI > Velg ROI form og deretter opprette/tegne ROI på bildet; Bilde/sekvens > plan (XY) > rask beskjæring.
  3. Colocalization analyse
    1. Forbered en colocalization protokoll; flere eksempler er gitt på Icy nettsted (http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/List) (se supplerende materialer).
    2. Load colocalization protokoll: verktøy > Scripting > protokoller > belastning, og justere parametrene i samspill blokker (f. eks i "wavelet spot oppdage" blokkere bruk parametere bestemmes i trinn 6.2.6.).
    3. Målstørrelsen på en partikkel i piksler, bestemme colocalization avstand og input det inn i "Colocalizer" blokk som "Max avstand."
      Merk: Størrelsen på partikkel i piksler avhenger av deteksjonssystemet. For å måle størrelse, zoome inn i en enkelt partikkel og manuelt telle piksler som spenner over bredden på signalet over. Gjennomsnittlig målingene fra minst tre partikler. Den maksimale avstanden som skal angis for colocalization er størrelsen på partikkel i piksler (Dette representerer den maksimale summen av radiusen til to partikler som berører).
    4. Hvis du vil, kan du velge en eller flere ROIs for colocalization Analysis: region av interesse > 2D ROI > Velg ROI Shape > tegn ROI på bildet.
    5. Beskjær ROI (s): bilde/sekvens > plan (XY) > fast avling.
    6. Utfør colocalization: protokoller redaktør Vindu > valgt protokoll tab > Kjør. Det final hindre inne protokoller Editor vindu ville inneholde total colocalization prosenten basert på flekk oppdagelsen, stund beskjed for hver tid punkt kan grunnlegge inne inspektør Vindu > produksjon tab.
    7. Spor colocalized og enkeltpartikler ved å følge trinn 6.2.7 (spor flekker).
    8. Lagre som beskrevet i trinn 6.2.16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjelp av PinMolkan flere MBS utformes for ett mRNA-mål (figur 1B-C). Etter syntese og rensing kjennetegnes den valgte MBs-en med in vitro-analyse.

Figure 1
Figur 1: teknikk og vev beskrivelse for Live celle Imaging av endogene mRNAs. (A) skildring av et mid-trinns Drosophila egg kammer som brukes til microinjection. Den microinjection nålen (grønn) gir en cocktail av molekylære beacons spesifikke for Oskar mRNA. En rask injeksjon i en sykepleier celle gjør det mulig å oppdage mRNAs i transitt til oocyte, i tillegg til visualisering av allerede lokaliserte mRNA ved bakre cortex. (B) PinMol programvare utgang av molekylær Beacon ranking for målretting Oskar mRNA (C) sekundær struktur region innenfor Oskar mRNA målrettet av en molekylær Beacon. (C ') Sekvens og folding av Oskar-spesifikke molekylær Beacon, osk2216. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Etter optimal ytelse av MBs er bekreftet via in vitro karakterisering, brukes sonder for Live visualisering av endogene målet mRNA (s). Det er mulig å visualisere mønstrene av Oskar mRNA transport og lokalisering på ulike stadier av oogenese, og spesielt på og etter mid-oogenese (7-10) (figur 2a-B). På grunn av sin lille størrelse, er det vanskelig å injisere egg kamre på svært tidlige stadier (1-4). Når individuelt injisert i samme scene egg kamre, Oskar-spesifikke MBS presentere de samme mønstrene for lokalisering (figur 2, osk1236 vs osk2216).

Figure 2
Figur 2: tidssekvens av Oskar mRNA i vill type egg kammer på t = 0, 10, og 30 min tid poeng, etter initiering av oppkjøpet. Sykepleier celle injeksjoner av to Oskar-spesifikke molekylære beacons (osk1236 og osk2216) i (A) Stage 6-7 egg kamre og (B) Stage 9 egg Chambers. Scale bar = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Ulike mRNA-mål kan brukes sammen ved hjelp av Spectrally distinkte fluorescensmerkete merket MBs (Figur 3). MB-løsningen kan microinjected til en sykepleier celle (figur 3a) eller i oocyte (figur 3b). MBs injisert i en sykepleier celle cytoplasma vil fritt diffus inn i andre sykepleier celler så vel som i oocyte, og dermed er i stand til å finne sitt mål og generere fluorescens signal på andre steder enn microinjection området. For eksempel, når du utfører microinjections i en sykepleier celle i en sen oogenese Stadium (9-10) egg kammer, er det meste av fluorescens signalet som vises i oocyte generert av den allerede lokaliserte Oskar mRNA, og mindre ved å aktivt transporteres transkripsjoner, som er mer utbredt i tidligere stadier (7-8). Merk at klassisk MBs vil gi opphav til ikke-spesifikk signal i kjerner, derfor begrense analysen til de cytoplasmatiske regionene i eggkammeret. Ytterligere modifikasjoner, slik som NeutrAvidin eller gull nanopartikler, har vært benyttet for å redusere eller eliminere dette ikke-spesifikke signalet28,29. Til tross for dette kjernefysiske ikke-spesifikke signalet, har det spesielle ved MBs for in vivo deteksjon av Oskar mRNA blitt etablert ved hjelp av et bånd tilnærming8, og MB co-injeksjon med in vitro transkribere Oskar mRNA merket med en fluoroforen Spectrally skiller fra MB ' s Label23.

Figure 3
Figur 3: co-visualisering av to mRNA arter i levende egg kamre. Co-injeksjoner av Oskar-og Drongo-spesifikke molekylære beacons i (A) sykepleier celle og (B) oocyte av scenen 8-9 egg kamre. Oskar (rød) og Drongo (grønn) mRNAs colocalize ved den bakre enden av oocyte (Asterix), og Drongo viser også dorso akkumulering (pilspissen). Scale bar = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

For mRNA-mål som viser lave uttrykks nivåer, økes fluorescens signalet per mRNA-molekyl ved å injisere en cocktail løsning som inneholder minst to MBs, hver binding til ulike mål regioner (Figur 4 og 5).

Figure 4
Figur 4: visualisering av Oskar mRNA med både MBS-og MS2-GFP-systemet. Microinjections av en MB cocktail løsning (MB) i et egg kammer uttrykker skjerm -MS2:: MCP-GFP30 (GFP). Etter microinjection av en sykepleier celle, ble bildene kjøpt hver 30 s i 20 min. To områder av interesse ble valgt, en avkastning på en sykepleier celle og en i oocyte. Ulike følsomhet ble brukt for hver ROI å oppdage flekker. ROI sykepleier celle: Scale 2, følsomhet 100 for GFP og MB. ROI-oocyte: skala 2, følsomhet 50 for GFP og 110 for MB. Colocalization avstand er 4 piksler for begge ROIs. Hele eggkammeret og zoom inn på sykepleier cellen vises ved 12 min tids punkt, og zoom inn på oocyte vises på 14 min tids punkt. MB spots (røde sirkler) og GFP flekker (grønne sirkler) identifisere Oskar mRNA partikler oppdages av hver tilnærming, og de colocalized partikler (gult) indikerer hvor MB og GFP flekker er på de fleste 4 piksler fra hverandre. XY-projeksjoner av 14 Z optiske skiver på 0,3 μm trinn. Ervervet som 16-bits data med en 63x mål (olje, NA = 1,4), XY = 0,24 μm, eksponeringstid 500 MS, ved 5,23 og 5,39 mW laser kraft for 641 NM og 491 NM laser, henholdsvis. Scale bar = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: sporing analyse i oocyte, etter sykepleier celle microinjection med Oskar MRNA-spesifikke MBS. MB partikler ble oppdaget på Scale 2 med følsomhet 110, og 8 tid punkter vises før/etter gjeldende tidsramme. MB flekker (røde sirkler) spores i volumet av oocyte; spor representerer gjenkjennings informasjon fra 8 tid punkter før/etter det viste 12 min tid punkt. Hver farge representerer et individuelt spor. XY-projeksjoner av 14 Z optiske skiver på 0,3 μm trinn. Scale bar = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Ved sammenligning av smugling av Oskar mRNA som oppdaget med MBS vs MS2/MCP, er det fluorescens signalet generert av Oskar-spesifikke MBS, som trofast dokumenterer om transport og lokalisering av transgene OSKAR mRNA merket med 10 GFP molekyler via MS2/MCP-systemet (Figur 4). I Oskar-MS2/MCP-GFP transgene egg kamre på midten av oogenese viste dataanalyse av oppkjøp omfattende colocalization mellom fluorescerende signaler av genetisk konstruert Oskar-MS2 mRNA oppdaget ved hjelp av MBS og GFP-merking . Ved 12 og 14 min post-injeksjon, 57% (7 MB-objekter og 13 GFP-objekter, med 4 colocalized objekter) og 93% (30 MB-objekter og 51 GFP-objekter, med 28 colocalized objekter) av oppdagede MB partikler colocalized med GFP partikler i sykepleier celler og oocyte, Henholdsvis. Vår analyse gir 31% og 55% colocalization prosenter av Oskar-MS2 mRNA med Oskar mRNA oppdaget med MBS innenfor cytoplasma av en sykepleier celle og oocyte, henholdsvis. Videre kan 5D-stabler bli ytterligere analysert for å fastslå Oskar mRNA baner for langdistanse transport i både sykepleier cellen og oocyte cytoplasma (figur 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Live visualisering av endogene mRNA smugling i Drosophila egg kamre er avhengig av bruk av spesifikke, effektive og nuklease MBS, som nå kan enkelt utformes med PinMol programvare. MBs er spesifikke sonder designet for å oppdage unike sekvenser innenfor et mål mRNA (fortrinnsvis regioner uten sekundær struktur), noe som gjør mulig svært løst påvisning av en transkripsjon. Den eneste begrensningen når vedta denne teknikken/protokollen for andre vev/celletyper er effektiviteten av MB levering for prøven av interesse. Mens andre tilnærminger krever genetisk manipulering av vevet for å uttrykke en aptamer og en RNA-bindende protein merket med et fluorescerende protein for å visualisere ett mål mRNA (f. eks MS2/MCP-system), er multipleksing mulig for, på de fleste, to transkripsjoner. MB teknologi står alene for å oppdage endogene mRNAs i levende celler, og det er den eneste teknikken tillater co-visualisering av mer enn to mRNA arter.

MBS kan merkes med et bredt spekter av fluorescerende andeler og er stabile i celle miljøet når syntetisert fra modifiserte nukleotider som 2 '-O-methylribonucleotides eller låst-nukleinsyre syrer26,31. Disse endringene i ryggraden øker også MBs ' affinitet for deres mål. Flere MBs kan enkelt designet for målet mRNAs av gjennomsnittlig lengde. Noen begrensninger kan imidlertid oppstå for korte og/eller svært strukturerte mål. Dette kan overvinnes ved å vedta vår lille molekylære beacons, som sonden regionen er omtrent halvparten av lengden på en klassisk MB sonde31. Avhengig av prøve typen blir MBS levert inn i cellene via electroporation, som kobler til celle-trengende peptider, lipofection eller microinjection23,32,33,34. En MB ytelse effektivitet i live celle Imaging eksperimenter lener seg på evnen til sonden sekvensen til hybridize til tilsvarende utfyllende sekvensen innenfor mRNA målet, som bestemmes av mål strukturen. Den spådde MFE RNA sekundær struktur innhentet ved hjelp av in vitro målt termodynamikk parametere er verdifullt i vurderingen målet tilgjengelighet, men til syvende og sist er det in vivo mål struktur og målet interaksjon med andre mobilnettet faktorer som vil avgjøre MB egnethet for Live celle Imaging. Genova-bred analyse av RNA sekundær struktur antyder at mange RNAs er mindre strukturert i vivo enn in vitro35. Selv om effektiviteten av in vivo Target deteksjon ved hjelp av MBs er hovedsakelig avhengig av tilgjengelighet av bindende området, optimalisere visse MB funksjoner vil sikre en forbedret visualisering av mRNA målet. Nærmere bestemt bør en nøye utvalg av følgende parametre utføres: 1) sonden lengden kan variere mellom 18 og 26, slik at sonden er nukleotid sammensetning er mellom 31 og 55% GC parene i mål: MB hybrid, 2) de 5 BP stammen sekvensen bør være G/C rik, for å opprettholde den hæler form i fravær av mRNA mål og å gi konflikt diskriminering, 3) en modifisert ryggrad bør brukes for beskyttelse mot nukleaser av både MB og Target: MB hybrid, 4) fluoroforen/tørste paret kan tilby en ekstra beskjeden stabilitet til MB ' s stamme, og 5) fluoroforen bør være stabil under lange Imaging tidsintervaller. I tillegg, klassisk MBs vanligvis generere en kjernefysisk ikke-spesifikk signal34, som i vårt tilfelle bare moderat virkninger databehandling og analyse. Men for mRNA smugling visualisering på cellenivå, dette ikke-spesifikke signalet kan bli problematisk. Flere grupper har foreslått modifikasjoner eller koder, for eksempel tRNA, peptider og nanopartikler, som hindrer levering av MBS inn i kjernen og dermed eliminere dette mulig ikke-spesifikk signal33,36.

Den største ulempen med denne tilnærmingen har vært den manuelle utformingen av MBs for Live celle Imaging. For å løse dette, har vi skrevet et Python-basert program (PinMol) som lett identifiserer tilgjengelige målområder innenfor en mRNA ved å vurdere suboptimal sekundære strukturer i tillegg til MFE, samt design hæler sonder, som er best egnet for påvisning av mRNAs i levende celler24. PinMol bruker strukturell informasjon fra sekundære strukturer av målet RNA spådd via energi minimering tilnærminger, og ved å inkludere informasjon fra suboptimal strukturer, er fleksibiliteten eller stivhet av spesifikke målrettede regioner vurderes ved utforming av MBs. Det tar hensyn til tilgjengeligheten av målrettede regioner, samt Inter-og intramolekylær interaksjoner av hver valgt sonde. I tillegg bør svært regulerte strekninger av RNA (f.eks. bindings steder for microRNAs eller RNA-bindende proteiner) ikke betraktes som målområder ved valg av sonder, da disse regionene kan føre til ineffektiv binding av MBs. Brukeren kan evaluere og eliminere sonder rettet mot disse nettstedene, eller begrense målregionen som brukes av PinMol til å utforme sonder slik at den ikke inkluderer slike nettsteder. Den relative evnen til PinMol ble demonstrert ved å sammenligne rangeringen av PinMol utformet MBS med de eksperimentelle resultatene av manuelt utformet MBS24. Pinmol valgt og designet MBS for lignende mål regioner samt identifisert nye tilgjengelige nettsteder på mRNA. Dette er viktig for påvisning av lav kopi nummer transkripsjoner der fluorescerende signalet må økes over bakgrunnen. Ved å skalere opp MB tall som effektivt hybridize til flere tilgjengelige nettsteder på et mål mRNA, signal forsterkning kan oppnås. Derfor forenkler dette programmet en rask tilnærming til å designe flere MBs per målet mRNA, og samtidig visualisere mange mRNAs i en levende celle.

For å oppnå høy kvalitet 5D (XYZCt) oppkjøpet data av transportert mRNAs i eggkammeret, riktig Disseksjon av individuelle egg kamre og effektiv microinjection inn sykepleier celler er kritiske. For studier i tidlige stadier av utviklingen, kan microinjection være skadelig for levedyktigheten til eggkammeret og dermed lengden på en live celle tenkelig eksperiment er forkortet (< 20 min). En økt suksess rate av microinjection eksperimenter kan sikres ved å bruke kommersielt tilgjengelige ultrafine nåler. I tillegg er en rask oppsett av oppkjøpet innstillingene viktig slik at tidlig, etter injeksjon tid poeng kan fanges. Kvaliteten på flekk deteksjon og sporingsdata vil bare være så god som kvaliteten på bildene ervervet.

Ved bildeoppkjøp, er det viktig at påfølgende analyse trinn er også gjennomført nøye og presist. Selv om behandling og analyse etter oppkjøpet tilbyr sitt eget sett med vanskeligheter, kan de bli strømlinjeformet ved å velge riktig programvare for et bestemt eksperiment eller prøve. Nåværende eksisterende programmer inkluderer Volocity (PerkinElmer), Imaris (Bitplane), ImageJ/Fiji og Icy37. Av de tre, tilbyr Icy flere fordeler, som det er et åpent fellesskap plattform som gjør det mulig for både, prosessering (via ImageJ) og analyse av Imaging data. Her beskriver vi fremgangsmåten som er nødvendig for effektiv prosessering og analyse av RNA bildedata ved hjelp av Icy. Våre resultater er representative for data innhentet av co-visualisere to mRNA arter i et helt egg kammer og ved å spore en mRNA via MB-teknologi og MS2/MCP-systemet.

Den post-oppkjøpet behandling med Icy programvare gir brukeren fleksibilitet i bildebehandling (f. eks lysstyrke, kontrast) og analyse (f. eks terskler/cut-offs innstillinger for følsomhet for påvisning av fluorescerende partikler som flekker) . Icy gjør det også mulig å kontrollere relevante parametre i hver blokk av protokollene Editor kjøre (f. eks bestemme colocalization avstand og bruke den som "Max avstand" i "Colocalizer" blokk). Icy programvare er oppdatert ved lansering, og har pålitelig online støtte for å feilsøke problemer. Den beskrevne protokollen ble utviklet for å oppdage Oskar mRNA og representative resultatene ble innhentet ved hjelp av parametere optimalisert for den type mRNA partikkel som skal oppdages og spores. For eksempel er Oskar mRNA en rik transkripsjon som hovedsakelig transporteres i løpet av midten stadier av oogenese, utnytte mikrotubulinettverket nettverk og dynamisk knytte ulike protein faktorer gjennom utvikling av oocyte. Vi har tidligere rapportert at Oskar mRNP gjennomgår omfattende ombygging under transport fra sykepleier cellene til oocyte23. I tillegg karakteriserer vi de timelige og romlige egenskapene til endogene Oskar mRNA menneskehandel, og fant at hundrevis av Oskar transkripsjon eksemplarer kan innlemmes å danne store Oskar mRNPs.

Analyse etter oppkjøp for colocalization og sporing kan også utføres ved hjelp av annenprogramvare som Imaris, ImageJ/Fiji og Volocity. Icy ble valgt for sin evne til terskel og kommentere fluorescerende partikler med høy følsomhet og sporing evner. Her beskriver vi objektbasert colocalization, men colocalization, selv uten sporing, kan også kvantifisert ved å bestemme overlappingen og graden av colocalization ved hjelp av GRUNNFOND (costes) analyse ved hjelp av Icy og ImageJ plugins (Colocalization Studio, JACoP) 38 for alle , i 39.

I fremtiden, en optimert, lang-frist tenkelig protokollen er ønsket å sikre utbygget eggkammeret overlevelse. Dette vil gi lengre oppkjøp for å analysere data knyttet til langtrekkende mRNA menneskehandel studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikt å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Salvatore A.E. Marras (Public Health Research Institute Center, Rutgers University) for syntese, merking og rensing av molekylære beacons, og Daniel St Johnston (The Gurdon Institute, University of Cambridge) for Oskar-MS2/ MCP-GFP transgene fly lager. Dette arbeidet ble støttet av en National Science Foundation CAREER Award 1149738 og en Professional staff Congress-CUNY Award til DPB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectrofluorometer Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon n/a Photon counting spectrofluorometer
Quartz cuvette Fireflysci (former Precision Cells Inc.) 701MFL
Dumont #5 tweezer World Precision Instruments 501985 Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers
Halocarbon oil 700 Sigma-Aldrich H8898
Cover slip No.1 22 mm x 40 mm VWR 48393-048
Dissecting microscope Leica MZ6 Leica Microsystems Inc. n/a
CO2 fruit fly anesthesia pad Genesee Scienific 59-114
Tris-HCL pH 7.5 Sigma-Aldrich 1185-53-1
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 7791-18-6
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
Spinning disc confocal microscope Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc. n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera Hamamatsu n/a
PatchMan NP 2 Micromanipulator Eppendorf Inc. 920000037
FemtoJet Microinjector Eppendorf Inc. 920010504
Injection needle: Femtotips II Eppendorf Inc. 930000043
Loading tip: 20 μL Microloader Eppendorf Inc. 930001007
Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22 mm x 40 mm VWR 48393-026; 48393-172
Dry yeast Any grocery store n/a
Computer, > 20 GB RAM Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nature Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
  2. Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 11, 25-47 (2009).
  3. Mannack, L. V., Eising, S., Rentmeister, A. Current techniques for visualizing RNA in cells. F1000Research. 5, (2016).
  4. Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene. Science. 332 (6028), 475-478 (2011).
  5. Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
  6. Garcia, J. F., Parker, R. MS2 coat proteins bound to yeast mRNAs block 5' to 3' degradation and trap mRNA decay products: implications for the localization of mRNAs by MS2-MCP system. RNA. 21 (8), 1393-1395 (2015).
  7. Bratu, D. P. Molecular beacons: Fluorescent probes for detection of endogenous mRNAs in living cells. Methods in Molecular Biology. 319, 1-14 (2006).
  8. Bratu, D. P., Cha, B. J., Mhlanga, M. M., Kramer, F. R., Tyagi, S. Visualizing the distribution and transport of mRNAs in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 100 (23), 13308-13313 (2003).
  9. Tyagi, S., Kramer, F. R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nature Biotechnology. 14 (3), 303-308 (1996).
  10. Chen, M., et al. A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level. Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).
  11. Liu, Y., et al. Multiplex detection of microRNAs by combining molecular beacon probes with T7 exonuclease-assisted cyclic amplification reaction. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 107-114 (2017).
  12. Baker, M. B., Bao, G., Searles, C. D. In vitro quantification of specific microRNA using molecular beacons. Nucleic Acids Research. 40 (2), e13 (2012).
  13. Ko, H. Y., et al. A color-tunable molecular beacon to sense miRNA-9 expression during neurogenesis. Scientific Reports. 4, 4626 (2014).
  14. Vet, J. A., et al. Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 96 (11), 6394-6399 (1999).
  15. Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. Molecular beacons for protein-DNA interaction studies. Methods in Molecular Biology. 429, 209-224 (2008).
  16. Li, W. M., Chan, C. M., Miller, A. L., Lee, C. H. Dual Functional Roles of Molecular Beacon as a MicroRNA Detector and Inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3568-3580 (2017).
  17. Kuang, T., Chang, L., Peng, X., Hu, X., Gallego-Perez, D. Molecular Beacon Nano-Sensors for Probing Living Cancer Cells. Trends in Biotechnology. 35 (4), 347-359 (2017).
  18. Ban, K., et al. Non-genetic Purification of Ventricular Cardiomyocytes from Differentiating Embryonic Stem Cells through Molecular Beacons Targeting IRX-4. Stem Cell Reports. 5 (6), 1239-1249 (2015).
  19. Hadjinicolaou, A. V., Demetriou, V. L., Emmanuel, M. A., Kakoyiannis, C. K., Kostrikis, L. G. Molecular beacon-based real-time PCR detection of primary isolates of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis in environmental and clinical samples. BMC Microbiology. 9, 97 (2009).
  20. McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. Drosophila melanogaster Oogenesis: An Overview. Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).
  21. Bastock, R., St Johnston, D. Drosophila oogenesis. Current Biology. 18 (23), R1082-R1087 (2008).
  22. Rongo, C., Gavis, E. R., Lehmann, R. Localization of oskar RNA regulates oskar translation and requires Oskar protein. Development. 121 (9), 2737-2746 (1995).
  23. Mhlanga, M. M., et al. In vivo colocalisation of oskar mRNA and trans-acting proteins revealed by quantitative imaging of the Drosophila oocyte. PLoS One. 4 (7), e6241 (2009).
  24. Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P., Catrina, I. E. PinMol: Python application for designing molecular beacons for live cell imaging of endogenous mRNAs. bioRxiv. , (2018).
  25. Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes. Nucleic Acids Research. 30 (21), e122 (2002).
  26. Bratu, D. P., Catrina, I. E., Marras, S. A. Tiny molecular beacons for in vivo mRNA detection. Methods in Molecular Biology. 714, 141-157 (2011).
  27. Dean, D. A. Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection. Cold Spring Harbor. 2006 (7), (2006).
  28. Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
  29. Jackson, S. R., et al. Applications of Hairpin DNA-Functionalized Gold Nanoparticles for Imaging mRNA in Living Cells. Methods in Enzymology. 572, 87-103 (2016).
  30. Zimyanin, V. L., et al. In vivo imaging of oskar mRNA transport reveals the mechanism of posterior localization. Cell. 134 (5), 843-853 (2008).
  31. Catrina, I. E., Marras, S. A., Bratu, D. P. Tiny molecular beacons: LNA/2'-O-methyl RNA chimeric probes for imaging dynamic mRNA processes in living cells. ACS Chemical Biology. 7 (9), 1586-1595 (2012).
  32. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA. Nucleic Acids Research. 36 (12), e69 (2008).
  33. Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Research. 32 (6), e58 (2004).
  34. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells. Nucleic Acids Research. 35 (16), e105 (2007).
  35. Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review of Genetics. 50, 235-266 (2016).
  36. Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).
  37. Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).
  38. Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
  39. Trcek, T., et al. Drosophila germ granules are structured and contain homotypic mRNA clusters. Nature Commununications. 6, 7962 (2015).

Tags

Biologi molekylær Beacon Live celle Imaging endogene mRNA visualisering mRNA smugling Drosophila melanogaster egg kammer egg kammer microinjection colocalization partikkel sporing.
Visualisering og sporing endogene mRNAs i live <em>Drosophila melanogaster</em> egg Chambers
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar,… More

Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers. J. Vis. Exp. (148), e58545, doi:10.3791/58545 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter