Summary
نقدم هنا، بروتوكول ينطوي على فوتواكتيفاتابل طيفيا متميزة إلى جانب وراثيا والبروتينات الفلورية. تسمح هذه التركيبات بروتين فلوري التحديد الكمي للكسر FP السلطة الفلسطينية هو فوتواكتيفاتيد أن تكون نيون، أي كفاءة فوتواكتيفيشن. البروتوكول يكشف عن أن أوضاع مختلفة من فوتواكتيفيشن تحقق الكفاءة فوتواكتيفيشن مختلفة.
Abstract
فوتواكتيفاتابل-والبروتينات الفلورية القابلة للتحويل (السلطة الفلسطينية-FPs) قد استخدمت في الأسفار يعيش خلية مجهرية لتحليل ديناميات الخلايا والبروتين الفرق. حتى الآن، أي أسلوب كانت متاحة للقياس الكمي بكميات كبيرة وفي العيش الخلايا أعرب عن كم من السلطة الفلسطينية-في الثانية فوتواكتيفاتيد فلوريس.
هنا، فإننا نعرض على بروتوكول يشمل الحكام الداخلية، أي وراثيا زوجت بروتينات الفلورسنت طيفيا متميزة (فوتواكتيفاتابل)، إلى راتيوميتريكالي التحديد الكمي لجزء صغير من جميع FPs السلطة الفلسطينية أعرب في خلية التي يتم تشغيلها على أن تكون الفلورسنت. باستخدام هذا البروتوكول، نظهر أن أوضاع مختلفة من فوتواكتيفيشن أسفرت عن كفاءات فوتواكتيفيشن مختلفة. فوتواكتيفيشن عالية الطاقة قصيرة مع ليزر [كنفوكل] المسح مجهر (كلسم) أدت إلى ما يصل إلى أربع مرات أقل كفاءة فوتواكتيفيشن من مئات من التعرض ذات المستوى المنخفض التي تطبقها كلسم أو نبضة قصيرة تطبقها الإضاءة ويديفيلد. بينما البروتوكول قد تم يتضح هنا للتجارة والنقل (السلطة الفلسطينية-) و (PA-) الكرز، فإنه يمكن من حيث المبدأ تطبيق أي زوج طيفيا متميزة من البروتينات الفلورية فوتواكتيفاتابل أو فوتوكونفيرتيبلي وأي الإعداد التجريبية.
Introduction
في عام 2002، تم وصف أول فوتواكتيفاتابل المطبقة على نطاق واسع (1من السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل) والبروتينات الفلورية فوتوكونفيرتيبلي (كايد2). هذه البروتينات الفلورية مبرز بصري تغيير خصائصها الطيفية عند التشعيع بالأشعة فوق البنفسجية-الضوء، أي أنها تصبح مشرقة (البروتينات الفلورية فوتواكتيفاتابل، أي السلطة الفلسطينية-في الثانية)، أو تغيير لونها (فوتوكونفيرتيبلي إطارا في الثانية). وحتى الآن، كانت عدة بروتينات الفلورسنت فوتواكتيفاتابل وفوتوكونفيرتيبلي عكسها ولا رجعة فيها نمواً3،4. في دراسات الفرقة أو السائبة، استخدمت أقلام ضوئية لدراسة ديناميات خلايا بأكملها أو البروتينات، وربط الأجزاء الأخرى سوبسيلولار. وعلاوة على ذلك، تقوم أقلام ضوئية ممكنة واحدة جزيء سوبيريسولوشن تقنيات مثل النخيل5 و6من فبالم التصوير.
على الرغم من أن العملياتالكيميائية الصورة أثناء فوتواكتيفيشن-أو التحويل وقد وصفت العديد من أقلام ضوئية وهياكل بلورية حتى قبل وبعد فوتواكتيفيشن/--بذلت التحويل المتوفرة7 , 8، والكامنة وراء الصورةالمادية إليه فوتواكتيفيشن--والتحويل ليست مفهومة تماما. وعلاوة على ذلك، حتى الآن تقديرات النفط الخام فقط موجودة كفاءة فوتواكتيفيشن--والتحويل، وهو جزء صغير البروتينات الفلورية أعرب هو فعلا فوتوكونفيرتيد أو فوتواكتيفاتيد أن تكون مضيئة. وأفيد في المختبر الدراسات فرقة التحديد الكمي لهذا التحول في امتصاص الأطياف ومبلغ أصلي وتنشيط البروتين في جل9،،من1011.
نقدم هنا، على بروتوكول يشمل التركيبات البروتينات الفلورية لتقييم جزء البروتينات الفلورية فوتواكتيفاتيد بكميات كبيرة وفي الخلايا الحية. كلما كان العمل مع البروتينات الفلورية وراثيا المرمزة، المبلغ المطلق للبروتين وأعرب يختلف من خلية إلى خلية وغير معروف. إذا خلية واحدة معربا عن السلطة الفلسطينية-FP يظهر إشارة أكثر إشراقا بعد فوتواكتيفيشن من خلية أخرى، لا يميز إذا كانت هذه إشارة أكثر إشراقا بسبب التعبير أعلى من السلطة الفلسطينية-تنظيم الأسرة أو فوتواكتيفيشن أكثر كفاءة من السلطة الفلسطينية-تنظيم الأسرة. لتوحيد مستوى التعبير في الخلايا، نقدم المساطر الداخلية وراثيا إلى جانب البروتينات الفلورية طيفيا متميزة. اقتران يتم إنشاء المعلومات الجينية الخاصة بروتين فلوري فوتواكتيفاتابل طيفيا متميزة دائماً على فلورسنت بروتينات، المساطر الداخلية التي سوف لا يزال تكون أعربت عن إلى مبلغ إجمالي غير معروف ولكن في كمية نسبية ثابتة ومعروفة من 1:1. هذه الاستراتيجية يسمح لوصف كمية من الأشعة فوق البنفسجية-الضوء فوتواكتيفيشن أنظمة مختلفة، أي، تقييم المبلغ النسبي للسلطة الفلسطينية-في الثانية التي يمكن أن تكون فوتواكتيفاتيد مع أنماط مختلفة من فوتواكتيفيشن، ومما يسمح لتعريف المخططات فوتواكتيفيشن التي أكثر فاعلية من غيرها. وعلاوة على ذلك، تسمح هذه الاستراتيجية في مبدأ التقييم الكمي المطلق للكسر فوتواكتيفاتيد السلطة الفلسطينية-تنظيم الأسرة. وتحقيقا لهذه الغاية، من المهم أن ندرك أن هذه الدراسات قدمت فرقة القائم على كثافة مما يجعل التحليل أكثر تعقيداً على النحو المنصوص عليه في هذا البروتوكول. معلمات تحديد قياس كثافة الفلورسنت، أي مختلفة السطوع الجزيئية وامتصاص وأطياف الانبعاث وآثار الحنق، تحتاج إلى أخذها في الاعتبار عند مقارنة الأسفار كثافات مختلفة من البروتينات الفلورية.
راتيوميتريك قدم على أساس كثافة التقدير الكمي للكفاءة فوتواكتيفيشن يتمثل للسلطة الفلسطينية-التجارة والنقل، والسلطة الفلسطينية-الكرز في الخلايا الحية، ولكن من حيث المبدأ المطبق على نطاق واسع ويمكن استخدامها لأي بروتين فلوري فوتواكتيفاتابل تحت أي حالة تجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-بلازميد البناء
- توليد المسابير اللونين الانصهار. استخدام ناقل تعبير خلايا الثدييات (انظر الجدول للمواد) في mCherry112 والسلطة الفلسطينية-mCherry113 التي تم إدراجها مع التقييد مواقع يجئ و بسرجي-
- ترتيب النيوكليوتيدات اليغو مخصصة لتضخيم المتغيرات أحادي اجفب والسلطة الفلسطينية-اجفب تحتوي على الطفرة A206K، أي ميجفب و السلطة الفلسطينية-ميجفب14 دون كودون توقف كجزء من سالي بامهي . استخدام التمهيدي الطرفي ن 5 '-صرفة ﻷعمالهم كاج TCG ACG ATG دايمنشن AGC AAG السواقين هفوة G 3' وج-الطرفية التمهيدي 5 '-صرفة آتا تج المنسوجات والملابس سی ضريبة تحويل العملة ع كاج لجنة مكافحة الإرهاب غيغاطن القط GC 3' وإدراج هذا الجزء بامهي سالي في موقع ناقل التعبير الاستنساخ لأغراض متعددة. وهذا سيخلق رابط خمسة من الأحماض الأمينية رنبف بين البروتين الفلورية الخضراء والحمراء. وسوف نشير إلى التركيبات fluorophore كالتجارة والنقل – الكرز، والسلطة الفلسطينية-التجارة والنقل – الكرز، والتجارة والنقل – الكرز السلطة الفلسطينية لما تبقى من هذه المادة.
ملاحظة: اقتران fluorophores وخلق المساطر الداخلية لتقييم الكفاءة فوتواكتيفيشن يمكن أن يتم مع أي زوج fluorophore طيفيا متميزة، مثل سوبيرفولدير السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل 15/السلطة الفلسطينية-تاجرفب 16، و ما إلى ذلك كثير من البروتينات الفلورية فوتواكتيفاتابل مستمدة من التجارة والنقل. ومن ثم، يمكن استخدام تسلسل التمهيدي الوارد أعلاه للعديد من البروتينات الفلورية لتشييد حلما fluorophore في ناقل تعبير خلايا الثدييات.
2-الخلية الثقافة وتعداء
- استخدام أما أي خط الخلية القياسية مثل هيلا، النرويجية، كوس-7 أو خط خلية محددة لاستخدامها للتجارب فوتواكتيفيشن محددة. استخدام دميم (تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين، والجلوتامين 2 مم) والتربسين دون الفينول الأحمر (انظر الجدول للمواد) للحد من الأسفار الخلفية.
- فصل الخلايا من ثقافة المتلاقية مع التربسين، وحساب عدد الخلايا في خلية تعليق استخدام دائرة نويباور، وخلايا البذور 5,000 – 10,000 لكل بئر. بدلاً من ذلك، استخدام قطره 1 من ماصة 2 مل من تعليق خلية 10 مل من ثقافة خلية المتلاقية نمت في قارورة 25-خلية ثقافة تي أو 3 قطرات من تعليق خلية 5 مل من ثقافة المتلاقية نمت في قارورة 12.5-خلية ثقافة تي.
- تنمو الخلايا في الدوائر 8-جيدا مع تغطية #1.0 (انظر الجدول للمواد) للفحص المجهري خلية يعيش fluorescence الزجاج.
- ترانسفيكت الخلايا ح 24 بعد تصفيح استخدام الكواشف التجارية (انظر الجدول للمواد) كل البروتوكول لموزع مع التجارة والنقل – الكرز، والسلطة الفلسطينية-التجارة والنقل-الكرز، والتجارة والنقل – التركيبات السلطة الفلسطينية-الكرز.
- وظيفة الخلايا الصورة بعد ما مجموعة 20 ح تعداء للسماح للتعبير البروتين وقابلة للطي والنضج.
3-تصوير وفوتواكتيفيشن
- صورة الخلايا في دائرة بيئية هوميديفيد وساخنة في 37 درجة مئوية. المخزن المؤقت وسائل الإعلام الخلية في الأس الهيدروجيني الفسيولوجي، وجعله CO2-المستقلة، إضافة 20 مم حبيس، أو استخدام الغاز2 CO لتدفق 5%.
- أولاً، صورة خلايا الإعراب عن التجارة والنقل – بناء الكرز. تعيين المعلمات التي تحدد كثافة الليزر المتكاملة مرة كل بكسل في الصورة [كنفوكل]، أي بكسل يسكن الوقت في ميكرو ثانية، وانتقال تصفية الانضباطي أكوستو الضوئية (أوتف) في المائة، وتقريب رقمي.
ملاحظة: يسمح استخدام هدفا 60 x وتقريب رقمي ل 3 x تصوير الخلية بأكملها بينما يوفر التكبير كافية. تعيين وقت يسكن بكسل ميكروثانية وانتقال أوتف الليزر من 488-شمال البحر الأبيض المتوسط، وشمال البحر الأبيض المتوسط-561 2-4 أن الصور تظهر نسبة الإشارة إلى الضوضاء جيدة دون أي تبيض ولا تشير إلى الأسفار شدة التشبع بكسل. - الصورة، باستخدام الليزر تعيين السلطة وانتقال أوتف والوقت يسكن بكسل وتقريب رقمي، الخلايا 15-20 معربا عن التجارة والنقل – الكرز.
- ثم، صورة مع نفس مجموعة الليزر الطاقة والوقت يسكن بكسل، وانتقال أوتف والخلايا التكبير الرقمي معربا عن التجارة والنقل – الكرز السلطة الفلسطينية والسلطة الفلسطينية-التجارة والنقل-الكرز. البحث عن الخلايا في قناة الأخضر أو القناة الحمراء، على التوالي. تجنب التعرض الطويل للخلايا أثناء البحث عن الإعراب عن الخلايا من أجل عدم التبييض البروتينات الفلورية.
- قم بإعداد سلسلة زمنية صغيرة مع صورة التنشيط قبل واحدة وثلاث التنشيط بعد الصور. الصور بعد انتهاء التنشيط سيساعد على تحديد الدول الظلام عابرة المحتملة بسبب التعرض للأشعة فوق البنفسجية-الضوء.
ملاحظة: في أيدينا، كانت التغيرات في كثافة الأسفار الكشف عن سبب عابر الدول المظلمة < 1%، ويمكن أن تكون مهملة، ولكن ينبغي أن تقيم تلك الدول المظلمة لكل الإعداد التجريبية. - لتحديد كفاءة فوتواكتيفيشن، أي الجزء من السلطة الفلسطينية-في الثانية التي يتم تبديل على أن تكون نيون، في التجارب فوتواكتيفيشن المحددة التي أنشئت بالفعل، تطبيق نفس إعدادات فوتواكتيفيشن إلى خلايا 15-20 أن يعربون عن المساطر الداخلية وعرض هنا والمضي قدما في تحليل الصورة (القسم 4). إذا بدأت في إعداد تجارب فوتواكتيفيشن، تجد هنا بعض إعدادات مختلفة استناداً إلى تجربتنا تجريبية مع السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل، والسلطة الفلسطينية-الكرز؛ تعديل حسب الحاجة.
- فوتواكتيفيشن لحظية للسلطة الفلسطينية-التجارة والنقل، والسلطة الفلسطينية-الكرز باستخدام ليزر [كنفوكل] المسح مجهر (كلسم)، تطبق μW 90 من 405 نانومتر الليزر الخفيفة في تكرارات 3 أو 5، على التوالي.
ملاحظة: لدينا البنية المجهرية، مع استخدام إرسال AOTM 38% ومرة يسكن بكسل 2 ميكروثانية، قمنا بقياس هذه السلطة 405 نانومتر الليزر في وضع خط المسح الضوئي في عدسة الهدف. مع هذه الإعدادات، يمكن حوالي 8 في المائة و 16 في المائة من السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل، والسلطة الفلسطينية-الكرز وأعربت عن فوتواكتيفاتيد لتكون الفلورسنت. السلسلة كاملة معايرة باستخدام كلسم فوتواكتيفيشن لحظية قد نشرت سابقا17. - إذا كان جزء أعلى من فلوروفوريس فوتواكتيفاتيد السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل، والسلطة الفلسطينية-الكرز مفيد مثلاً لتحقيق أعلى نسبة إشارة إلى الضجيج، وليس لديه فوتواكتيفيشن أن تكون فورية، تطبيق μW 40 من 405 نانومتر الليزر الخفيفة مع 2 ميكروثانية بكسل يسكن الوقت و 6% أوتف نقل 450 التكرارات. ثم، فوتواكتيفيشن سوف يستغرق مدة تصل إلى 4 دقيقة بدلاً من 1-2 ثانية فقط، ولكن الكفاءة فوتواكتيفيشن للسلطة الفلسطينية-التجارة والنقل سيكون 29% بدلاً من 8%، مما يسمح لأعلى نسبة إشارة إلى الضجيج.
- فوتواكتيفيشن لحظية للسلطة الفلسطينية-التجارة والنقل، والسلطة الفلسطينية-الكرز باستخدام ليزر [كنفوكل] المسح مجهر (كلسم)، تطبق μW 90 من 405 نانومتر الليزر الخفيفة في تكرارات 3 أو 5، على التوالي.
- في حالة توفر نظام إضاءة رقمية فسيفساء يحتوي على صفائف مرآة صغيرة في المكاني المغير خفيفة، يمكن استخدام ضوء الليزر 405 نانومتر ويديفيلد-فوتواكتيفيشن. وهذا يسمح لكفاءة فوتواكتيفيشن داخل ميلي ثانية.
ملاحظة: مع 1.6 ميغاواط الليزر السلطة كما يقاس في عدسة الهدف ووقت تعرض لمرض التصلب العصبي المتعدد 250، 29% من السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل يمكن فوتواكتيفاتيد أن تكون مضيئة. - صورة مع أي معلمات فوتواكتيفيشن تعيين الخلايا 15-20 معربا عن السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل-الكرز والتجارة والنقل – السلطة الفلسطينية-الكرز، على التوالي.
- منذ الأس الهيدروجيني والأنواع الأكسجين التفاعلية وغيرها من العوامل البيئية قد تؤثر كفاءة فوتواكتيفيشن، قد يكون من المهم لتقييم الكفاءة فوتواكتيفيشن للسلطة الفلسطينية-في الثانية في ميكروميليو سوبسيلولار كل منهما حيث يكون بروتين الفائدة الموقع. باقتران التركيبات فلوروفوري لبروتين الفائدة، كما فعل أصحاب البلاغ مع فسفج غشاء البلازما بروتين 18، يمكن تقييم كفاءة فوتواكتيفيشن في حجرة سوبسيلولار محددة من الفائدة.
4-صورة التحليل وخوارزمية راتيوميتريك على أساس كثافة التقدير الكمي للكفاءة فوتواكتيفيشن
- يمكن أن يتم تحليل الصور مع الصورة المصدر المفتوح تجهيز منصات ImageJ أو فيجي. تحديد كثافة الخلفية الفلورية في غير transfected الخلايا الخضراء (ب1) والأحمر (ب2) القناة. تجنب بيرينوكلير أو أي مجالات عرض زيادة السيارات-الأسفار.
- لتحديد كثافة fluorescence في خلية transfected، مخطط الجسم الخلية باستخدام أداة تحديدات يدوي. ومرة أخرى، تجنب بيرينوكلير أو أي مجالات أخرى عرض السيارات-الأسفار.
- قم بطرح الخلفية من شدة الأسفار المقاسة في كل قناة.
أناز = أناGreen_measured – ب1
أناR = أناRed_measured – ب2 - استخدم في التجارة والنقل – بناء الكرز لحساب نسبة الأحمر إلى الأخضر (رتوجر) وتصحيح لتبريد المانحة نظراً لنقل الطاقة صدى الأسفار (بكى). تم تحديد فعالية الحنق ه لتكون 0.3 في تجارب سابقة للتجارة والنقل – الكرز بناء باستخدام رابط الحمض الأميني نفسه بين اثنين فلوروفوريس18.
رتوجر = (أناRed_measured – ب2)/(أناGreen_measured – ب1)
رتوجركور = رتوجر * (1 – ه)
ملاحظة: في هذا النهج القائم على كثافة المانحة تبريد ميجفب والسلطة الفلسطينية-مجفب قد تكون مختلفة نظراً للخواص الطيفية متميزة الممكنة التي اتسمت لا. معدل الحنق (كيت)، والمسافة فارستر (R0) يتوقف على العائد الكم للجهات المانحة التي لم تحدد ميجفب والسلطة الفلسطينية-مجفب. - استخدم في التجارة والنقل – بناء السلطة الفلسطينية-الكرز لتقييم جزء فوتواكتيفاتيد السلطة الفلسطينية-الكرز. تحديد كثافة الأسفار المتوقعة للسلطة الفلسطينية-الكرز بضرب الفلورية الخضراء ملح قياس كثافة التجارة والنقل – بناء السلطة الفلسطينية-الكرز السابقة إلى فوتواكتيفيشن مع تصحيحها الأحمر--إلى--الأخضر-النسبة (رتوجركور ).
أناRed_expected = (طGreen_measured – ب1) * رتوجركور
ملاحظة: كما هو مبين أعلاه، قد يكون سطوع الجزيئية فوتواكتيفاتابل تنظيم الأسرة وتنظيم الأسرة دائماً على مختلفة. انظر المناقشة لمزيد من المعلومات حول كيفية حساب هذه الاختلافات. - حساب كفاءة فوتواكتيفيشن الكرز السلطة الفلسطينية كجزء من الأسفار الأحمر قياس كثافة بعد فوتواكتيفيشن وشدة الأسفار المتوقعة في القناة الحمراء.
(والسلطة الفلسطينية-الكرز) = (أناRed_measured – ب2)/أناRed_expected - استخدام السلطة الفلسطينية-بروتينات فلورية خضراء – الكرز بناء على تقييم جزء فوتواكتيفاتيد السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل. تحديد كثافة الأسفار المتوقعة للسلطة الفلسطينية-التجارة والنقل بواسطة قسمة كثافة ومضان أحمر المقاسة السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل-الكرز بناء مسبق إلى فوتواكتيفيشن بالأحمر--إلى--الخضراء-النسبة (رتوجر). هنا، رتوجر لا تحتاج إلى تصحيح للمانحين تبريد، للتجارة والنقل والتجارة والنقل-السلطة الفلسطينية تخضع للمانحين تبريد بنفس المبلغ.
أناGreen_expected = (أناRed_measured – ب2)/رتوجر - حساب كفاءة فوتواكتيفيشن السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل كجزء من فوتواكتيفيشن بعد كثافة الفلورية الخضراء المقاسة وشدة الأسفار المتوقعة في قناة الأخضر.
(والسلطة الفلسطينية-التجارة والنقل) = (أناGreen_measured – ب1)/أناGreen_expected
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
البروتوكول المعروضة هنا يظهر التحديد الكمي لجزء صغير البروتينات الفلورية التي فوتواكتيفاتيد لتكون نيون راتيوميتريك (الشكل 1). هذا الكسر يختلف تبعاً لطريقة فوتواكتيفيشن.
نتيجة نموذجية باستخدام فوتواكتيفيشن عالية الطاقة في وقت قصير مع [كنفوكل] ليزر المسح مجهر (كلسم) يرد في الشكل 2 (ج). بعد المعايرة قوة الليزر التي تقاس بكسل في عدسة الهدف يسكن الزمن وانتقال ATOF، وكفاءة فوتواكتيفيشن الحد الأقصى للسلطة الفلسطينية-التجارة والنقل كان حوالي 8%، والسلطة الفلسطينية-الكرز حوالي 16%. ويمكن تفسير كفاءة فوتواكتيفيشن منخفضة نسبيا للسلطة الفلسطينية-التجارة والنقل، والسلطة الفلسطينية-الكرز فوتواكتيفيشن المتزامنة-وتدمير عندما تتعرض إلى تيار مستمر قطعية من الفوتونات التي كلسم. عمر fluorescence أقصر وأطياف امتصاص مختلفة، تحول حق الأحمر قد تسهم السلطة الفلسطينية-في الثانية أعلى كفاءة فوتواكتيفيشن السلطة الفلسطينية-الكرز المقارنة للسلطة الفلسطينية-التجارة والنقل.
استخدام الليزر منخفض الطاقة ومئات من التكرارات، يمكن تحقيق مستوى أعلى من كفاءة فوتواكتيفيشن. تكرارات 450 من الأشعة فوق البنفسجية-الضوء تسليم ما مجموعة 4 دقيقة قبل كلسم أسفرت عن كفاءة فوتواكتيفيشن نسبة 29% للسلطة الفلسطينية-التجارة والنقل (الشكل 3 ج). قد تشير إلى أعلى كفاءة فوتواكتيفيشن مع تكرار التعرض للأشعة فوق البنفسجية-الضوء الفوتونات عملية متعددة الخطوات فوتواكتيفيشن. وبدلاً من ذلك، تطبيق الأشعة فوق البنفسجية-الضوء قوية بما يكفي فوتواكتيفاتي ولكن لا يكفي أن فوتوديستروكت الذي يقود المتراكمة على مر الزمن إلى نسبة أعلى من البروتينات الفلورية فوتواكتيفاتيد.
مع إضاءة ويديفيلد، فلوروفوريس ستوتشاستيكالي ومتكررة يتعرضون للفوتونات 405 نانومتر. هنا، أسفرت عن التعرض لالا 250 مللي من كفاءة فوتواكتيفيشن 29% للسلطة الفلسطينية-التجارة والنقل.
رقم 1: مفهوم كيفية تحديد كفاءة فوتواكتيفيشن بكميات كبيرة وفي الخلايا الحية- باقتران البروتينات الفلورية طيفيا متميزة، يتم إنشاء المساطر الداخلية التي تسمح بتقييم كفاءة فوتواكتيفيشن على أساس كثافة راتيوميتريك. قياس كثافة الكرز السلطة الفلسطينية والسلطة الفلسطينية-التجارة والنقل مرتبطة بالشدة المتوقعة. كثافات المتوقعة مستمدة من تحديد كثافة الأسفار دائماً على الفلورسنت البروتينات في التجارة والنقل-الكرز أو بروتينات فلورية خضراء-السلطة الفلسطينية-الكرز أو التركيبات السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل-الكرز قبل فوتواكتيفيشن. الرقم معدلة من Renz و 2017 فوندر17. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: الجزء الأكبر فوتواكتيفيشن للسلطة الفلسطينية-التجارة والنقل-الكرز (أ) والتجارة والنقل-السلطة الفلسطينية-الكرز (ب) على الفور وبشكل كامل قدر الإمكان استخدام مجهر مسح ليزر [كنفوكل] في الخلايا الحية- وكان 8% من بروتينات فلورية خضراء-السلطة الفلسطينية وأعرب عن فوتواكتيفاتيد مع وقت يسكن بكسل من 2 ميكروثانية ونقل أوتف 38% مما يسفر عن قوة الليزر μW 90، كما يقاس في عدسة الهدف والتكرار 3 (ج). زيادة قوة 405 نانومتر الليزر لم زيادة كفاءة فوتواكتيفيشن. الرقم معدلة من Renz و 2017 فوندر17. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: فوتواكتيفيشن طاقة منخفضة متكررة مع مجهر مسح ليزر [كنفوكل] (أ) وويديفيلد عالية الطاقة قصيرة الإضاءة (ب) العائد أعلى الكفاءات فوتواكتيفيشن. وكان 29 في المائة من السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل فوتواكتيفاتيد مع وقت يسكن بكسل من 2 ميكروثانية ونقل أوتف 6%، مما يسفر عن قوة الليزر μW 40، كما يقاس في عدسة الهدف وتكرارات 450 (ج). الرقم معدلة من Renz و 2017 فوندر17. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
حتى الآن، وجود أي أسلوب لتحديد جزء صغير من السلطة الفلسطينية-FPs المعرب عنها في الخلايا الحية التي فوتواكتيفاتيد أن تكون فلورسنت بكميات كبيرة. يمكن استخدام البروتوكول المقدم لأي زوج بروتين فلوري طيفيا متميزة. بينما يتضح هنا للا رجعة فيها السلطة الفلسطينية السلطة الفلسطينية-FPs-التجارة والنقل، والسلطة الفلسطينية-الكرز، هذا النهج في مبدأ ينطبق على البروتينات فوتوكونفيرتيبلي كذلك. بروتين فلوري طيفيا متميزة، ومع ذلك، يجب تحديد بعناية لتقليل التداخل الطيفي نظراً لأن نقل البروتينات الفلورية فوتوكونفيرتيبلي امتصاص وأطياف الانبعاث، مثلاً من اللون الأخضر إلى الأحمر الفلورية.
كما هو مبين أعلاه، من المهم أن القول بأن النهج الذي قدم راتيوميتريك والقائم على كثافة. يمكن استخدامه لتوحيد مستوى التعبير غير معروف في الخلايا وتحديد الاختلافات النسبية في الكفاءة فوتواكتيفيشن بطرق مختلفة من فوتواكتيفيشن. يمكن أيضا استخدام البروتوكول لتقييم الكسر المطلقة من فوتواكتيفاتيد السلطة الفلسطينية-في الثانية. ثم، الخصائص الطيفية المختلفة المختلفة إطارا في الثانية بحاجة إلى أن تؤخذ في الاعتبار.
سطوع الجزيئية (MB) هو المنتج العائد الكم (كي)، ومعامل الانقراض (EC) وامتصاص النسبة المئوية في الطول الموجي الإثارة معينة بالنسبة إلى ذروة امتصاص. ل الكرز12 والكرز السلطة الفلسطينية13، تم نشر القيم الخاصة بكل منها لكي والمفوضية الأوروبية. هو امتصاص النسبة المئوية في الطول الموجي الإثارة معين من 543 شمال البحر الأبيض المتوسط نسبة إلى ذروة امتصاص 0.5 و 0.7، على التوالي.
ميغا بايتالكرز = 0.22 * 72,000 * 0.5 = 7,920
ميغا بايتالسلطة الفلسطينية-الكرز = 0.46 * 18,000 * 0.7 = 5,796
وهكذا، سطوع الجزيئية أقل من السلطة الفلسطينية-الكرز الكرز بالمقارنة مع يمكن أن تؤخذ في الاعتبار بقسمة أناRed_expected من 1.37 (مشتقة من 7,920/5,796).
ومع ذلك، غير معروف في ظل الظروف فوتواكتيفيشن التي تم تحديد سطوع الجزيئية نشرت السلطة الفلسطينية-الكرز. وهذا مهم، نعرض هنا أن يغير طريقة فوتواكتيفيشن الكسر المقاسة من فوتواكتيفاتيد السلطة الفلسطينية-في الثانية. وعلاوة على ذلك، للحصول على إصدارات أحادي تضم الطفرة A206K. أي، ميجفب، والسلطة الفلسطينية-ميجفب، قد صدر لا سطوع الجزيئية.
في هذا النهج القائم على كثافة راتيوميتريك، سطوع الجزيئية للسلطة الفلسطينية-في الثانية ودائما على النظراء وتنظيم الأسرة في تقريب أولى اعتبرت متطابقة. قررنا في هذا النهج، حيث أبلغ (ط) لبعض FPs لا سطوع الجزيئية، و (ثانيا) من الواضح حتى الآن كيف الآن وسائط مختلفة من فوتواكتيفيشن قد تؤثر على سطوع الجزيئية في الثانية السلطة الفلسطينية ذكرت في الأدبيات. وعلاوة على ذلك، (ثالثا) لتحليل مقارن المعرفة بسطوع الجزيئية غير الضرورية؛ وهناك حاجة فقط لتحديد القائمة على كثافة في كسر المطلقة من فوتواكتيفاتيد السلطة الفلسطينية-في الثانية التي يمكن حسابها كما هو موضح أعلاه.
لدينا نهج يشمل التركيبات بروتين فلوري المساطر الداخلية يبين أن غلة مختلفة من التعرض للأشعة فوق البنفسجية الكفاءة فوتواكتيفيشن مختلفة. وبالتالي، فإنه يعرف خيارات كيفية كسر فوتواكتيفاتي السلطة الفلسطينية أكبر-تنظيم الأسرة وتحقيق أفضل نسبة الإشارة إلى الضوضاء. وعلاوة على ذلك، فإنه يتيح فرصاً خلطات فوتواكتيفاتي FPs السلطة الفلسطينية المختلفة في نفس الخلية نظراً لاستجابتها التفاضلية للأشعة فوق البنفسجية-الضوء أو خلطات فوتواكتيفاتي نفس السلطة الفلسطينية-تنظيم الأسرة في الأقسام المختلفة سوبسيلولار التي يعرضها بشكل مختلف لضوء الأشعة فوق البنفسجية. وباختصار، سيساعد لدينا بروتوكول كذلك فهم كمي للعمليات الخلوية التي تستخدم السلطة الفلسطينية-في الثانية في الفحص المجهري خلية يعيش.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
نود أن نشكر المختبر دوريغو و "دائرة التصوير علم الأعصاب" في "كلية الطب في جامعة ستانفورد" لتوفير المعدات ومساحة لهذا المشروع.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEGFP-N1 mammalian cell expression vector | Clontech | ||
| DMEM w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Trypsin w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8-well chambers #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 |
References
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Renz, M., Lippincott-Schwartz, J. Ch. 9. The Fluorescent Protein Revolution Series in Cellular and Clinical Imaging. Day, R. N., Davidson, M. W. , CRC Press. 201-228 (2014).
- Shcherbakova, D. M., Sengupta, P., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Photocontrollable fluorescent proteins for superresolution imaging. Annual Review of Biophysics. , 303-329 (2014).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Henderson, J. N., et al. Structure and mechanism of the photoactivatable green fluorescent protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (12), 4176-4177 (2009).
- Subach, F. V., et al. Photoactivation mechanism of PAmCherry based on crystal structures of the protein in the dark and fluorescent states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21097-21102 (2009).
- Wiedenmann, J., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (45), 15905-15910 (2004).
- Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3 (12), e3944 (2008).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature Methods. 6 (2), 153-159 (2009).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Slocum, J. D., Webb, L. J. A Double Decarboxylation in Superfolder Green Fluorescent Protein Leads to High Contrast Photoactivation. Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (13), 2862-2868 (2017).
- Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6481-6491 (2010).
- Renz, M., Wunder, C. Internal rulers to assess fluorescent protein photoactivation efficiency. Cytometry A. , (2017).
- Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), E2989-E2997 (2012).
