كيفية تحديد جزء صغير البروتينات الفلورية فوتواكتيفاتيد بكميات كبيرة وفي الخلايا الحية
Summary
نقدم هنا، بروتوكول ينطوي على فوتواكتيفاتابل طيفيا متميزة إلى جانب وراثيا والبروتينات الفلورية. تسمح هذه التركيبات بروتين فلوري التحديد الكمي للكسر FP السلطة الفلسطينية هو فوتواكتيفاتيد أن تكون نيون، أي كفاءة فوتواكتيفيشن. البروتوكول يكشف عن أن أوضاع مختلفة من فوتواكتيفيشن تحقق الكفاءة فوتواكتيفيشن مختلفة.
Abstract
فوتواكتيفاتابل-والبروتينات الفلورية القابلة للتحويل (السلطة الفلسطينية-FPs) قد استخدمت في الأسفار يعيش خلية مجهرية لتحليل ديناميات الخلايا والبروتين الفرق. حتى الآن، أي أسلوب كانت متاحة للقياس الكمي بكميات كبيرة وفي العيش الخلايا أعرب عن كم من السلطة الفلسطينية-في الثانية فوتواكتيفاتيد فلوريس.
هنا، فإننا نعرض على بروتوكول يشمل الحكام الداخلية، أي وراثيا زوجت بروتينات الفلورسنت طيفيا متميزة (فوتواكتيفاتابل)، إلى راتيوميتريكالي التحديد الكمي لجزء صغير من جميع FPs السلطة الفلسطينية أعرب في خلية التي يتم تشغيلها على أن تكون الفلورسنت. باستخدام هذا البروتوكول، نظهر أن أوضاع مختلفة من فوتواكتيفيشن أسفرت عن كفاءات فوتواكتيفيشن مختلفة. فوتواكتيفيشن عالية الطاقة قصيرة مع ليزر [كنفوكل] المسح مجهر (كلسم) أدت إلى ما يصل إلى أربع مرات أقل كفاءة فوتواكتيفيشن من مئات من التعرض ذات المستوى المنخفض التي تطبقها كلسم أو نبضة قصيرة تطبقها الإضاءة ويديفيلد. بينما البروتوكول قد تم يتضح هنا للتجارة والنقل (السلطة الفلسطينية-) و (PA-) الكرز، فإنه يمكن من حيث المبدأ تطبيق أي زوج طيفيا متميزة من البروتينات الفلورية فوتواكتيفاتابل أو فوتوكونفيرتيبلي وأي الإعداد التجريبية.
Introduction
في عام 2002، تم وصف أول فوتواكتيفاتابل المطبقة على نطاق واسع (1من السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل) والبروتينات الفلورية فوتوكونفيرتيبلي (كايد2). هذه البروتينات الفلورية مبرز بصري تغيير خصائصها الطيفية عند التشعيع بالأشعة فوق البنفسجية-الضوء، أي أنها تصبح مشرقة (البروتينات الفلورية فوتواكتيفاتابل، أي السلطة الفلسطينية-في الثانية)، أو تغيير لونها (فوتوكونفيرتيبلي إطارا في الثانية). وحتى الآن، كانت عدة بروتينات الفلورسنت فوتواكتيفاتابل وفوتوكونفيرتيبلي عكسها ولا رجعة فيها نمواً3،4. في دراسات الفرقة أو السائبة، استخدمت أقلام ضوئية لدراسة ديناميات خلايا بأكملها أو البروتينات، وربط الأجزاء الأخرى سوبسيلولار. وعلاوة على ذلك، تقوم أقلام ضوئية ممكنة واحدة جزيء سوبيريسولوشن تقنيات مثل النخيل5 و6من فبالم التصوير.
على الرغم من أن العملياتالكيميائية الصورة أثناء فوتواكتيفيشن-أو التحويل وقد وصفت العديد من أقلام ضوئية وهياكل بلورية حتى قبل وبعد فوتواكتيفيشن/–بذلت التحويل المتوفرة7 , 8، والكامنة وراء الصورةالمادية إليه فوتواكتيفيشن–والتحويل ليست مفهومة تماما. وعلاوة على ذلك، حتى الآن تقديرات النفط الخام فقط موجودة كفاءة فوتواكتيفيشن–والتحويل، وهو جزء صغير البروتينات الفلورية أعرب هو فعلا فوتوكونفيرتيد أو فوتواكتيفاتيد أن تكون مضيئة. وأفيد في المختبر الدراسات فرقة التحديد الكمي لهذا التحول في امتصاص الأطياف ومبلغ أصلي وتنشيط البروتين في جل9،،من1011.
نقدم هنا، على بروتوكول يشمل التركيبات البروتينات الفلورية لتقييم جزء البروتينات الفلورية فوتواكتيفاتيد بكميات كبيرة وفي الخلايا الحية. كلما كان العمل مع البروتينات الفلورية وراثيا المرمزة، المبلغ المطلق للبروتين وأعرب يختلف من خلية إلى خلية وغير معروف. إذا خلية واحدة معربا عن السلطة الفلسطينية-FP يظهر إشارة أكثر إشراقا بعد فوتواكتيفيشن من خلية أخرى، لا يميز إذا كانت هذه إشارة أكثر إشراقا بسبب التعبير أعلى من السلطة الفلسطينية-تنظيم الأسرة أو فوتواكتيفيشن أكثر كفاءة من السلطة الفلسطينية-تنظيم الأسرة. لتوحيد مستوى التعبير في الخلايا، نقدم المساطر الداخلية وراثيا إلى جانب البروتينات الفلورية طيفيا متميزة. اقتران يتم إنشاء المعلومات الجينية الخاصة بروتين فلوري فوتواكتيفاتابل طيفيا متميزة دائماً على فلورسنت بروتينات، المساطر الداخلية التي سوف لا يزال تكون أعربت عن إلى مبلغ إجمالي غير معروف ولكن في كمية نسبية ثابتة ومعروفة من 1:1. هذه الاستراتيجية يسمح لوصف كمية من الأشعة فوق البنفسجية-الضوء فوتواكتيفيشن أنظمة مختلفة، أي، تقييم المبلغ النسبي للسلطة الفلسطينية-في الثانية التي يمكن أن تكون فوتواكتيفاتيد مع أنماط مختلفة من فوتواكتيفيشن، ومما يسمح لتعريف المخططات فوتواكتيفيشن التي أكثر فاعلية من غيرها. وعلاوة على ذلك، تسمح هذه الاستراتيجية في مبدأ التقييم الكمي المطلق للكسر فوتواكتيفاتيد السلطة الفلسطينية-تنظيم الأسرة. وتحقيقا لهذه الغاية، من المهم أن ندرك أن هذه الدراسات قدمت فرقة القائم على كثافة مما يجعل التحليل أكثر تعقيداً على النحو المنصوص عليه في هذا البروتوكول. معلمات تحديد قياس كثافة الفلورسنت، أي مختلفة السطوع الجزيئية وامتصاص وأطياف الانبعاث وآثار الحنق، تحتاج إلى أخذها في الاعتبار عند مقارنة الأسفار كثافات مختلفة من البروتينات الفلورية.
راتيوميتريك قدم على أساس كثافة التقدير الكمي للكفاءة فوتواكتيفيشن يتمثل للسلطة الفلسطينية-التجارة والنقل، والسلطة الفلسطينية-الكرز في الخلايا الحية، ولكن من حيث المبدأ المطبق على نطاق واسع ويمكن استخدامها لأي بروتين فلوري فوتواكتيفاتابل تحت أي حالة تجريبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
حتى الآن، وجود أي أسلوب لتحديد جزء صغير من السلطة الفلسطينية-FPs المعرب عنها في الخلايا الحية التي فوتواكتيفاتيد أن تكون فلورسنت بكميات كبيرة. يمكن استخدام البروتوكول المقدم لأي زوج بروتين فلوري طيفيا متميزة. بينما يتضح هنا للا رجعة فيها السلطة الفلسطينية السلطة الفلسطينية-FPs-التجارة والن…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر المختبر دوريغو و “دائرة التصوير علم الأعصاب” في “كلية الطب في جامعة ستانفورد” لتوفير المعدات ومساحة لهذا المشروع.
Materials
| pEGFP-N1 mammalian cell expression vector | Clontech | ||
| DMEM w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Trypsin w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8-well chambers #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 |
References
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Day, R. N., Davidson, M. W. Ch. 9. The Fluorescent Protein Revolution Series in Cellular and Clinical Imaging. , 201-228 (2014).
- Shcherbakova, D. M., Sengupta, P., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Photocontrollable fluorescent proteins for superresolution imaging. Annual Review of Biophysics. , 303-329 (2014).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Henderson, J. N., et al. Structure and mechanism of the photoactivatable green fluorescent protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (12), 4176-4177 (2009).
- Subach, F. V., et al. Photoactivation mechanism of PAmCherry based on crystal structures of the protein in the dark and fluorescent states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21097-21102 (2009).
- Wiedenmann, J., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (45), 15905-15910 (2004).
- Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3 (12), e3944 (2008).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature Methods. 6 (2), 153-159 (2009).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Slocum, J. D., Webb, L. J. A Double Decarboxylation in Superfolder Green Fluorescent Protein Leads to High Contrast Photoactivation. Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (13), 2862-2868 (2017).
- Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6481-6491 (2010).
- Renz, M., Wunder, C. Internal rulers to assess fluorescent protein photoactivation efficiency. Cytometry A. , (2017).
- Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), E2989-E2997 (2012).
