Summary
Qui, presentiamo un protocollo che coinvolge fuse spettralmente distinti geneticamente accoppiati e proteine fluorescenti. Queste chimere di proteina fluorescente permettono quantificazione della frazione PA-FP è fotoattivazione di essere fluorescente, cioè, l'efficienza di fotoattivazione. Il protocollo rivela che i diversi modi di fotoattivazione rendimento fotoattivazione diverse efficienze.
Abstract
Fuse e - proteine fluorescenti convertibile (PA-FPs) sono state utilizzate in microscopia a fluorescenza cellule vive per analizzare la dinamica di cellule e proteine Ensemble. Finora, nessun metodo è stato disponibile per quantificare in massa e in vivo le cellule espresso quanti del PA-FPs sono fotoattivazione di fluorescenza.
Qui, presentiamo un protocollo che coinvolge righelli interni, vale a dire, geneticamente accoppiato spettralmente distinta (fuse) proteine fluorescenti, a ratiometrically quantificare la frazione di tutte le PA-FPs espresse in una cellula che sono accesi per essere fluorescente. Usando questo protocollo, mostriamo che diverse modalità di fotoattivazione dato fotoattivazione diverse efficienze. Fotoattivazione breve ad alta potenza con un laser confocale a scansione microscopio (CLSM) ha provocato fino a quattro volte inferiore fotoattivazione efficienza di centinaia di esposizioni a basso livello applicate da CLSM o un breve impulso applicato da widefield illuminazione. Mentre il protocollo è stato esemplificato qui per GFP (PA-) e (PA-) Cherry, può in linea di principio essere applicato a qualsiasi coppia di proteina fluorescente fuse o fotoconvertibile spettralmente distinta e qualsiasi set-up sperimentale.
Introduction
Nel 2002, il primo ampiamente applicabili fuse (PA-GFP1) e fotoconvertibile (Kaede2) proteine fluorescenti sono stati descritti. Queste proteine fluorescenti ottico evidenziatore modificarne le proprietà spettrali all'irradiazione con luce UV, cioè, essi diventano luminose (proteine fluorescenti fuse, cioè, PA-FPs), o cambiare il loro colore (fotoconvertibile FPs). Fino ad oggi, diversi reversibile e irreversibile fuse e fotoconvertibile proteine fluorescenti sono stati sviluppati3,4. Negli studi ensemble o alla rinfusa, evidenziatori ottici sono stati usati per studiare la dinamica di celle intere o proteine e la connettività dei compartimenti subcellulari. Inoltre, evidenziatori ottico abilitati singola molecola basata superresolution tecniche quali PALM5 e FPALM6di imaging.
Anche se i processichimici foto durante la fotoattivazione o - conversione sono state descritte per molti ottici evidenziatori e strutture cristallografiche anche prima e dopo la fotoattivazione / - conversione sono state apportate disponibili7 , 8, il sottostante meccanismofisico foto di fotoattivazione e - conversione completamente non è capito. Inoltre, finora solo grezza esiste stima dell'efficienza di fotoattivazione e - conversione, vale a dire, la frazione di proteine fluorescenti espresso che è in realtà la photoconverted o la fotoattivazione di essere fluorescente. In vitro studi ensemble sono stati segnalati quantificare lo spostamento in spettri di assorbimento e la quantità di nativo e ha attivato la proteina in un gel9,10,11.
Qui, presentiamo un protocollo che coinvolge le chimere di proteina fluorescente per valutare la frazione di proteine fluorescenti di fotoattivazione alla rinfusa e in cellule vive. Ogni volta che lavora con proteine fluorescenti geneticamente codificate, la quantità assoluta di proteina espressa varia da cellula a cellula ed è sconosciuta. Se una cellula che esprime un PA-FP Mostra un segnale luminoso dopo fotoattivazione rispetto a un'altra cella, non può essere differenziato se questo segnale luminoso è dovuto più alta espressione di PA-FP o un più efficiente fotoattivazione di PA-FP. Per standardizzare il livello di espressione in cellule, introduciamo interni governanti di proteine fluorescenti spettralmente distinte geneticamente accoppiate. Accoppiando l'informazione genetica di una proteina fluorescente fuse per un spettralmente distinta sempre su proteine fluorescenti, governanti interne vengono creati che sarà ancora espresso per un importo totale sconosciuto ma in una quantità fissa e nota relativa di 1: 1 questa strategia permette la caratterizzazione quantitativa di diversi schemi di fotoattivazione UV-luce, cioè, la valutazione della quantità relativa di PA-FPs che può essere la fotoattivazione con diverse modalità di fotoattivazione e quindi permette per definire schemi di fotoattivazione che sono più efficaci di altre. Inoltre, questa strategia permette in linea di principio, la valutazione della quantificazione assoluta della frazione fotoattivazione PA-FP. A tal fine, è importante rendersi conto che gli studi presentati ensemble sono basati su intensità che rende l'analisi più complessa, come stabilito nel presente protocollo. Parametri che determinano l'intensità di fluorescenza misurata, cioè, diverse luminosità molecolare, assorbanza e spettri di emissione e FRET effetti, devono essere considerati quando si confrontano le intensità di fluorescenza di diverse proteine fluorescenti.
La quantificazione di basati su intensità di raziometrici presentato di fotoattivazione efficienza è esemplificata per PA-GFP e PA-ciliegia in cellule vive, ma in linea di principio ampiamente applicabile e può essere utilizzata per qualsiasi proteina fluorescente fuse sotto qualsiasi condizione sperimentale.
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Protocol
1. plasmide costruzione
- Generare due colori fusione sonde. Utilizzare un vettore di espressione di cellule di mammifero (Vedi Tabella materiali) nel quale mCherry112 e PA-mCherry113 sono stati inseriti con la restrizione siti AgeI e BsrGI.
- Ordine personalizzato oligo-nucleotidi per amplificare le varianti monomeriche di eGFP e PA-eGFP contenente la mutazione A206K, vale a dire, mEGFP e PA-mEGFP14 senza un codone di arresto come un frammento di SalI-BamHI . Utilizzare il primer N-terminale 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3' e il C-terminale primer 5'-AAT ATA TGG ATC CCG CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC 3' e inserire questo frammento di SalI-BamHI nel polylinker del vettore di espressione. Questo creerà il linker cinque aminoacido RNPPV tra la proteina fluorescente verde e rosso. Ci riferiremo a chimare il fluoroforo come GFP — Cherry, PA-GFP — Cherry e GFP — PA-Cherry per il resto di questo articolo.
Nota: L'accoppiamento di fluorofori e creazione dei governanti interne per valutare l'efficienza di fotoattivazione può essere fatto con qualsiasi coppia di fluoroforo spettralmente distinti, ad esempio superfolder PA-GFP 15/ PA-TagRFP 16, ecc. Molte delle proteine fluorescenti fuse sono derivati da GFP. Quindi, la sequenza più superelegante fornita sopra utilizzabile per molte proteine fluorescenti per costruire una chimera fluoroforo in un vettore di espressione di cellule di mammifero.
2. cultura e transfezione delle cellule
- Utilizzare qualsiasi qualsiasi linea standard cellulare come HeLa, NRK, Cos-7 o una linea cellulare specifico per essere utilizzato per esperimenti di fotoattivazione specifici. Utilizzare DMEM (supplementato con 10% siero bovino fetale e la glutamina 2mm) e tripsina senza rosso fenolo (Vedi Tabella materiali) per ridurre la fluorescenza di fondo.
- Staccare le cellule di una cultura confluente con tripsina, contare il numero di cellule in sospensione cellulare utilizzando una camera di Neubauer e seme 5.000 – 10.000 cellule per pozzetto. In alternativa, usare 1 goccia da una pipetta di 2 mL di sospensione cellulare 10 mL da una coltura di cellule confluenti cresciuta in un matraccio di cultura 25-cellula di T o 3 gocce da una sospensione di cellule di 5 mL da una coltura confluente coltivata in un matraccio di cultura 12,5-cellula di T.
- Crescere le cellule in alloggiamenti di 8 pozzetti con coperchio #1.0 (Vedi Tabella materiali) di vetro per la microscopia di fluorescenza cellule vive.
- Transfect cellule 24 h dopo il placcaggio utilizzando reagenti commerciali (Vedi Tabella materiali) secondo il protocollo del distributore con la GFP — Cherry, PA-GFP — Cherry e GFP — chimere PA-Cherry.
- Celle di immagine dopo un totale di 20 h post transfezione per consentire l'espressione della proteina, la piegatura e la maturazione.
3. imaging e fotoattivazione
- Celle di immagine in una camera climatica umidificata e riscaldata a 37 gradi centigradi. Il media delle cellule del buffer a pH fisiologico ed eseguirne il rendering CO2-indipendente, aggiungere 20 mM HEPES, o utilizzare impostato su 5% flusso di gas di CO2 .
- Immagine in primo luogo, le cellule che esprimono la GFP — costrutto di ciliegia. Impostare i parametri che definiscono l'intensità del laser integrato a tempo al pixel in un'immagine confocale, vale a dire, tempo di permanenza del pixel in microsecondi, filtro tunable acusto-ottico (AOTF) trasmissione in per cento e lo zoom digitale.
Nota: Utilizzando un obiettivo 60 x e uno zoom digitale di 3 x permette di formazione immagine di una cellula nella sua interezza, fornendo sufficiente ingrandimento. Impostare tempo di permanenza di pixel per 2-4 μs e trasmissione AOTF per il laser di 488 nm e 561 nm tale che le immagini mostrano un buon rapporto segnale-rumore senza alcun candeggio e nessun pixel che indica la saturazione di intensità di fluorescenza. - L'immagine, utilizza la potenza laser set, trasmissione AOTF, tempo di permanenza di pixel e zoom digitale, 15-20 cellule che esprimono GFP — Cherry.
- Quindi, l'immagine con la stessa potenza del laser set, tempo di permanenza di pixel, trasmissione AOTF e zoom digitale cellule che esprimono GFP — PA-Cherry e PA-GFP — Cherry. Ricerca per esprimere cellule nel canale verde o canale rosso, rispettivamente. Evitare l'esposizione lunga delle cellule durante la ricerca di cellule che esprimono al fine di non candeggiare le proteine fluorescenti.
- Impostare una serie di mini-tempo con un'immagine di pre-attivazione e tre immagini di post-attivazione. Le immagini di post-attivazione aiuterà a identificare potenziali stati temporanei scuri a causa dell'esposizione alla luce UV.
Nota: Nelle nostre mani, cambiamenti nell'intensità di fluorescenza rilevati a causa di stati temporanei scuri erano < 1% e potrebbe essere trascurato, ma quegli stati scuri dovrebbero essere valutati per ogni set-up sperimentale. - Per determinare l'efficienza di fotoattivazione, cioè, la frazione di PA-FPs che è acceso per essere fluorescente, negli esperimenti fotoattivazione specifici che sono già stati stabiliti, applicare le stesse impostazioni di fotoattivazione per 15-20 cellule che stanno esprimendo i governanti interni introdotti qui e procedere con l'analisi di immagine (sezione 4). Se all'inizio impostare esperimenti di fotoattivazione, trovare qui alcune impostazioni differenti basate sulla nostra esperienza sperimentale con PA-GFP e PA-ciliegia; modificare come necessario.
- Per fotoattivazione istantanea di PA-GFP e PA-ciliegia utilizzando un laser confocale a scansione microscopio (CLSM), applicare μW 90 di 405 nm laser luce nelle iterazioni di 3 o 5, rispettivamente.
Nota: Con il nostro set-up al microscopio, utilizzando una trasmissione AOTM 38% e un tempo di permanenza del pixel 2 μs, abbiamo misurato questo potere laser 405 nm in modalità di scansione lineare alla lente dell'obiettivo. Con queste impostazioni, circa l'8% e 16% del PA-GFP e PA-Cherry espresso può essere fotoattivazione di essere fluorescente. La serie intera titolazione utilizzando CLSM per fotoattivazione istantaneo è stato precedentemente pubblicato17. - Se un' più alta frazione di fotoattivazione PA-GFP e PA-Cherry fluorofori è vantaggioso per esempio per raggiungere un più alto rapporto segnale-rumore e fotoattivazione non deve essere immediato, applicare μW 40 di 405 nm laser luce con un tempo di permanenza di μs pixel 2 e il 6% Trasmissione di AOTF per 450 iterazioni. Quindi, fotoattivazione vi porterà fino a 4 min invece di solo 1-2 secondi, ma l'efficienza di fotoattivazione per PA-GFP sarà 29% invece di 8%, consentendo un più alto rapporto segnale-rumore.
- Per fotoattivazione istantanea di PA-GFP e PA-ciliegia utilizzando un laser confocale a scansione microscopio (CLSM), applicare μW 90 di 405 nm laser luce nelle iterazioni di 3 o 5, rispettivamente.
- Se è disponibile un sistema di illuminazione digitale di mosaico contenente le matrici di micro specchio in un modulatore di luce spaziale, luce 405 nm laser può essere utilizzato per widefield-fotoattivazione. Questo consente per fotoattivazione efficiente in pochi millisecondi.
Nota: Con 1,6 mW laser di potenza misurata alla lente dell'obiettivo e un tempo di esposizione di 250 ms, 29% di PA-GFP può essere fotoattivazione di essere fluorescente. - Immagine con tutti i parametri di fotoattivazione set 15-20 cellule esprimenti PA-GFP — Cherry e GFP — PA-Cherry, rispettivamente.
- Poiché pH, specie reattive dell'ossigeno e altri fattori ambientali possono influenzare l'efficienza di fotoattivazione, può essere importante valutare le efficienze di fotoattivazione del PA-FPs nei rispettivi micromilieu subcellulari dove la proteina di interesse è si trova. Accoppiando le chimere fluoroforo alla proteina di interesse, come gli autori hanno fatto con la membrana plasmatica della proteina VSVG 18, fotoattivazione efficienza può essere valutata nel compartimento subcellulare specifico di interesse.
4. analisi dell'immagine e algoritmo per raziometrici quantificazione basata su intensità di fotoattivazione efficienza
- Analisi delle immagini può essere fatto con piattaforme ImageJ o Fiji di elaborazione delle immagini di fonte aperta. Determinare l'intensità di fluorescenza di fondo in cellule trasfettate con non nel verde (B1) e rosso (B2) canale. Evitare perinucleare o eventuali aree che mostrano una maggiore auto-fluorescenza.
- Per determinare l'intensità di fluorescenza in una cella transfettata, delineare il corpo della cella con lo strumento selezione a mano libera. Ancora una volta, evitare perinucleare o qualsiasi altre aree che mostrano auto-fluorescenza.
- Sottrarre il background dell'intensità di fluorescenza misurata in ciascun canale.
G = hoGreen_measured – B1
R = IRed_measured – B2 - Utilizzare la GFP — costrutto ciliegia per calcolare il rapporto di rosso e verde (RtoGr) e correggere per donatore-tempra a causa del trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET). L'efficienza FRET E è stata determinata per essere 0,3 in precedenti esperimenti per la GFP — costrutto ciliegia utilizzando il linker dell'amminoacido stesso tra i due fluorofori18.
RtoGr = (hoRed_measured – B2) / (hoGreen_measured – B1)
RtoGrcorr = RtoGr * (1 – E)
Nota: In questo intensità-base di approccio, donatore tempra per mEGFP e PA-EGFP potrebbe essere diverso dato possibili proprietà spettrali distinti che non sono stati caratterizzati. Il tasso di FRET (kET) e la distanza di Foerster (R0) dipende il rendimento quantico del donatore che non è stato determinato per mEGFP e PA-EGFP. - Utilizzare la GFP — costrutto PA-Cherry per valutare la frazione di fotoattivazione PA-Cherry. Determinare l'intensità di fluorescenza previsto di PA-Cherry moltiplicando l'intensità di fluorescenza verde inappagata misurato della GFP — PA-Cherry costruire preventiva di fotoattivazione con il corretto rosso-verde-rapporto-(RtoGrcorr ).
HoRed_expected (IGreen_measured – B1) = * RtoGrcorr
Nota: Come indicato sopra, la luminosità molecolare il sempre-su FP e fuse FP può essere diversa. Per ulteriori informazioni su come rendere conto di queste differenze, vedere discussione. - Calcolare l'efficienza di fotoattivazione di PA-Cherry come una frazione della fotoattivazione di intensità misurata fluorescenza rossa dopo e l'intensità di fluorescenza previsto nel canale del rosso.
(FPA-Cherry) = (hoRed_measured – B2) / hoRed_expected - Utilizzare la PA-GFP — costrutto ciliegia per valutare la frazione di fotoattivazione PA-GFP. Determinare l'intensità di fluorescenza previsto di PA-GFP dividendo l'intensità di fluorescenza rossa misurato della PA-GFP — Cherry costruire preventiva di fotoattivazione del rosso-verde-rapporto-(RtoGr). Qui, il RtoGr non deve necessariamente essere corretto per donatore tempra, perché GFP e PA-GFP sono soggetti a tempra per la stessa quantità di donatore.
HoGreen_expected = (hoRed_measured – B2) / RtoGr - Calcolare l'efficienza di fotoattivazione di PA-GFP come una frazione della fotoattivazione di dopo intensità di fluorescenza verde misurato e l'intensità di fluorescenza previsto nel verde del canale.
(FPA-GFP) = (hoGreen_measured – B1) / hoGreen_expected
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Representative Results
Il protocollo presentato qui indica la quantificazione raziometrici della frazione di proteine fluorescenti che sono fotoattivazione di essere fluorescente (Figura 1). Questa frazione differisce secondo la modalità di fotoattivazione.
Un risultato tipico utilizzo breve tempo fotoattivazione ad alta potenza con un laser confocale a scansione microscopio (CLSM) è mostrato in Figura 2C. Dopo titolazione la potenza del laser misurata alla lente dell'obiettivo da pixel dwell tempo e ATOF trasmissione, l'efficienza massima fotoattivazione per PA-GFP è stato di circa l'8% e per PA-Cherry circa il 16%. L'efficienza di fotoattivazione relativamente basso di PA-GFP e PA-ciliegia può essere spiegata dalla fotoattivazione simultanea e - dalla distruzione quando esposti ad un flusso continuo di deterministico di fotoni da CLSM. La più breve durata di fluorescenza e gli spettri di assorbimento differenti, spostato a destra del rosso PA-FPs può contribuire a una maggiore efficienza di fotoattivazione di PA-ciliegia rispetto al PA-GFP.
Utilizzando laser a bassa potenza e centinaia di iterazioni, può essere raggiunto una maggiore efficienza di fotoattivazione. 450 iterazioni di UV-luce trasportata da un CLSM sopra un totale di 4 min ha reso un'efficienza di fotoattivazione del 29% per PA-GFP (Figura 3C). La maggiore efficienza di fotoattivazione con l'esposizione ripetuta ai fotoni di luce UV può suggerire un processo multi-step fotoattivazione. In alternativa, la luce UV applicata è abbastanza forte per photoactivate, ma non abbastanza per photodestruct che conduce cumulativo nel tempo ad un' più alta frazione di proteine fluorescenti fotoattivazione.
Con illuminazione widefield, fluorophores sono esposti, casualmente e in modo ripetitivo, a 405 nm fotoni. Qui, l'esposizione per soli 250 ms ha reso un 29% di efficienza di fotoattivazione per PA-GFP.
Figura 1: concetto di come determinare l'efficienza di fotoattivazione alla rinfusa e in cellule vive. Per accoppiamento spettralmente distinte proteine fluorescenti, governanti interne vengono creati che permettono per la valutazione di base di intensità di raziometrici di fotoattivazione efficienza. Intensità misurata di PA-Cherry e PA-GFP sono stati collegati con intensità previsto. Previsto intensità sono stati derivati da determinare l'intensità di fluorescenza delle proteine fluorescenti sempre attiva nella GFP-Cherry, GFP-PA-Cherry o chimere PA-GFP-Cherry prima fotoattivazione. Figura modificata da Renz e Wunder 201717. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Bulk fotoattivazione di PA-GFP-Cherry (a) e GFP-PA-Cherry (b) come istantaneamente e completamente come possibile utilizzando un microscopio confocale a scansione laser in cellule vive. 8% dei PA-GFP espressa era fotoattivazione con un tempo di permanenza del pixel di 2 μs e una trasmissione AOTF del 38% che risultato potere del laser di 90 μW, come misurato alla lente dell'obiettivo e 3 iterazioni (c). Aumentando la potenza laser 405 nm non ha aumentato l'efficienza di fotoattivazione. Figura modificata da Renz e Wunder 201717. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: iterativo fotoattivazione di bassa potenza con un microscopio confocale a scansione laser (un) e breve widefield ad alta potenza illuminazione (b) resa superiore fotoattivazione efficienza. 29% dei PA-GFP era fotoattivazione con un tempo di permanenza del pixel di 2 μs e una trasmissione di AOTF del 6%, che risultato potere del laser di 40 μW, come misurato alla lente dell'obiettivo e 450 iterazioni (c). Figura modificata da Renz e Wunder 201717. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Finora, nessun metodo ha esistito per determinare in massa la frazione di PA-FPs espressa in cellule vive che è fotoattivazione di essere fluorescente. Il protocollo presentato può essere utilizzato per qualsiasi coppia di proteina fluorescente spettralmente distinta. Mentre esemplificato qui per l'irreversibile PA PA-FPs-GFP e PA-Cherry, questo approccio è in linea di principio applicabile alle proteine fotoconvertibile pure. La proteina fluorescente spettralmente distinta, tuttavia, dovrà essere selezionata con attenzione per minimizzare la sovrapposizione spettrale dato che le proteine fluorescenti fotoconvertibile spostano loro assorbanza e spettri di emissione, per esempio da verde a fluorescenza rossa.
Come indicato in precedenza, è importante affermare che l'approccio presentato è raziometrici e basati su intensità. Può essere utilizzato per standardizzare il livello di espressione sconosciuta nelle celle e definire le differenze relative di fotoattivazione efficienza di diverse modalità di fotoattivazione. Il protocollo può essere utilizzato anche per valutare la frazione assoluta di fotoattivazione PA-FPs. Quindi, diverse proprietà spettrali di FPs diverso bisogno di essere presi in considerazione.
La luminosità molecolare (MB) è il prodotto di rendimento quantico (QY), coefficiente di estinzione (CE) e percentuale assorbanza alla lunghezza d'onda di eccitazione dato riguardante il picco di assorbanza. Per Cherry12 e PA-Cherry13, rispettivi valori di QY e CE sono stati pubblicati. L'assorbanza percentuale alla lunghezza d'onda di eccitazione dato di 543 nm relativa al picco di assorbanza è 0,5 e 0,7, rispettivamente.
MBCherry = 0.22 * 72.000 * 0,5 = 7.920
MB: PA-Cherry = 0,46 * 18.000 * 0,7 = 5.796
Così, la luminosità molecolare inferiore di PA-ciliegia rispetto al Cherry può tener conto dividendo IRed_expected di 1,37 (derivato da 7.920/5.796).
Tuttavia, non è noto a quali condizioni di fotoattivazione pubblicate luminosità molecolare del PA-Cherry è stata determinata. Questo è importante, dal momento che vi mostriamo qui che la frazione misurata di fotoattivazione PA-FPs cambia la modalità di fotoattivazione. Inoltre, per le versioni monomeriche che comprende la mutazione di A206K. cioè, mEGFP e PA-mEGFP, non è stata pubblicata nessuna luminosità molecolare.
In questo approccio basato su intensità raziometrici, la luminosità molecolare del PA-FPs e le controparti sempre su FP in prima approssimazione sono stati considerati identici. Abbiamo deciso su questo approccio, poiché (i) per alcuni FPs non è stata segnalata nessun luminosità molecolare, e (ii) finora è poco chiaro in come lontano diverse modalità di fotoattivazione possono influenzare la luminosità molecolare del PA-FPs segnalati nella letteratura. Inoltre, (iii) per un'analisi comparativa la conoscenza della luminosità molecolare non è necessaria; è necessario solo per la determinazione della base di intensità della frazione assoluta di fotoattivazione PA-FPs che può essere calcolata come indicato sopra.
Il nostro approccio che coinvolge le chimere di proteina fluorescente come righelli interni dimostra che la diversa esposizione alla luce UV produce fotoattivazione diverse efficienze. In tal modo, definisce opzioni come how to photoactivate un più grande PA-FP frazione e ottenere un migliore rapporto segnale-rumore. Inoltre, offre opportunità di differenzialmente photoactivate PA-FPs diversi nella stessa cella data loro risposta differenziale a luce UV o a differenzialmente photoactivate la stessa PA-FP in diversi compartimenti subcellulari esponendolo in modo diverso alla luce UV. In sintesi, il nostro protocollo aiuterà ulteriormente la comprensione quantitativa dei processi cellulari utilizzando PA-FPs nella microscopia di cellule vive.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare il laboratorio Dorigo e il servizio di Imaging di Neuroscienze presso la Stanford University School of Medicine per fornire attrezzature e lo spazio per questo progetto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEGFP-N1 mammalian cell expression vector | Clontech | ||
| DMEM w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Trypsin w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8-well chambers #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 |
References
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