Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול זה כרוך photoactivatable spectrally שונות גנטית בשילוב וחלבונים פלורסנט. אלה היו חלבון פלואורסצנטי היתר כימות של השבר הרשות הפלסטינית-FP זה photoactivated להיות פלורסנט, קרי, את יעילות photoactivation. הפרוטוקול מגלה כי מצבים שונים של photoactivation תשואה היעילות photoactivation שונים.
Abstract
Photoactivatable וחלבונים - להמרה פלורסנט (PA-FPs) שימשו פלורסצנטיות לחיות תאים במיקרוסקופ לניתוח את הדינמיקה של תאים, חלבון הרכבים. עד כה, אין שיטה כבר זמין לכמת בצובר, שידור חי תאי ביטא כמה של הרשות הפלסטינית-FPs הם photoactivated כדי לזרוח.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מעורבים סרגלים הפנימי, קרי, גנטית בשילוב חלבונים פלורסנט ברורים spectrally (photoactivatable), כדי ratiometrically לכמת את השבר של כל הרשות הפלסטינית-FPs הביע בתא אינם כבויים. פלורסנט. באמצעות פרוטוקול זה, נראה כי מצבים שונים של photoactivation הניבו היעילות photoactivation שונים. Photoactivation ובעוצמת קצר עם לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ (CLSM) הביא עד ארבע פעמים photoactivation ליעילות נמוכה יותר מאות חשיפות נמוכה שהוחלו על-ידי CLSM או דופק קצר שהוחלו על-ידי תאורה widefield. בעוד יש כבר ביטוי בפרוטוקול כאן (נולד ב- PA) GFP, (נולד ב- PA) שרי, זה באופן עקרוני ניתן להחיל לכל זוג חלבון פלואורסצנטי נפרדים spectrally של photoactivatable או photoconvertible, כל הגדרת ניסיוני.
Introduction
בשנת 2002, תוארו של photoactivatable בהרחבה ישים הראשון (PA-GFP1), photoconvertible (קאךה2) חלבונים פלורסנט. אלו חלבונים פלורסנט אופטי סימון לשנות תכונות ספקטרליות שלהם על הקרנה עם אור UV, קרי, הם הופכים בהירים (חלבונים פלורסנט photoactivatable, קרי, הרשות הפלסטינית-FPs), או לשנות את צבעם (photoconvertible FPs). עד כה, הפיך ובלתי הפיכה photoactivatable ו- photoconvertible פלורסנט חלבונים שונים כבר פיתח3,4. במחקרים אנסמבל או בכמות גדולה, עטי סימון אופטיים שימשו כדי ללמוד את הדינמיקה של תאים שלמים או חלבונים, הקישוריות של תאים subcellular. יתר על כן, עטי סימון אופטי התומך יחיד מולקולה מבוססת superresolution הדמיה טכניקות כגון PALM5 ו FPALM6.
למרות מעבד צילוםכימי במהלך photoactivation או - המרה תוארו עבור רבים עטי סימון אופטי, אפילו לחקר הגבישים מבנים לפני ואחרי photoactivation / - המרה נעשו זמינים7 , 8, המנגנון הבסיסי שלהפיזי צילום של photoactivation והמרה אינה מובנת לחלוטין. יתר על כן, עד כה הערכות גולמי בלבד קיים ליעילות של photoactivation והמרה, כלומר, השבר של חלבונים פלורסנט הביע זה בעצם photoconverted או photoactivated להיות פלורסנט. מחקרים במבחנה אנסמבל דווחו לכימות המשמרת ב ספקטרום בליעה ואת מידת מקורי ומופעל חלבון10,9,ג'ל11.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מעורבים חלבון פלואורסצנטי כימרות כדי להעריך את השבר של photoactivated פלורסנט חלבונים בכמות גדולה, תאים חיים. בכל פעם עובד עם חלבונים פלורסנט מקודדים גנטית, כמות החלבונים הביע מוחלט משתנה מתא לתא, אינו ידוע. אם תא אחד לבטא של הרשות הפלסטינית-FP מראה אות בהיר יותר לאחר photoactivation מאשר תא אחר, זה לא יכול להיות מבודלים אם האות בהיר הזה הוא ביטוי גבוה יותר של הרשות הפלסטינית-FP או של photoactivation יעיל יותר של הרשות הפלסטינית-FP. כדי לתקנן את רמת הביטוי בתאים, אנחנו מציגים פנימי שליטי גנטית בשילוב חלבונים פלורסנט spectrally נפרדים. זיווגו המידע הגנטי של חלבון פלואורסצנטי photoactivatable spectrally ברורים תמיד בפלורסנט חלבונים, סרגלים פנימי נוצרים זה עדיין יתבטא לסכום הכולל אינו ידוע אך בכמות היחסית קבועים וידועים של ציור אסטרטגיה זו מאפשרת אפיון שונה אור UV photoactivation מזימות, קרי, כמותיים להערכת הכמות היחסית של הרשות הפלסטינית-FPs זה יכול להיות photoactivated עם מצבים שונים של photoactivation, ובכך מאפשרת כדי להגדיר ערכות photoactivation יעילים יותר מאחרים. יתר על כן, אסטרטגיה זו מאפשרת באופן עקרוני את ההערכה של כימות מוחלטת של השבר photoactivated הרשות הפלסטינית-FP. לשם כך, חשוב להבין כי המחקרים שהוצגו אנסמבל הם מבוססי-עוצמת שעושה הניתוח מורכב יותר בהתאם לפריסתו של פרוטוקול זה. פרמטרים לקביעת את עוצמת פלורסנט נמדד, קרי, בהירות מולקולרי שונה, ספיגת, ספקטרום הפליטה ואפקטים סריג, צריכים לקחת בחשבון כאשר משווים עוצמות קרינה פלואורסצנטית של חלבונים שונה פלורסנט.
רציומטרי הציג המבוסס על עוצמת כימות של יעילות photoactivation הוא דוגמה עבור הרשות הפלסטינית-GFP והרשות הפלסטינית-שרי בתאים חיים, אבל הוא ישים באופן כללי עקרוני והוא יכול לשמש עבור כל חלבון פלואורסצנטי photoactivatable בשום תנאי הניסוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. פלסמיד בנייה
- צור שני צבעים פיוז'ן הגששים. השתמש וקטור ביטוי בתרבית של תאים (ראה טבלה של חומרים), אילו mCherry112 , PA-mCherry113 נוספו עם ההגבלה באתרי AgeI ו BsrGI.
- סדר מותאם אישית oligo-נוקלאוטידים כדי להגביר את monomeric וריאציות של eGFP ו- PA-eGFP המכילות את המוטציה A206K, קרי, mEGFP ואת הרשות הפלסטינית-mEGFP14 ללא stop codon בתור קטע סאלי-BamHI . השתמש ומהצמיגים N-מסוף 5'-AAT TAA חטיבתי TCG ACG ATG חברתנו AGC AAG GGC איסור פרסום G 3' ו- C-מסוף פריימר 5'-AAT אתא TGG ATC CCG CTT GTA חטיבתי CTC GTC החתול GC 3' והכנס הזה שבר סאלי-BamHI לתוך האתר שיבוט מרובים של הווקטור הביטוי. פעולה זו תיצור את מקשר חומצת אמינו חמש RNPPV בין חלבון פלואורסצנטי ירוק ואדום. נתייחס כימרות fluorophore כמו GFP – דובדבן, הרשות הפלסטינית-GFP – דובדבן, GFP — הרשות הפלסטינית-שרי למשך שאר מאמר זה.
הערה: את צימוד של fluorophores ויצירה של שליטים פנימי כדי להעריך את יעילות photoactivation ניתן לעשות עם כל זוג fluorophore spectrally שונות, למשל superfolder הרשות הפלסטינית-GFP 15/ PA-TagRFP 16, וכו '. רבים מן החלבונים פלורסנט photoactivatable נגזרות GFP. לפיכך, הרצף פריימר הכלול לעיל ניתן הרבה חלבונים פלורסנט לבנות שימרה fluorophore ב וקטור ביטוי בתרבית של תאים.
2. התא תרבות, תרביות תאים
- השתמש גם קו תא סטנדרטי כלשהו כגון הלה, NRK, כי-7 או קו תא מסוים שישמש עבור ניסויים photoactivation ספציפיים. DMEM (בתוספת 10% סרום שור עוברית, גלוטמין 2 מ מ) ולהשתמש טריפסין ללא פנול אדום (ראה טבלה של חומרים) כדי להפחית את רקע זריחה.
- לנתק את התאים של תרבות confluent עם טריפסין, לספור את מספר התאים ההשעיה התא באמצעות תא נויבאואר, ותאי זרע 5000 – 10,000 לכל טוב. לחלופין, השתמש טיפה 1 מ פיפטה 2-mL של השעיה 10-mL תא מתרבות תא confluent גדל בבקבוקון תרבות 25-תא T או 3 טיפות של השעיה 5-mL תא מתרבות confluent גדל בבקבוקון תרבות 12.5-תא T.
- לגדל תאים בתאי 8-ובכן עם מכסה #1.0 זכוכית (ראה טבלה של חומרים) על ידי קרינה פלואורסצנטית לחיות תאים במיקרוסקופ.
- Transfect תאים 24 שעות לאחר ציפוי שימוש מסחרי ריאגנטים (ראה טבלה של חומרים) לכל הפרוטוקול של מפיצים עם GFP – דובדבן, הרשות הפלסטינית-GFP – דובדבן, GFP — כימרות הרשות הפלסטינית-שרי.
- התמונה תאים לאחר סך של 20 h לפרסם תקנים כדי לאפשר ביטוי חלבון, קיפול של התבגרות.
3. הדמיה ו- Photoactivation
- התמונה תאים בתוך תא humidified ומחוממים סביבתי-37 מעלות צלזיוס. מאגר המדיה הנייד ב- pH פיזיולוגיים, להפוך אותה CO2-עצמאית, להוסיף 20 מ מ HEPES או גז CO2 מוגדר כ- 5% זרימה.
- תמונה ראשונה, התאים לבטא את ה-GFP – לבנות דובדבן. להגדיר פרמטרים המגדירים את עוצמת לייזר משולב-זמן לכל פיקסל תמונת וידאו, קרי, פיקסל להתעכב זמן במיקרו, מסנן tunable אקוסטו אופטי (AOTF) שידור אחוזים, זום דיגיטלי.
הערה: שימוש מטרה 60 x, זום דיגיטלי של 3 x מאפשר הדמיה של תא בשלמותו תוך מתן ההגדלה מספיקות. הגדר פיקסל להתעכב זמן 2-4 μs ושידור AOTF הלייזר 488 ננומטר, 561-nm כך תמונות להראות יחס אות לרעש טוב בלי שום הלבנה, פיקסלים המציין רוויה עוצמת קרינה פלואורסצנטית. - תמונה, באמצעות עוצמת הלייזר קבע, AOTF שידור, זמן להתעכב פיקסל זום דיגיטלי, 15-20 תאים המבטאים GFP – דובדבן.
- לאחר מכן, תמונה עם אותו כוח לייזר קבע, פיקסל להתעכב זמן, שידור AOTF זום דיגיטלי תאים המבטאים GFP – הרשות הפלסטינית-שרי והרשות הפלסטינית-GFP — דובדבן. חיפוש לביטוי תאים ערוץ ירוק או אדום ערוץ, בהתאמה. למנוע חשיפה ארוכה של התאים במהלך החיפוש לביטוי תאים כדי לא להלבין את החלבונים פלורסנט.
- לקבוע סדרה זמן מיני עם תמונה קדם-הפעלה אחת, שלוש תמונות אחר-הפעלה. הדימויים שלאחר הפעלת תסייע לזהות פוטנציאל מצבי כהה ארעי עקב החשיפה לאור-UV.
הערה: בידיים שלנו, שינויים בעוצמת פלורסצנטיות שזוהו עקב הברית כהה ארעי היו < 1% יכול להיות מוזנח, אבל מדינות כהה וצריך להעריך עבור כל הגדרת ניסיוני. - כדי לקבוע יעילות photoactivation, קרי, השבר של הרשות הפלסטינית-FPs אשר פעילה להיות פלורסנט, בניסויים photoactivation ספציפי זה כבר הוקמו, להחיל את אותן הגדרות photoactivation 15-20 תאים זה הם ביטוי השליטים פנימית הציג כאן ולהמשיך עם ניתוח תמונות (סעיף 4). אם להתחיל להגדיר photoactivation ניסויים, למצוא כאן כמה הגדרות שונות בהתבסס על נסיוננו ניסיוני עם הרשות הפלסטינית-GFP, הרשות הפלסטינית-שרי; לשנות לפי הצורך.
- עבור photoactivation מיידי של הרשות הפלסטינית-GFP, הרשות הפלסטינית-שרי באמצעות לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ (CLSM), החל μW 90 של 405 ננומטר לייזר אור ב- 3 או 5 חזרות, בהתאמה.
הערה: עם הגדרת מיקרוסקופיים שלנו, באמצעות שידור AOTM 38% וזמן להתעכב 2 μs פיקסל, מדדנו את הכוח 405 ננומטר לייזר הזה במצב קו-scan בעדשה המטרה. עם הגדרות אלו, כ- 8% ו-16% של הרשות הפלסטינית-GFP, הרשות הפלסטינית-שרי הביע יכול להיות photoactivated יהיה פלורסנט. הסדרה כולה טיטור שימוש CLSM photoactivation מיידי כבר פורסם בעבר17. - אם חלק גבוה יותר של fluorophores הרשות הפלסטינית-GFP, הרשות הפלסטינית-שרי photoactivated הוא יתרון למשל כדי להשיג יחס אות לרעש גבוה יותר, photoactivation לא חייב להיות מיידי, החל μW 40 של 405 ננומטר לייזר אור עם 6% ואינטרנט μs פיקסל להתעכב זמן 2 AOTF שידור עבור 450 חזרות. לאחר מכן, photoactivation תימשך עד 4 דקות ולא רק 1-2 שניות, אך photoactivation יעילות עבור הרשות הפלסטינית-GFP יהיה 29% במקום 8%, המאפשרות יחס אות לרעש גבוה יותר.
- עבור photoactivation מיידי של הרשות הפלסטינית-GFP, הרשות הפלסטינית-שרי באמצעות לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ (CLSM), החל μW 90 של 405 ננומטר לייזר אור ב- 3 או 5 חזרות, בהתאמה.
- אם מערכת תאורה דיגיטלית פסיפס המכילה מראה מיקרו מערכים ב- פני מאפנן אור מרחבי זמין, אור 405 ננומטר לייזר יכול לשמש עבור widefield-photoactivation. דבר זה מאפשר photoactivation יעיל בתוך אלפיות השנייה.
הערה: עם 1.6 מגה-וואט עוצמת הלייזר כפי שנמדד על העדשה מטרה וזמן חשיפה של 250 ms, 29% של הרשות הפלסטינית-GFP ניתן photoactivated להיות פלורסנט. - תמונה עם פרמטרים קבועים photoactivation 15-20 תאים המבטאים הרשות הפלסטינית-GFP – דובדבן ו- GFP – הרשות הפלסטינית-שרי, בהתאמה.
- מאז ה-pH, מינים חמצן תגובתי וגורמים סביבתיים אחרים עשויים להשפיע על יעילות photoactivation, זה עשוי להיות חשוב להעריך את היעילות photoactivation של הרשות הפלסטינית-FPs ב micromilieu subcellular בהתאמה איפה החלבון עניין מלון. על ידי צימוד כימרות fluorophore את החלבון של עניין, כמו המחברים עשו עם קרום פלזמה חלבונים VSVG 18, יעילות photoactivation יכול להיות מוערך בתא subcellular ספציפית עניין.
4. בתמונה ניתוח האלגוריתם על רציומטרי המבוסס על עוצמת כימות של יעילות Photoactivation
- ניתוח תמונות יכול להיעשות עם התמונה קוד פתוח עיבוד פלטפורמות ImageJ או פיג'י. קבע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רקע בתאים שאינם transfected גרין (B1), הערוץ האדום (ב2). להימנע perinuclear או אזורים מציג אוטומטית מוגבר-זריחה.
- כדי לקבוע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית בתא transfected, חלוקה לרמות בגוף התא בעזרת הכלי בחירות חופשיות. שוב, להימנע perinuclear או בתחומים אחרים מציג אוטומטית-זריחה.
- להחסיר את הרקע של עוצמת קרינה פלואורסצנטית שנמדד בכל ערוץ.
אניG = אניGreen_measured – B1
אניR = אניRed_measured – B2 - להשתמש את GFP – לבנות דובדבן כדי לחשב את יחס אדום-כדי-ירוק (RtoGr) ולתקן להרוות תורם עקב העברת האנרגיה של תהודה קרינה פלואורסצנטית (סריג). היעילות סריג E היה נחוש בדעתו להיות 0.3 בניסויים הקודמים עבור GFP – דובדבן לבנות באמצעות את אותו חומצת אמינו מקשר בין שני fluorophores18.
RtoGr = (אניRed_measured – B2) / (אניGreen_measured – B1)
RtoGrקור = RtoGr * (1-E)
הערה: בגישה זו בעוצמה-מבוסס, התורם שכבתה עבור mEGFP ו- PA-mGFP עשוי להיות שונה ניתנה אפשרי תכונות ספקטרליות ברורים אשר לא אפיינו. הקצב של קשת/קשתית (kET) ואת המרחק פרסטר (R0) תלוי התשואה קוונטית של התורם אשר טרם נקבע עבור mEGFP ו- PA-mGFP. - להשתמש את GFP – הרשות הפלסטינית-שרי לבנות כדי להעריך את השבר של photoactivated הרשות הפלסטינית-שרי. לקבוע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית הצפוי של הרשות הפלסטינית-שרי על-ידי הכפלת את עוצמת נמדד פלורסצנטיות ירוק הפצועות GFP-הרשות הפלסטינית-שרי לבנות מוקדמת כדי photoactivation עם המתוקן האדום-כדי-הירוק-היחס (RtoGrקור ).
אניRed_expected = (IGreen_measured – B1) * RtoGrקור
הערה: כפי שצוין לעיל, בהירות המולקולרי תמיד ב- FP, את photoactivatable FP יהיה שונה. לקבלת מידע נוסף כיצד להסביר הבדלים אלה, ראה דיון. - לחשב את היעילות photoactivation הרשות הפלסטינית-שרי כשבר של פלואורסצנטי אדום נמדד בעוצמה photoactivation לאחר לבין עוצמת קרינה פלואורסצנטית הצפוי ב ערוץ הצבע האדום.
(Fהרשות הפלסטינית-שרי) = (אניRed_measured – B2) / אניRed_expected - להשתמש את הרשות הפלסטינית-GFP – לבנות דובדבן כדי להעריך את השבר של photoactivated הרשות הפלסטינית-GFP. לקבוע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית הצפוי של הרשות הפלסטינית-GFP על-ידי חלוקת העוצמה נמדד פלואורסצנטי אדום של הרשות הפלסטינית-GFP – דובדבן לבנות מוקדמת כדי photoactivation על ידי האדום-כדי-הירוק-היחס (RtoGr). . הנה, RtoGr אינו צריך יתוקן עבור התורם שכבתה, כי ה-GFP, הרשות הפלסטינית-GFP כפופים התורם להרוות את אותה כמות.
אניGreen_expected = (אניRed_measured – B2) / RtoGr - לחשב את היעילות photoactivation הרשות הפלסטינית-GFP כשבר של זריחה ירוק נמדד בעוצמה photoactivation לאחר לבין עוצמת קרינה פלואורסצנטית הצפוי לערוץ הצבע הירוק.
(Fהרשות הפלסטינית-GFP) = (אניGreen_measured – B1) / אניGreen_expected
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול המוצגת כאן מראה כימות רציומטרי של השבר של חלבונים פלורסנט כי הם photoactivated להיות פלורסנט (איור 1). שבר זה שונה בהתאם למצב של photoactivation.
תוצאה באמצעות photoactivation ובעוצמת זמן קצר עם לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ (CLSM) מוצג באיור 2 c. לאחר titrating את עוצמת הלייזר כפי שהיא נמדדת בעדשה המטרה פיקסל להתעכב זמן שידור ATOF, יעילות מקסימלית photoactivation הרשות הפלסטינית-GFP היה כ- 8%, עבור הרשות הפלסטינית-שרי כ- 16%. יעילות נמוכה וזהובה photoactivation של הרשות הפלסטינית-GFP, הרשות הפלסטינית-שרי עשויה להיות מוסברת על ידי photoactivation בו זמנית והרס - כאשר הם נחשפים דטרמיניסטי זרם בלתי פוסק של הפוטונים על-ידי CLSM. משך חיים קצר יותר של קרינה פלואורסצנטית, ספקטרום בליעה שונה, נכון-העביר האדום הרשות הפלסטינית-FPs עשוי לתרום היעילות photoactivation גבוהה יותר של הרשות הפלסטינית-שרי בהשוואה להרשות הפלסטינית-GFP.
באמצעות לייזר נמוך עוצמה ומאות חזרות, יעילות גבוהה יותר photoactivation יכולה להיות מושגת. 450 חזרות של אור UV שנמסרו על-ידי CLSM על סך של 4 דקות הניב של היעילות photoactivation של 29% עבור הרשות הפלסטינית-GFP (איור 3 c). יעילות photoactivation גבוהה יותר עם חשיפה חוזרות לפוטונים אור UV יכול להציע תהליך רב שלבי photoactivation. לחלופין, האור האולטרה סגול יישומית היא חזקה מספיק כדי photoactivate אבל לא מספיק כדי photodestruct מה שמוביל מצטברת לאורך זמן חלק גבוה יותר של חלבונים פלורסנט photoactivated.
עם תאורה widefield, fluorophores stochastically, שוב ושוב חשופים פוטונים 405 ננומטר. כאן, חשיפה של רק 250 ms הניב של 29% photoactivation יעילות עבור הרשות הפלסטינית-GFP.
איור 1: תפיסת כיצד לקבוע את יעילות photoactivation בתפזורת, תאים חיים- על ידי צימוד spectrally ברורים חלבונים פלורסנט, הפנימיים שליטים נוצרים אשר מאפשרים להערכה רציומטרי מבוססי בעוצמה של יעילות photoactivation. עוצמות מדודה של הרשות הפלסטינית-שרי, הרשות הפלסטינית-GFP היו קשורות עוצמות הצפוי. עוצמות הצפוי נגזר קביעת עוצמת קרינה פלואורסצנטית תמיד בפלורסנט החלבונים GFP-שרי, GFP-הרשות הפלסטינית-שרי או הרשות הפלסטינית-GFP-שרי כימרות לפני photoactivation. דמות שונה הרבהעל ו-2017 פלא17. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: לרשימת תפוצה photoactivation של הרשות הפלסטינית-GFP-שרי (א) ו- GFP-הרשות הפלסטינית-שרי (ב) גם באופן מיידי, מלא ככל האפשר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר ב תאים חיים- 8% של הרשות הפלסטינית-GFP הביע היה photoactivated עם זמן להתעכב פיקסל של 2 μs ושידור של AOTF של 38% אשר לגרום עוצמת הלייזר של 90 μW, כפי שנמדד על העדשה אובייקטיבי ו- 3 חזרות (c). הגדלת הכוח 405 ננומטר לייזר לא להגביר יעילות photoactivation. דמות שונה הרבהעל ו-2017 פלא17. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: photoactivation איטרטיבי צריכת חשמל נמוכה עם מיקרוסקופ קונפוקלי סריקה בלייזר (a) ו- widefield ובעוצמת קצר תאורה (ב) תשואה גבוהה יותר photoactivation יעילות. 29% של הרשות הפלסטינית-GFP היה photoactivated עם זמן להתעכב פיקסל של 2 μs ושידור של AOTF של 6%, אשר לגרום עוצמת הלייזר של 40 μW, כפי שנמדד העדשה אובייקטיבי, 450 חזרות (c). דמות שונה הרבהעל ו-2017 פלא17. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עד כה, אין שיטה קיימת כדי לקבוע בצובר השבר של הרשות הפלסטינית-FPs לידי ביטוי תאים חיים זה photoactivated להיות פלורסנט. פרוטוקול שהוצגו ניתן לכל זוג חלבון פלואורסצנטי spectrally נפרדים. בעוד ביטוי כאן עבור הפיכה הרשות הפלסטינית-FPs-GFP, הרשות הפלסטינית-שרי, גישה זו היא עקרונית החלים photoconvertible חלבונים גם כן. החלבון הניאון ברורים spectrally, עם זאת, יש לבחור בקפידה כדי למזער חפיפה ספקטרלי בהתחשב בעובדה photoconvertible חלבונים פלורסנט משמרת את ספיגת ואת ספקטרום הפליטה, למשל מירוק כדי פלואורסצנטי אדום.
כמתואר לעיל, זה חשוב לציין הגישה הציג רציומטרי, מבוסס על העוצמה. זה יכול לשמש כדי לתקנן את רמת הביטוי לא ידוע בתאים ולהגדיר היחסי הבדלים photoactivation יעילות על-ידי מצבים שונים של photoactivation. הפרוטוקול יכול לשמש גם כדי להעריך את השבר מוחלטת של photoactivated הרשות הפלסטינית-FPs. . אז, שונה ספקטראליות של FPs שונים צריך להילקח בחשבון.
הבהירות מולקולרית (MB) הוא התוצר של התשואה קוונטית (QY), מקדם הכחדה (EC), שיעור ספיגת-אורך הגל עירור נתון ביחס הפסגה ספיגת. דובדבן12 , הרשות הפלסטינית-שרי13, פורסמו הערכים המתאימים של QY ו- EC. ספיגת אחוז-אורך הגל עירור נתון של 543 יחסית nm שיא ספיגת הוא 0.5, 0.7, בהתאמה.
מגהדובדבן = 0.22 * 72,000$ * 0.5 = 7,920
מגההרשות הפלסטינית-שרי = 0.46 * 18,000 * 0.7 = 5,796
לפיכך, הבהירות מולקולרי נמוך יותר של הרשות הפלסטינית-שרי בהשוואה דובדבן יכול להילקח בחשבון על-ידי חלוקת אניRed_expected על ידי 1.37 (נגזר 7,920/5,796).
עם זאת, לא ידוע ובאילו תנאים photoactivation הבהירות מולקולרית שפורסמו של הרשות הפלסטינית-שרי נקבע. זה חשוב, מכיוון שנראה כאן כי המצב של photoactivation משתנה השבר מדודה של photoactivated הרשות הפלסטינית-FPs. יתר על כן, עבור הגירסאות monomeric המונות את המוטציה A206K. קרי, mEGFP ו- PA-mEGFP, אין בהירות מולקולרית שפורסם.
בגישה זו רציומטרי מבוססי בעוצמה, הבהירות מולקולרית של הרשות הפלסטינית-FPs, את תמיד ב- FP מקבילים הערכה הראשונה הייתה נחשבת זהים. החלטנו על גישה זו, מאז (i) עבור כמה FPs בהירות המולקולרי לא דווחה, וזה (ii) עד כה לא ברור איך רחוק מצבים שונים של photoactivation עלול להשפיע על בהירות מולקולרית של הרשות הפלסטינית-FPs דיווחו בספרות. יתר על כן, (iii) עבור ניתוח השוואתי ידיעת מולקולרי הבהירות אינה הכרחית; זה נחוץ רק מצפני המבוסס על עוצמת השבר מוחלטת של photoactivated הרשות הפלסטינית-FPs אשר ניתן לחשב כמתואר לעיל.
הגישה שלנו מעורבים חלבון פלואורסצנטי כימרות כמו סרגלים פנימי מראה כי חשיפה שונות לאור-UV התשואות היעילות photoactivation שונים. ובכך, הוא מגדיר אפשרויות כיצד שבר photoactivate הרשות הפלסטינית-FP גדול יותר, להשיג יחס אות לרעש טוב יותר. יתר על כן, זה פותח הזדמנויות באופן שונה photoactivate הרשות הפלסטינית-FPs שונים באותו התא ניתנה תגובתם דיפרנציאלית אור UV או באופן שונה photoactivate הרשות הפלסטינית זהה-FP בתאים subcellular שונים על ידי לחשוף אותה אחרת כדי אור UV. לסיכום, פרוטוקול שלנו יעזור בהמשך להבנת תהליכים תאיים באמצעות הרשות הפלסטינית-FPs במיקרוסקופ לחיות תאים כמותית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות המעבדה Dorigo והשירות מדעי המוח הדמיה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת סטנפורד על מתן שטח וציוד עבור פרוייקט זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEGFP-N1 mammalian cell expression vector | Clontech | ||
| DMEM w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Trypsin w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8-well chambers #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 |
References
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Renz, M., Lippincott-Schwartz, J. Ch. 9. The Fluorescent Protein Revolution Series in Cellular and Clinical Imaging. Day, R. N., Davidson, M. W. , CRC Press. 201-228 (2014).
- Shcherbakova, D. M., Sengupta, P., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Photocontrollable fluorescent proteins for superresolution imaging. Annual Review of Biophysics. , 303-329 (2014).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Henderson, J. N., et al. Structure and mechanism of the photoactivatable green fluorescent protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (12), 4176-4177 (2009).
- Subach, F. V., et al. Photoactivation mechanism of PAmCherry based on crystal structures of the protein in the dark and fluorescent states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21097-21102 (2009).
- Wiedenmann, J., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (45), 15905-15910 (2004).
- Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3 (12), e3944 (2008).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature Methods. 6 (2), 153-159 (2009).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Slocum, J. D., Webb, L. J. A Double Decarboxylation in Superfolder Green Fluorescent Protein Leads to High Contrast Photoactivation. Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (13), 2862-2868 (2017).
- Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6481-6491 (2010).
- Renz, M., Wunder, C. Internal rulers to assess fluorescent protein photoactivation efficiency. Cytometry A. , (2017).
- Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), E2989-E2997 (2012).
