כיצד ניתן לכמת את השבר של Photoactivated פלורסנט חלבונים בכמות גדולה, תאים חיים
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול זה כרוך photoactivatable spectrally שונות גנטית בשילוב וחלבונים פלורסנט. אלה היו חלבון פלואורסצנטי היתר כימות של השבר הרשות הפלסטינית-FP זה photoactivated להיות פלורסנט, קרי, את יעילות photoactivation. הפרוטוקול מגלה כי מצבים שונים של photoactivation תשואה היעילות photoactivation שונים.
Abstract
Photoactivatable וחלבונים – להמרה פלורסנט (PA-FPs) שימשו פלורסצנטיות לחיות תאים במיקרוסקופ לניתוח את הדינמיקה של תאים, חלבון הרכבים. עד כה, אין שיטה כבר זמין לכמת בצובר, שידור חי תאי ביטא כמה של הרשות הפלסטינית-FPs הם photoactivated כדי לזרוח.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מעורבים סרגלים הפנימי, קרי, גנטית בשילוב חלבונים פלורסנט ברורים spectrally (photoactivatable), כדי ratiometrically לכמת את השבר של כל הרשות הפלסטינית-FPs הביע בתא אינם כבויים. פלורסנט. באמצעות פרוטוקול זה, נראה כי מצבים שונים של photoactivation הניבו היעילות photoactivation שונים. Photoactivation ובעוצמת קצר עם לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ (CLSM) הביא עד ארבע פעמים photoactivation ליעילות נמוכה יותר מאות חשיפות נמוכה שהוחלו על-ידי CLSM או דופק קצר שהוחלו על-ידי תאורה widefield. בעוד יש כבר ביטוי בפרוטוקול כאן (נולד ב- PA) GFP, (נולד ב- PA) שרי, זה באופן עקרוני ניתן להחיל לכל זוג חלבון פלואורסצנטי נפרדים spectrally של photoactivatable או photoconvertible, כל הגדרת ניסיוני.
Introduction
בשנת 2002, תוארו של photoactivatable בהרחבה ישים הראשון (PA-GFP1), photoconvertible (קאךה2) חלבונים פלורסנט. אלו חלבונים פלורסנט אופטי סימון לשנות תכונות ספקטרליות שלהם על הקרנה עם אור UV, קרי, הם הופכים בהירים (חלבונים פלורסנט photoactivatable, קרי, הרשות הפלסטינית-FPs), או לשנות את צבעם (photoconvertible FPs). עד כה, הפיך ובלתי הפיכה photoactivatable ו- photoconvertible פלורסנט חלבונים שונים כבר פיתח3,4. במחקרים אנסמבל או בכמות גדולה, עטי סימון אופטיים שימשו כדי ללמוד את הדינמיקה של תאים שלמים או חלבונים, הקישוריות של תאים subcellular. יתר על כן, עטי סימון אופטי התומך יחיד מולקולה מבוססת superresolution הדמיה טכניקות כגון PALM5 ו FPALM6.
למרות מעבד צילוםכימי במהלך photoactivation או – המרה תוארו עבור רבים עטי סימון אופטי, אפילו לחקר הגבישים מבנים לפני ואחרי photoactivation / – המרה נעשו זמינים7 , 8, המנגנון הבסיסי שלהפיזי צילום של photoactivation והמרה אינה מובנת לחלוטין. יתר על כן, עד כה הערכות גולמי בלבד קיים ליעילות של photoactivation והמרה, כלומר, השבר של חלבונים פלורסנט הביע זה בעצם photoconverted או photoactivated להיות פלורסנט. מחקרים במבחנה אנסמבל דווחו לכימות המשמרת ב ספקטרום בליעה ואת מידת מקורי ומופעל חלבון10,9,ג’ל11.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מעורבים חלבון פלואורסצנטי כימרות כדי להעריך את השבר של photoactivated פלורסנט חלבונים בכמות גדולה, תאים חיים. בכל פעם עובד עם חלבונים פלורסנט מקודדים גנטית, כמות החלבונים הביע מוחלט משתנה מתא לתא, אינו ידוע. אם תא אחד לבטא של הרשות הפלסטינית-FP מראה אות בהיר יותר לאחר photoactivation מאשר תא אחר, זה לא יכול להיות מבודלים אם האות בהיר הזה הוא ביטוי גבוה יותר של הרשות הפלסטינית-FP או של photoactivation יעיל יותר של הרשות הפלסטינית-FP. כדי לתקנן את רמת הביטוי בתאים, אנחנו מציגים פנימי שליטי גנטית בשילוב חלבונים פלורסנט spectrally נפרדים. זיווגו המידע הגנטי של חלבון פלואורסצנטי photoactivatable spectrally ברורים תמיד בפלורסנט חלבונים, סרגלים פנימי נוצרים זה עדיין יתבטא לסכום הכולל אינו ידוע אך בכמות היחסית קבועים וידועים של ציור אסטרטגיה זו מאפשרת אפיון שונה אור UV photoactivation מזימות, קרי, כמותיים להערכת הכמות היחסית של הרשות הפלסטינית-FPs זה יכול להיות photoactivated עם מצבים שונים של photoactivation, ובכך מאפשרת כדי להגדיר ערכות photoactivation יעילים יותר מאחרים. יתר על כן, אסטרטגיה זו מאפשרת באופן עקרוני את ההערכה של כימות מוחלטת של השבר photoactivated הרשות הפלסטינית-FP. לשם כך, חשוב להבין כי המחקרים שהוצגו אנסמבל הם מבוססי-עוצמת שעושה הניתוח מורכב יותר בהתאם לפריסתו של פרוטוקול זה. פרמטרים לקביעת את עוצמת פלורסנט נמדד, קרי, בהירות מולקולרי שונה, ספיגת, ספקטרום הפליטה ואפקטים סריג, צריכים לקחת בחשבון כאשר משווים עוצמות קרינה פלואורסצנטית של חלבונים שונה פלורסנט.
רציומטרי הציג המבוסס על עוצמת כימות של יעילות photoactivation הוא דוגמה עבור הרשות הפלסטינית-GFP והרשות הפלסטינית-שרי בתאים חיים, אבל הוא ישים באופן כללי עקרוני והוא יכול לשמש עבור כל חלבון פלואורסצנטי photoactivatable בשום תנאי הניסוי.
Protocol
Representative Results
Discussion
עד כה, אין שיטה קיימת כדי לקבוע בצובר השבר של הרשות הפלסטינית-FPs לידי ביטוי תאים חיים זה photoactivated להיות פלורסנט. פרוטוקול שהוצגו ניתן לכל זוג חלבון פלואורסצנטי spectrally נפרדים. בעוד ביטוי כאן עבור הפיכה הרשות הפלסטינית-FPs-GFP, הרשות הפלסטינית-שרי, גישה זו היא עקרונית החלים photoconvertible חלבונים גם כן. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות המעבדה Dorigo והשירות מדעי המוח הדמיה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת סטנפורד על מתן שטח וציוד עבור פרוייקט זה.
Materials
| pEGFP-N1 mammalian cell expression vector | Clontech | ||
| DMEM w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Trypsin w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8-well chambers #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 |
References
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Day, R. N., Davidson, M. W. Ch. 9. The Fluorescent Protein Revolution Series in Cellular and Clinical Imaging. , 201-228 (2014).
- Shcherbakova, D. M., Sengupta, P., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Photocontrollable fluorescent proteins for superresolution imaging. Annual Review of Biophysics. , 303-329 (2014).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Henderson, J. N., et al. Structure and mechanism of the photoactivatable green fluorescent protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (12), 4176-4177 (2009).
- Subach, F. V., et al. Photoactivation mechanism of PAmCherry based on crystal structures of the protein in the dark and fluorescent states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21097-21102 (2009).
- Wiedenmann, J., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (45), 15905-15910 (2004).
- Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3 (12), e3944 (2008).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature Methods. 6 (2), 153-159 (2009).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Slocum, J. D., Webb, L. J. A Double Decarboxylation in Superfolder Green Fluorescent Protein Leads to High Contrast Photoactivation. Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (13), 2862-2868 (2017).
- Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6481-6491 (2010).
- Renz, M., Wunder, C. Internal rulers to assess fluorescent protein photoactivation efficiency. Cytometry A. , (2017).
- Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), E2989-E2997 (2012).
