Aqui, apresentamos um protocolo que envolve photoactivatable espectralmente distinto geneticamente acoplado e proteínas fluorescentes. Estas quimeras de proteína fluorescente permitam a quantificação da fração de PA-FP que é fotoativo ser fluorescente, ou seja, a eficiência de fotoativação. O protocolo revela que diferentes modos de fotoativação produzem photoactivation diferentes eficiências.
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Artigo de método
Como quantificar a fração de proteínas fluorescentes fotoativo a granel e em células vivas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Photoactivatable e - proteínas fluorescentes conversíveis (PA-FPs) têm sido utilizadas em microscopia de fluorescência viver-pilha para analisar a dinâmica das células e conjuntos de proteína. Até agora, nenhum método esteve disponível para quantificar a granel e em vivo células expressaram como muitos dos PA-FPs são fotoativo de fluorescência.
Aqui, apresentamos um protocolo envolvendo governantes internos, ou seja, geneticamente acoplado a proteínas fluorescentes espectralmente distintos (photoactivatable), a ratiometrically quantificar a fração de todos os PA-FPs expresso em uma célula que está ligado ao ser fluorescentes. Usando este protocolo, mostramos que os diferentes modos de fotoativação renderam photoactivation diferentes eficiências. Curto photoactivation de alta potência com um laser confocal microscópio (CLSM) resultou em até quatro vezes menor photoactivation eficiência do que centenas de exposições de baixo nível aplicadas por CLSM ou um pulso curto aplicado por widefield iluminação. Enquanto o protocolo tem sido exemplificado aqui para GFP (PA-) e Cherry (PA-), pode em princípio ser aplicado a qualquer par de proteína fluorescente de photoactivatable ou photoconvertible espectralmente distintas e qualquer montagem experimental.
Introdução
Em 2002, o primeiro photoactivatable amplamente aplicável (PA-GFP1) e photoconvertible (Kaede2) proteínas fluorescentes foram descritas. Estas proteínas fluorescentes marcador óptico alterar suas propriedades espectrais após irradiação com luz UV, ou seja, eles tornam-se brilhantes (proteínas fluorescentes photoactivatable, i.e., PA-FPs), ou alterar sua cor (photoconvertible FPs). Até à data, vários reversíveis e irreversíveis photoactivatable e photoconvertible proteínas fluorescentes foram desenvolvidos3,4. Em estudos de conjunto ou a granel, ....
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Protocolo
1. plasmídeo construção
- Gere a fusão de duas cores sondas. Usar um vetor de expressão de células de mamíferos (ver Tabela de materiais) em que mCherry112 e PA-mCherry113 foram inseridos com a restrição de sites AgeI e BsrGI.
- Ordem personalizada oligo-nucleotídeos para amplificar as variantes monoméricas de eGFP e PA-eGFP contendo a mutação A206K, i.e., mEGFP e PA-mEGFP14 sem um códon de parada como um fragmento BamHI-SalI . Usar o primer do N-terminal 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC mordaça G 3' e o C-terminal da ....
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Resultados
O protocolo aqui apresentado mostra a ratiometric a quantificação da fração de proteínas fluorescentes que são fotoativados ser fluorescente (Figura 1). Esta fração difere dependendo do modo de fotoativação.
Um resultado típico usando pouco tempo photoactivation de alta potência com um laser confocal microscópio (CLSM) é mostrado na Figura 2C. Depois titulada a potência.......
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Discussão
Até agora, nenhum método existia para determinar a granel a fração de PA-FPs expressado em células vivas que é fotoativo ser fluorescente. O protocolo apresentado pode ser usado para qualquer par de proteína fluorescente espectralmente distintas. Enquanto aqui exemplificada para o irreversível FPs PA PA-GFP e PA-cereja, esta abordagem é, em princípio aplicável às proteínas photoconvertible também. A proteína fluorescente espectralmente distinta, no entanto, deve ser selecionada cuidadosamente para minimizar a sobreposiçã.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer o laboratório Dorigo e o serviço de Imaging neurociência na faculdade de medicina da Universidade de Stanford para fornecimento de equipamento e espaço para este projeto.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Vetor de expressão celular de mamíferos pEGFP-N1 | Clontech | ||
| DMEM sem vermelho de fenol | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Tripsina sem vermelho de fenol | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| L-Glutamina (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| Câmaras de 8 poços LabTek #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 |
Referências
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A.
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Reimpressões e permissões
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