Summary
Vi præsenterer her, en protokol, der involverer genetisk koblede spektralt særskilte photoactivatable og fluorescerende proteiner. Disse fluorescerende proteiner kimærer tillade kvantificering af de PA-FP fraktion, der er photoactivated at være fluorescerende, dvs., photoactivation effektivitet. Protokollen afslører, at forskellige former for photoactivation give forskellige photoactivation effektivitet.
Abstract
Photoactivatable og -konvertible fluorescerende proteiner (PA-FPs) har været brugt i fluorescens live-celle mikroskopi til at analysere dynamikken i celler og protein ensembler. Hidtil, ingen metode har været til rådighed til at kvantificere i bulk og i levende celler, hvor mange af PA-FPs udtrykt er photoactivated til fluorescerer.
Her, præsenterer vi en protokol, der involverer interne herskere, dvs, genetisk koblet spektralt særskilt (photoactivatable) fluorescerende proteiner, til ratiometrically kvantificere brøkdel af alle PA-FPs udtrykt i en celle, der er tændt for at være fluorescerende. Bruger denne protokol, viser vi, at forskellige former for photoactivation givet forskellige photoactivation effektivitet. Kort bølgelængde photoactivation med en Konfokal laser scanning mikroskop (CLSM) resulterede i op til fire gange lavere photoactivation effektivitet end hundredvis af low-level engagementer anvendes af CLSM eller en kort puls anvendes af widefield belysning. Mens protokollen har været eksemplificeret her for (PA-) normal god landbrugspraksis og (PA-) kirsebær, kan det i princippet anvendes til ethvert spektralt særskilt photoactivatable eller photoconvertible fluorescerende proteiner par og enhver eksperimentelle set-up.
Introduction
I 2002, var den første store træk gældende photoactivatable (PA-normal god landbrugspraksis1) og photoconvertible (Kaede2) fluorescerende proteiner beskrevet. Disse optiske overstregningstusch fluorescerende proteiner ændrer deres spektrale egenskaber ved bestråling med UV-lys, dvs., de bliver lyse (photoactivatable fluorescerende proteiner, dvs., PA-FPs), eller ændre deres farve (photoconvertible FPs). Til dato har adskillige reversibel og irreversibel photoactivatable og photoconvertible fluorescerende proteiner været udviklet3,4. I ensemble eller bulk undersøgelser, har optisk overstregningstuscher været brugt til at studere dynamikken i hele celler eller proteiner, og tilslutning af subcellulært rum. Derudover baseret optisk overstregningstuscher aktiveret enkelt-molekyle superresolution imaging teknikker som PALM5 og FPALM6.
Selv om fotokemiske processer under photoactivation eller -konvertering er blevet beskrevet for mange optisk overstregningstuscher og endda krystallografiske strukturer før og efter photoactivation / - konvertering er blevet gjort tilgængelig7 , 8, den underliggende fotografifysiske mekanisme photoactivation og - konvertering er ikke helt forstået. Derudover hidtil kun rå estimater findes effektivisering af photoactivation og -konvertering, dvs brøkdel af fluorescerende proteiner udtrykt det er faktisk photoconverted eller photoactivated at være fluorescerende. In vitro ensemble undersøgelser har været rapporteret kvantificere skift i absorptionsspektre og mængden af indfødte og aktiveret protein i en gel9,10,11.
Vi præsenterer her, en protokol, der involverer fluorescerende proteiner kimærer for at vurdere brøkdel af photoactivated fluorescerende proteiner i bulk og i levende celler. Når arbejder med genetisk kodet fluorescerende proteiner, den absolutte mængde af protein udtrykt varierer fra celle til celle og er ukendt. Hvis en celle udtrykker et PA-FP viser en lysere signal efter photoactivation end en anden celle, kan det være differentieret hvis dette lysere signal skyldes højere udtryk for PA-FP eller en mere effektiv photoactivation af PA-FP. For at standardisere udtryk niveau i cellerne, indfører vi interne herskere af genetisk koblede spektralt forskellige fluorescerende proteiner. Af kobling den genetiske information af en photoactivatable fluorescerende proteiner for en spektralt særskilte altid-på fluorescerende proteiner, interne herskere er lavet, vil stadig udtrykkes et ukendt beløb, men i en fast og kendt relative mængde af 1:1. denne strategi giver kvantitative karakterisering af forskellige UV-lys photoactivation ordninger, dvs., vurdering af den relative mængde af PA-FPs, der kan være photoactivated med forskellige former for photoactivation, og dermed tillader at definere photoactivation ordninger, der er mere effektive end andre. Desuden, denne strategi giver i princippet vurdering af den absolutte kvantificering af photoactivated PA-FP brøkdel. Med henblik herpå er det vigtigt at indse, at præsenteres ensemble undersøgelser intensitet-baseret som gør analysen mere kompliceret som fastlagt i denne protokol. Parametre fastlæggelsen af målte fluorescerende intensitet, dvs., forskellige molekylære lysstyrke, absorbans og emission spectra og FRET virkninger, skal overvejes, når man sammenligner fluorescens intensiteter af forskellige fluorescerende proteiner.
Præsenteres ratiometric intensitet-baserede kvantificering af photoactivation effektivitet er eksemplificeret for PA-normal god landbrugspraksis og PA-kirsebær i levende celler, men er i princippet stort set gældende og kan bruges til enhver photoactivatable fluorescerende proteiner under nogen eksperimentelle tilstand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. plasmid konstruktion
- Generere to-farve fusion sonder. Bruge et pattedyr celle udtryk vektor (Se Tabel af materialer) i hvilken mCherry112 og PA-mCherry113 er blevet indsat med begrænsningen websteder, AgeI og BsrGI.
- Bestille brugerdefinerede oligo-nukleotider til at forstærke de monomere varianter af eGFP og PA-eGFP indeholdende A206K mutation, dvs., mEGFP og PA-mEGFP14 uden en stop codon som en SalI-BamHI fragment. Bruge den N-terminale primer 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3' og den C-terminale primer 5'-AAT ATA TGG ATC CCG CTT GTA CAG CTC GTC kat GC 3' og indsæt denne SalI-BamHI fragment i flere kloning stedet for udtryk vektor. Dette vil skabe den fem aminosyre linker RNPPV mellem den grønne og røde fluorescerende proteiner. Vi vil henvise til fluorophore kimærer som normal god landbrugspraksis — Cherry, PA-normal god landbrugspraksis — kirsebær og normal god landbrugspraksis — PA-kirsebær i resten af denne artikel.
Bemærk: Kobling af fluorophores og oprettelse af interne herskere til at vurdere photoactivation effektivitet kan gøres med enhver spektralt særskilte fluorophore par, fx superfolder PA-NGL 15/ PA-TagRFP 16, osv. Mange af de photoactivatable fluorescerende proteiner er afledt af normal god landbrugspraksis. Dermed kan primer sekvensen angivet ovenfor bruges til mange fluorescerende proteiner til at konstruere en fluorophore chimera i et pattedyr celle udtryk vektor.
2. celle kultur og Transfektion
- Brug enten en standard cellelinie som HeLa, NRK, Cos-7 eller en bestemt cellelinje skal bruges til specifikke photoactivation eksperimenter. Brug DMEM (suppleret med 10% føtal bovint serum og 2 mM glutamin) og trypsin uden phenol rød (Se Tabel af materialer) at reducere baggrund fluorescens.
- Frigør cellerne af en sammenflydende kultur med trypsin, tælle antallet af celler i cellesuspension ved hjælp af en Neubauer kammer, og frø 5.000 – 10.000 celler pr godt. Alternativt, bruge 1 dråbe fra et 2-mL pipette af en 10-mL cellesuspension fra en sammenflydende cellekultur dyrket i en T 25-celle kultur kolbe eller 3 dråber fra en 5-mL cellesuspension fra en sammenflydende kultur dyrket i en T 12,5-celle kultur kolbe.
- Vokser celler i 8-godt kamre med #1.0 cover glas (Se Tabel af materialer) til fluorescens live-celle mikroskopi.
- Transfect celler 24 h efter plating ved hjælp af kommercielle reagenser (Se Tabel af materialer) pr. distributer's protokol med normal god landbrugspraksis — Cherry, PA-normal god landbrugspraksis — kirsebær og normal god landbrugspraksis — PA-Cherry kimærer.
- Billede celler efter ialt 20 h post Transfektion til at tillade protein udtryk, folde og modning.
3. billedbehandling og Photoactivation
- Billede celler i en fugtig og opvarmet miljømæssige kammer ved 37 grader Celsius. Buffer celle medier ved fysiologisk pH og gøre det CO2-uafhængig, tilføje 20 mM HEPES, eller brug CO2 gas sat til 5% flow.
- Det første billede celler, der udtrykker normal god landbrugspraksis — kirsebær konstruktion. Angive parametre, der definerer tid-integreret laser intensitet pr. pixel i en Konfokal billede, dvs, pixel dwell tid i mikrosekunder, akustisk-optisk afstemmelige filter (AOTF) transmission i procent, og digital zoom.
Bemærk: Ved hjælp af en 60 x mål og en digital zoom 3 x tillader imaging af en celle i sin helhed samtidig tilstrækkelig forstørrelse. Sat pixel hviletid til 2-4 μs og AOTF transmission for 488 nm og 561-nm laser, således at billeder viser en god signal-støj-forholdet uden hvilken som helst blegning og ingen pixel, der angiver fluorescens intensitet mætning. - Billede, ved hjælp af sæt laser power, AOTF transmission, pixel hviletid og digital zoom, 15-20 celler udtryk for normal god landbrugspraksis — kirsebær.
- Derefter, billede med de samme sæt laser power, pixel hviletid, AOTF transmission og digital zoom celler udtryk for normal god landbrugspraksis — PA-kirsebær og PA-normal god landbrugspraksis — kirsebær. Søgning efter udtryk for celler i den grønne kanal eller røde kanal, henholdsvis. Undgå lange eksponering af cellerne under Søg for at udtrykke celler for at ikke blegemiddel de fluorescerende proteiner.
- Oprette en mini tidsserie med en pre-aktivering billede og tre efter aktivering billeder. Efter aktivering billeder vil hjælpe med at identificere potentielle forbigående mørke stater på grund af eksponering for UV-lys.
Bemærk: I vores hænder, ændringer i registrerede fluorescens intensitet på grund af forbigående mørke stater var < 1% og kunne blive forsømt, men de mørke stater skal vurderes for hver eksperimentelle set-up. - For at afgøre photoactivation effektivitet, dvs brøkdel af PA-FPs, der er tændt for at være fluorescerende, i de specifikke photoactivation eksperimenter, som allerede er blevet etableret, gælder de samme photoactivation indstillinger for 15-20 celler der udtrykker de interne herskere indført her og gå videre med billedanalyse (afsnit 4). Hvis begyndt at oprette photoactivation eksperimenter, finde her et par forskellige indstillinger baseret på vores eksperimentelle erfaringer med PA-normal god landbrugspraksis og PA-kirsebær; ændre efter behov.
- Øjeblikkelige photoactivation af PA-normal god landbrugspraksis og PA-Cherry ved hjælp af en Konfokal laser scanning mikroskop (CLSM), anvende 90 μW af 405-nm laser lys i 3 eller 5 gentagelser, henholdsvis.
Bemærk: Med vores mikroskopiske set-up, ved hjælp af en 38% AOTM transmission og en 2 μs pixel hviletid, vi målte denne 405-nm laser power i line-scan mode på objektive linse. Med disse indstillinger, kan ca. 8% og 16% af PA-normal god landbrugspraksis og PA-Cherry udtrykt være photoactivated at være fluorescerende. Hele titrering serien ved hjælp af CLSM for øjeblikkelige photoactivation har været offentliggjort tidligere17. - Hvis en højere brøkdel af photoactivated PA-normal god landbrugspraksis og PA-Cherry fluorophores er fordelagtige f.eks. at opnå en højere signal / støj-forhold, og photoactivation behøver ikke at være umiddelbar, anvende 40 μW af 405-nm laser lys med en 2 μs pixel hviletid og 6% AOTF transmission for 450 gentagelser. Så photoactivation vil tage op til 4 min i modsætning til kun 1-2 sekunder, men photoactivation effektivitet for PA-normal god landbrugspraksis bliver 29% i stedet for 8%, giver mulighed for en højere signal / støj-forhold.
- Øjeblikkelige photoactivation af PA-normal god landbrugspraksis og PA-Cherry ved hjælp af en Konfokal laser scanning mikroskop (CLSM), anvende 90 μW af 405-nm laser lys i 3 eller 5 gentagelser, henholdsvis.
- Hvis der findes en mosaik digital belysning system, der indeholder mikro-spejl arrays i et rumlige lyset modulator, kan 405-nm laserlys bruges til widefield-photoactivation. Dette giver mulighed for effektiv photoactivation i millisekunder.
Bemærk: Med 1,6 mW laser power målt på objektive linse og en eksponeringstid på 250 ms, 29% af PA-normal god landbrugspraksis kan være photoactivated at være fluorescerende. - Billede med sæt photoactivation parametre 15-20 celler udtrykker PA-normal god landbrugspraksis — kirsebær og normal god landbrugspraksis — PA-kirsebær, henholdsvis.
- Da pH, reaktive ilt arter og andre miljømæssige faktorer kan påvirke photoactivation effektivitet, kan det være vigtigt at vurdere photoactivation effektivitet af PA-FPs i de respektive subcellulært micromilieu hvor protein af interesse er beliggende. Ved at koble fluorophore kimærer til protein af interesse, som forfatterne har gjort med plasma membran protein VSVG 18kan photoactivation effektivitet blive vurderet i specifikke subcellulært rum af interesse.
4. billede analyse og algoritme til Ratiometric intensitet-baserede kvantificering af Photoactivation effektivitet
- Billedanalyse kan gøres med open source billed oparbejdelse platforme ImageJ eller Fiji. Bestemme baggrunden fluorescens intensitet i ikke-transfekteret celler i den grønne (B1) og rød (B2) kanal. Undgå perinuclear eller områder viser øget auto-fluorescens.
- For at bestemme fluorescens intensitet i en transfected celle, skitsere cellen kroppen med værktøjet frihånd valg. Igen, undgå perinuclear eller andre områder viser auto-fluorescens.
- Subtrahere baggrund fra den målte fluorescens intensitet i hver kanal.
JegG = jegGreen_measured -B1
JegR = jegRed_measured – B2 - Bruge normal god landbrugspraksis — kirsebær konstruktion til at beregne rød til grøn ratio (RtoGr) og korrigere for donor-dæmper på grund af fluorescens resonans energioverførsel (FRET). FRET effektivitet E var fast besluttet på at være 0,3 i tidligere forsøg for normal god landbrugspraksis — kirsebær konstruktion ved hjælp af den samme aminosyre linker mellem to fluorophores18.
RtoGr = (jegRed_measured – B2) / (jegGreen_measured -B1)
RtoGrcorr = RtoGr * (1-E)
Bemærk: I denne intensitet-baseret tilgang, donor quenching for mEGFP og PA-mGFP kan være anderledes i betragtning muligt særskilt spektrale egenskaber, som ikke er blevet karakteriseret. Sats af FRET (kET) og Foerster afstand (R0) afhænger kvanteudbytte af donorer, som ikke er bestemt til mEGFP og PA-mGFP. - Bruge normal god landbrugspraksis — PA-Cherry konstruktion til at vurdere brøkdel af photoactivated PA-kirsebær. Bestemme forventede fluorescens-intensiteten af PA-Cherry ved at multiplicere målte unquenched grønne fluorescens-intensiteten af normal god landbrugspraksis — PA-Cherry konstruere forudgående til photoactivation med den korrigerede rød-til-grøn-ratio (RtoGrcorr ).
JegRed_expected = (IGreen_measured – B-1) * RtoGrcorr
Bemærk: Som anført ovenfor altid-på FP og photoactivatable FP molekylære lysstyrke kan være forskellige. Se diskussion for flere oplysninger om, hvordan der tages højde for disse forskelle. - Beregne PA-Cherry photoactivation effektivitet som en brøkdel af den målte røde fluorescens intensitet efter photoactivation og forventede fluorescens-intensiteten i den røde kanal.
(FPA-kirsebær) = (jegRed_measured – B2) / JegRed_expected - Bruge PA-normal god landbrugspraksis — kirsebær konstruktion til at vurdere brøkdel af photoactivated PA-normal god landbrugspraksis. Bestemme forventede fluorescens-intensiteten af PA-normal god landbrugspraksis ved at dividere målte røde fluorescens-intensiteten af PA-normal god landbrugspraksis — Cherry konstruere forudgående til photoactivation af red-til-grøn-forholdet (RtoGr). Her, behøver RtoGr ikke at være korrigeret for donor quenching, fordi normal god landbrugspraksis og PA-normal god landbrugspraksis er underlagt donor dæmper til det samme beløb.
JegGreen_expected = (jegRed_measured – B2) / RtoGr - Beregne PA-NGL photoactivation effektivitet som en brøkdel af den målte grønne fluorescens intensitet efter photoactivation og forventede fluorescens-intensiteten i den grønne kanal.
(FPA-normal god landbrugspraksis) = (jegGreen_measured -B1) / JegGreen_expected
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Viser den protokol, der præsenteres her ratiometric kvantificering af brøkdel af fluorescerende proteiner, der er photoactivated at være fluorescerende (figur 1). Denne fraktion er forskellig afhængigt af tilstanden af photoactivation.
En typisk resultat ved hjælp af kort tid high-power photoactivation med en Konfokal laser scanning mikroskop (CLSM) er vist i figur 2 c. Efter tilsætningen laser power målt på objektive linse af pixel dvæle tid og ATOF transmission, den maksimale photoactivation effektivitet for PA-normal god landbrugspraksis var omkring 8% og for PA-Cherry ca. 16%. PA-normal god landbrugspraksis og PA-Cherry tilsvarende lav photoactivation effektivitet kan forklares ved samtidige photoactivation og -ødelæggelse når de udsættes for en kontinuerlig deterministiske strøm af fotoner af CLSM. De kortere levetid for fluorescens og de forskellige, højre-skiftet absorptionsspektre af røde PA-FPs kan bidrage til højere photoactivation effektiviteten af PA-kirsebær i forhold til PA-normal god landbrugspraksis.
Brug lavt laser power og hundredvis af gentagelser, kan en højere photoactivation effektivitet opnås. 450 gentagelser af UV-lys leveret en CLSM i 4 min i alt givet et photoactivation virkningsgrad på 29% for PA-normal god landbrugspraksis (figur 3 c). Den højere photoactivation effektivitet med gentagne eksponering for UV-lys fotoner kan foreslå en multi-step photoactivation proces. Alternativt, den anvendte UV-lys er stærk nok til at photoactivate, men ikke nok til at photodestruct, som fører kumulative over tid til en højere brøkdel af photoactivated fluorescerende proteiner.
Med widefield belysning, er fluorophores stochastically og gentagne gange udsat for 405 nm fotoner. Her, givet eksponering for kun 250 ms en 29% photoactivation effektivitet for PA-normal god landbrugspraksis.
Figur 1: begreb om hvordan du kan afgøre photoactivation effektivitet i bulk og i levende celler. Ved at koble spektralt forskellige fluorescerende proteiner, oprettes interne herskere, som gør det muligt for ratiometric intensitet-baseret vurdering af photoactivation effektivitet. Målte intensitet af PA-kirsebær og PA-normal god landbrugspraksis var relateret til forventede intensiteter. Forventede intensitet blev afledt fra bestemmelse af fluorescens-intensiteten af de altid-på fluorescerende proteiner i normal god landbrugspraksis-kirsebær, normal god landbrugspraksis-PA-kirsebær eller PA-normal god landbrugspraksis-Cherry kimærer forud for photoactivation. Figur ændres fra Renz og Wunder 201717. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Bulk photoactivation af PA-normal god landbrugspraksis-kirsebær (en) og normal god landbrugspraksis-PA-kirsebær (b) som øjeblikkeligt og fuldstændigt som muligt ved hjælp af en Konfokal laser-scanning mikroskop i levende celler. 8% af PA-NGL udtrykt var photoactivated med en pixel hviletiden af 2 μs og en AOTF transmission på 38%, hvilket resultere i laser power af 90 μW, målt på objektive linse og 3 gentagelser (c). Stigende 405-nm laser power ikke øge photoactivation effektivitet. Figur ændres fra Renz og Wunder 201717. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: iterativ energibesparende photoactivation med et Konfokal mikroskop for laser-scanning (a) og kort bølgelængde widefield belysning b udbytte højere photoactivation effektivitetsfordele. 29% af PA-normal god landbrugspraksis var photoactivated med en pixel hviletiden af 2 μs og en AOTF transmission med 6%, hvilket resultere i laser power af 40 μW, målt på objektive linse og 450 gentagelser (c). Figur ændres fra Renz og Wunder 201717. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hidtil, eksisterede ingen metode til at bestemme i løs vægt brøkdel af PA-FPs udtrykt i levende celler, der er photoactivated at være fluorescerende. Den præsenterede protokol kan bruges til ethvert spektralt forskellige fluorescerende proteiner par. Mens eksemplificeret her for den uigenkaldelige PA-FPs PA-normal god landbrugspraksis og PA-kirsebær, er denne fremgangsmåde i princippet gældende til photoconvertible proteiner samt. Den spektralt forskellige fluorescerende proteiner, men skal vælges omhyggeligt at minimere spektrale overlapning, eftersom photoconvertible fluorescerende proteiner flytte deres absorbans og emission spektre, fx fra grøn til rød fluorescens.
Som skitseret ovenfor, er det vigtigt at den præsenterede tilgang er ratiometric og intensitet-baseret. Det kan bruges til at standardisere ukendt udtryk niveau i celler og definere relative forskelle i photoactivation effektiviteten af forskellige former for photoactivation. Protokollen kan også bruges til at vurdere den absolutte brøkdel af photoactivated PA-FPs. Derefter, forskellige spektrale egenskaber af forskellige FPs skal tages i betragtning.
Den molekylære lysstyrke (MB) er et produkt af kvanteudbytte (QY), extinction koefficient (EF) og procent absorbans ved given excitation bølgelængde i forhold til absorbans peak. For kirsebær12 og PA-Cherry13, er respektive værdier af QY og EF blevet offentliggjort. Den procentvise absorbans ved given excitation boelgelaengden 543 nm i forhold til absorbans peak er 0,5 og 0,7, henholdsvis.
MBCherry = 0,22 * 72.000 * 0,5 = 7,920
MBPA-Cherry = 0,46 * 18.000 * 0,7 = 5,796
Således kan lavere molekylære lysstyrken af PA-kirsebær i forhold til Cherry tages i betragtning ved at dividere jegRed_expected af 1,37 (afledt af 7,920/5,796).
Men det er ukendt under hvilke photoactivation betingelser PA-Cherry offentliggjorte molekylære lysstyrke er fastslået. Det er vigtigt, eftersom vi viser her, at tilstanden af photoactivation ændrer den målte brøkdel af photoactivated PA-FPs. Endvidere for de monomere versioner bestående af A206K-mutationen. dvs., mEGFP og PA-mEGFP, ingen molekylære lysstyrke er blevet offentliggjort.
I denne ratiometric intensitet-baseret tilgang, Molekylær lysstyrken af PA-FPs og altid-på FP modparter i en første tilnærmelse har været betragtet som identiske. Vi besluttede på denne tilgang, da (i) for nogle FPs ingen molekylære lysstyrke er blevet rapporteret, og (ii) det er indtil videre uklart i hvor langt forskellige former for photoactivation kan påvirke den molekylære lysstyrke af PA-FPs rapporteret i litteraturen. Desuden, (iii) for en sammenlignende analyse viden om Molekylær lysstyrken ikke er nødvendig; Det er kun nødvendigt for intensitet-baserede bestemmelse af den absolutte brøkdel af photoactivated PA-FPs, som kan beregnes som vist ovenfor.
Vores tilgang, der involverer fluorescerende proteiner kimærer som interne herskere viser, at forskellige eksponering for UV-lys giver forskellige photoactivation effektivitet. Dermed, det definerer indstillinger som sådan photoactivate en større PA-FP brøkdel og opnå en bedre signal / støj-forhold. Desuden, det åbner muligheder for varierende photoactivate forskellige PA-FPs i den samme celle givet deres differentieret svar til UV-lys eller varierende photoactivate den samme PA-FP i forskellige subcellulært rum ved at udsætte det forskelligt til UV-lys. I Resumé, vil vores protokol bidrage yderligere til kvantitativ forståelse af cellulære processer ved hjælp af PA-FPs i live-celle mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Dorigo laboratorium og neurovidenskab Imaging Service på Stanford University School of Medicine for at levere udstyr og plads til dette projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEGFP-N1 mammalian cell expression vector | Clontech | ||
| DMEM w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Trypsin w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8-well chambers #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 |
References
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Renz, M., Lippincott-Schwartz, J. Ch. 9. The Fluorescent Protein Revolution Series in Cellular and Clinical Imaging. Day, R. N., Davidson, M. W. , CRC Press. 201-228 (2014).
- Shcherbakova, D. M., Sengupta, P., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Photocontrollable fluorescent proteins for superresolution imaging. Annual Review of Biophysics. , 303-329 (2014).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Henderson, J. N., et al. Structure and mechanism of the photoactivatable green fluorescent protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (12), 4176-4177 (2009).
- Subach, F. V., et al. Photoactivation mechanism of PAmCherry based on crystal structures of the protein in the dark and fluorescent states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21097-21102 (2009).
- Wiedenmann, J., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (45), 15905-15910 (2004).
- Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3 (12), e3944 (2008).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature Methods. 6 (2), 153-159 (2009).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Slocum, J. D., Webb, L. J. A Double Decarboxylation in Superfolder Green Fluorescent Protein Leads to High Contrast Photoactivation. Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (13), 2862-2868 (2017).
- Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6481-6491 (2010).
- Renz, M., Wunder, C. Internal rulers to assess fluorescent protein photoactivation efficiency. Cytometry A. , (2017).
- Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), E2989-E2997 (2012).
