Summary
Här presenterar vi ett protokoll som innebär att genetiskt kopplade spektralt distinkta photoactivatable och fluorescerande proteiner. Dessa fluorescerande protein chimärer möjliggöra kvantifiering av den PA-FP-fraktionen som är photoactivated att vara fluorescerande, dvs ljusaktivering effektivitet. Protokollet visar att olika lägen av ljusaktivering ger olika ljusaktivering effektivitetsvinster.
Abstract
Photoactivatable och -konvertibla fluorescerande proteiner (PA-FPs) har använts i fluorescensmikroskopi live-cell för att analysera dynamiken i celler och protein ensembler. Hittills har ingen metod har funnits tillgänglig att kvantifiera i bulk och i levande celler hur många av PA-FPs uttryckt är photoactivated till fluorescerar.
Här presenterar vi ett protokoll som omfattar interna linjaler, dvs genetiskt kopplad spektralt distinkta (photoactivatable) fluorescerande proteiner, till ratiometrically kvantifiera fraktionen av alla PA-FPs uttryckt i en cell som är påslagen för att vara fluorescerande. Användning av detta protokoll, visar vi att olika lägen av ljusaktivering gav olika ljusaktivering effektivitetsvinster. Kort high-power ljusaktivering med en confocal laser skanning Mikroskop (CLSM) resulterade i upp till fyra gånger lägre ljusaktivering effektivitet än hundratals lågaktivt exponeringar tillämpas av CLSM eller en kort puls som tillämpas av widefield belysning. Medan protokollet har exemplifierats här för god Jordbrukarsed (PA-) och (PA-) körsbär, kan det i princip tillämpas på alla spektralt distinkta photoactivatable eller photoconvertible fluorescerande protein par och några experimentella set-up.
Introduction
I 2002 beskrevs de första allmänt tillämpliga photoactivatable (PA-GFP1) och photoconvertible (Kaede2) fluorescerande proteiner. Dessa optiska highlighter fluorescerande proteiner ändra deras spektrala egenskaper vid bestrålning med UV-ljus, dvs de blir ljusa (photoactivatable fluorescerande proteiner, dvs PA-FPs), eller ändra deras färg (photoconvertible FPs). Hittills har flera reversibla och irreversibla photoactivatable och photoconvertible fluorescerande proteiner varit utvecklade3,4. I ensemble eller bulk studier, har optisk överstrykningspennor använts för att studera dynamiken i hela celler eller proteiner och anslutning av subcellulär fack. Dessutom baserade optisk överstrykningspennor aktiverat singel-molekyl superresolution imaging tekniker såsom PALM5 och FPALM6.
Även om den fotokemisken processer under ljusaktivering eller -konvertering har beskrivits för många optiska överstrykningspennor och även kristallografiska strukturer före och efter ljusaktivering / - konvertering har gjorts tillgänglig7 , 8, Foto underliggandefysiska mekanismen av ljusaktivering och -konvertering är inte helt klarlagda. Dessutom hittills bara grova uppskattningar finns av effektiviteten av ljusaktivering och -konvertering, d.v.s. fraktionen av fluorescerande proteiner uttryckt det är faktiskt photoconverted eller photoactivated vara fluorescerande. In vitro ensemble studier rapporterats kvantifiera förskjutningen i Absorptionsspektra och mängden native och aktiverad protein i en gel9,10,11.
Här presenterar vi ett protokoll som omfattar fluorescerande protein chimärer för att bedöma fraktionen av photoactivated fluorescerande proteiner i bulk och i levande celler. När arbetar med genetiskt kodade fluorescerande proteiner, den absoluta mängden protein uttryckt varierar från cell till cell och är okänd. Om en cell att uttrycka en PA-FP visar en ljusare signal efter ljusaktivering än en annan cell, det kan inte göras åtskillnad mellan om denna ljusare signal beror på högre uttryck för PA-FP eller en effektivare ljusaktivering av PA-FP. För att standardisera uttryck nivån i cellerna, införa vi interna linjaler av genetiskt kopplade spektralt distinkta fluorescerande proteiner. Av koppling den genetiska informationen av en photoactivatable fluorescerande protein ett spektralt distinkta alltid-på fluorescerande proteiner, inre linjaler skapas som fortfarande uttrycks på en okänd totala men i en fast och kända relativa mängd 1: 1 denna strategi möjliggör kvantitativa karakterisering av olika UV-ljus ljusaktivering system, dvs bedömning av den relativa mängden PA-FPs som kan vara photoactivated med olika lägen av ljusaktivering och därmed tillåter att definiera ljusaktivering system som är mer effektiva än andra. Dessutom tillåter denna strategi i princip bedömningen av absolut kvantifiering av den photoactivated PA-FP-fraktionen. Därför är det viktigt att inse att studierna som presenteras ensemble är intensitet-baserade vilket gör analysen mer komplex som fastställs i detta protokoll. Parametrar för att fastställa den uppmätta fluorescerande intensitet, dvs olika molekylära ljusstyrka, absorbans och utsläpp spectra och bandet effekter, måste beaktas när man jämför fluorescens intensiteter av olika fluorescerande proteiner.
Presenterade proportionerlig stödnivå-baserade kvantifiering av ljusaktivering effektivitet exemplifieras för PA-GFP och PA-Cherry i levande celler, men i princip är allmänt tillämpliga och kan användas för alla photoactivatable fluorescerande protein under någon experimentella villkor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. plasmid konstruktion
- Generera två färger fusion sonder. Använda en däggdjursceller uttryck vektor (se Tabell för material) i vilken mCherry112 och PA-mCherry113 har infogats med begränsningen webbplatser AgeI och BsrGI.
- Beställ anpassade oligo-nukleotider att förstärka de monomer varianterna av andra och PA-andra som innehåller A206K mutation, dvs mEGFP och PA-mEGFP14 utan ett stop-kodon som ett SalI-BamHI fragment. Använd den N-terminala primern 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3' och C-terminal primer 5'-AAT ATA TGG ATC CCG CTT GTA CAG CTC GTC katt GC 3' och infoga detta SalI-BamHI fragment i flera kloning platsen av vektorn som uttryck. Detta kommer att skapa fem aminosyra länkaren RNPPV mellan grön och röd fluorescerande proteinet. Vi kommer hänvisa till de fluorophore chimärer som GFP — körsbär, PA-GFP — Cherry och god Jordbrukarsed — PA-Cherry för resten av denna artikel.
Obs: Kopplingen av fluorophores och skapandet av interna linjaler att bedöma ljusaktivering effektivitet kan göras med någon spektralt distinkta fluorophore par, e.g. superfolder PA-GFP 15/ PA-TagRFP 16, osv Många av de photoactivatable fluorescerande proteinerna härleds från GFP. Sekvensen primer som anges ovan kan därför användas för många fluorescerande proteiner för att konstruera en fluorophore chimär i en däggdjursceller uttryck vektor.
2. cell kultur och Transfection
- Använd antingen någon standard cellinje såsom HeLa, NRK, Cos-7 eller en specifik cell linje som ska användas för specifika ljusaktivering experiment. Använda DMEM (kompletteras med 10% fetalt bovint serum och 2 mM glutamin) och trypsin utan fenolrött (se Tabell för material) för att minska bakgrunden fluorescens.
- Lossa cellerna i en konfluenta kultur med trypsin, räkna antalet celler i cellsuspension med hjälp av en Neubauer kammare och utsäde 5 000 – 10 000 celler per brunn. Alternativt, Använd 1 droppe från 2 mL pipett i en 10 mL cellsuspension från en konfluenta cellkultur vuxit i en T 25-cellkultur kolv eller 3 droppar från en 5 mL cellsuspension från en konfluenta kultur som odlas i en T 12,5-cellkultur kolv.
- Odla cellerna i 8-väl avdelningar med #1.0 luckan glas (se Tabell för material) för live-cell fluorescensmikroskopi.
- Transfect celler 24 h efter plätering med kommersiella reagens (se Tabell för material) per distributörens protokoll med GFP — körsbär, PA-GFP — Cherry och god Jordbrukarsed — PA-Cherry chimärer.
- Bildcellerna efter totalt 20 h post transfection att möjliggöra proteinuttryck, vikning och mognad.
3. imaging och ljusaktivering
- Bildcellerna i en fuktad och uppvärmd miljökammare på 37 grader Celsius. Att buffra cell media vid Fysiologiskt pH och återge det CO2-oberoende, lägga 20 mM HEPES, eller använda CO2 gas inställd på 5% flöde.
- Första, bilden celler som uttrycker GFP — Cherry konstruktion. Ställa in parametrar som definierar tid-integrerad laser intensitet per pixel i en confocal bild, dvs pixel uppehållstid i mikrosekunder, acousto-optisk avstämbara filter (AOTF) överföring i procent, och digital zoom.
Obs: Med hjälp av en 60 x-objektiv och en digital zoom 3 x tillåter avbildning av en cell i sin helhet samtidigt som den ger tillräcklig förstoring. Ställ in pixel dröjtiden 2-4 μs och AOTF transmission för 488-nm och 561-nm laser så att bilderna visar en bra signal-brus-förhållande utan någon blekning och inga pixlar som anger fluorescens intensitet mättnad. - Bild, använder set lasereffekt, AOTF transmission, pixel dröjtiden och digital zoom, 15-20 celler som uttrycker GFP — Cherry.
- Sedan bild med samma uppsättning lasereffekt, pixel dröjtiden, AOTF överföring och digital zoom-celler som uttrycker GFP — PA-körsbär och PA-GFP — Cherry. Sök för att uttrycka celler i den gröna kanalen eller röda kanalen, respektive. Undvik lång exponering av celler under sökningen för att uttrycka celler för att inte bleka de fluorescerande proteinerna.
- Ställa in en mini tidsserie med en pre-aktivering bild och tre efter aktiveringen bilder. Efter aktivering bilderna kommer att hjälpa till att identifiera potentiella övergående mörka stater på grund av exponering för UV-ljus.
Obs: I våra händer, förändringar i upptäckta fluorescensintensiteten på grund av övergående mörka stater var < 1% och kan försummas, men de mörka staterna bör bedömas för varje experimental set-up. - För att avgöra ljusaktivering effektivitet, dvs fraktionen av PA-FPs som är påslagen för att vara fluorescerande, i särskilda ljusaktivering experimenten som redan fastställts, gäller samma ljusaktivering inställningar till 15-20 celler som uttrycker de interna styrande införs här och fortsätta med bildanalys (avsnitt 4). Om börjat ställa in ljusaktivering experiment, här hittar du några olika inställningar utifrån våra experimentella erfarenheter PA-GFP och PA-körsbär; ändra efter behov.
- För momentana ljusaktivering av PA-GFP och PA-körsbär med en confocal laser skanning Mikroskop (CLSM), tillämpas 90 μW 405-nm Laser ljus i 3 eller 5 iterationer, respektive.
Obs: Med våra mikroskopiska set-up, använder en 38% AOTM växellåda och en 2 μs pixel dröjtiden, Vi mätte detta 405-nm laser power i linjeavsökning läge på objektivet. Med dessa inställningar kan ca 8% och 16% av PA-GFP och PA-Cherry uttryckt photoactivated vara fluorescerande. Hela titrering serien använder CLSM för momentana ljusaktivering har varit publicerade tidigare17. - Om en högre andel av photoactivated PA-GFP och PA-Cherry fluorophores är fördelaktiga t.ex. att uppnå en högre signal-brus-förhållande och ljusaktivering behöver inte vara omedelbar, tillämpa 40 μW 405-nm Laser ljus med 2 μs pixel dröjtiden och 6% AOTF transmission för 450 iterationer. Sedan ljusaktivering tar upp till 4 min i motsats till endast 1-2 sekunder, men ljusaktivering effektivitet för PA-GFP blir 29% istället för 8%, vilket möjliggör en högre signal-brus-förhållande.
- För momentana ljusaktivering av PA-GFP och PA-körsbär med en confocal laser skanning Mikroskop (CLSM), tillämpas 90 μW 405-nm Laser ljus i 3 eller 5 iterationer, respektive.
- Om det finns en mosaik digital belysning system som innehåller mikro spegel arrayer i en spatial light modulator kan 405-nm laserljus användas för widefield-ljusaktivering. Detta möjliggör effektiv ljusaktivering inom millisekunder.
Obs: Med 1,6 mW laser kraft mätt på objektivet och en exponeringstid av 250 ms, 29% av PA-GFP kan vara photoactivated att vara fluorescerande. - Bild med några set ljusaktivering parametrar 15-20 celler som uttrycker PA-GFP — Cherry och god Jordbrukarsed — PA-Cherry, respektive.
- Eftersom pH, reaktiva syreradikaler och andra miljöfaktorer kan påverka ljusaktivering effektivitet, kan det vara viktigt att bedöma ljusaktivering effektivitetsvinsterna av PA-FPs i de respektive subcellulär micromilieu där proteinet av intresse är ligger. Av koppling de fluorophore chimärer att proteinet av intresse, som författarna har gjort med plasmamembranet protein VSVG 18, kan ljusaktivering effektivitet bedömas i den specifika subcellulära facket av intresse.
4. bild analys och algoritmen för proportionerlig stödnivå-baserade kvantifiering av ljusaktivering effektivitet
- Bildanalys kan göras med öppen källkod bildbehandling plattformar ImageJ eller Fiji. Fastställa bakgrunden fluorescensintensiteten i icke-transfekterade celler i grön (B1) och röd (B2) kanal. Undvika perinukleära eller några områden som visar ökad auto-fluorescens.
- För att avgöra fluorescensintensiteten i en transfekterade cell, disposition cellkroppen med freehand urvalsverktyget. Återigen, undvika perinukleära eller några andra områden visar auto-fluorescens.
- Subtrahera bakgrunden från uppmätta fluorescensintensiteten i varje kanal.
JagG = jagGreen_measured – B1
JagR = jagRed_measured – B2 - Använd GFP — Cherry konstruera att beräkna rödgröna till förhållandet (RtoGr) och korrigera för givare-kylning på grund av fluorescens resonans energiöverföringen (bandet). FRET effektivitet E fastställdes vara 0,3 i tidigare experiment för GFP — Cherry konstruera använder samma aminosyra länkaren mellan de två fluorophores18.
RtoGr = (jagRed_measured – B2) / (jagGreen_measured – B1)
RtoGrcorr = RtoGr * (1 – E)
Obs: I denna intensitet-baserat tillvägagångssätt, givare kylning för mEGFP och PA-mGFP kan vara olika med tanke på eventuella distinkta spektrala egenskaper som inte har karaktäriserats. Graden av bandet (kET) och Foerster avståndet (R0) beror på quantum avkastningen av givare som inte har fastställts för mEGFP och PA-mGFP. - Använd GFP — PA-Cherry konstruera att bedöma fraktionen av photoactivated PA-Cherry. Fastställa beräknade fluorescensintensiteten hos PA-Cherry multipliceras uppmätta OSLÄCKT grön fluorescensintensiteten hos GFP — PA-Cherry konstruera tidigare ljusaktivering med den korrigerade röd-till-grön-ratio (RtoGrcorr ).
JagRed_expected = (IGreen_measured – B1) * RtoGrcorr
Obs: Som ovan anges alltid på FP och photoactivatable FP molekylär ljusstyrka kan vara olika. Se diskussion för mer information om hur att ta hänsyn till dessa skillnader. - Beräkna PA-Cherry ljusaktivering effektiviteten som en bråkdel av uppmätta röd fluorescens intensitet efter ljusaktivering och förväntade fluorescensintensiteten i den röda kanalen.
(FPA-Cherry) = (jagRed_measured – B2) / jagRed_expected - Använd den PA-GFP — Cherry konstruera att bedöma fraktionen av photoactivated PA-GFP. Fastställa beräknade fluorescensintensiteten hos PA-GFP genom att dividera de uppmätta röd fluorescensintensiteten hos den PA-GFP — Cherry konstruera tidigare ljusaktivering av röd-till-grön-förhållandet (RtoGr). Här, behöver i RtoGr inte korrigeras för givare snabbkylning, eftersom god Jordbrukarsed och PA-GFP är föremål för givare som kylning till samma belopp.
JagGreen_expected = (jagRed_measured – B2) / RtoGr - Beräkna PA-GFP ljusaktivering effektiviteten som en bråkdel av uppmätta grön fluorescens intensitet efter ljusaktivering och förväntade fluorescensintensiteten i den gröna kanalen.
(FPA-GFP) = (jagGreen_measured – B1) / jagGreen_expected
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det protokoll som presenteras här visar proportionerlig kvantifiering av fraktionen av fluorescerande proteiner som är photoactivated att vara fluorescerande (figur 1). Denna fraktion skiljer sig beroende på funktionsläget av ljusaktivering.
Ett typiskt resultat med kort tid high-power ljusaktivering med en confocal laser skanning Mikroskop (CLSM) visas i figur 2 c. Efter titrering laser kraften mätt på objektivet som pixel uppehålla mig tid och ATOF överföring, maximal ljusaktivering effektiviteten för PA-GFP var ca 8% och för PA-Cherry om 16%. PA-GFP och PA-Cherry comparably låg ljusaktivering energieffektivitet kan förklaras av samtidiga ljusaktivering och -förstörelse när de utsätts för en kontinuerlig deterministiska ström av fotoner av CLSM. De kortare fluorescens livstiderna och de olika, höger-skiftat Absorberingsspectra av röda PA-FPs kan bidra till högre ljusaktivering effektiviteten i PA-Cherry jämfört med PA-GFP.
Använda låg lasereffekt och hundratals iterationer, kan en högre ljusaktivering effektivitet uppnås. 450 iterationer av UV-ljus som en CLSM levererat under totalt 4 min gav en ljusaktivering verkningsgrad på 29% för PA-GFP (figur 3 c). Den högre ljusaktivering effektiviteten med upprepad exponering för UV-ljus fotoner kan föreslå en flerstegs ljusaktivering process. Alternativt, tillämpad UV-ljuset är tillräckligt stark för att photoactivate men inte tillräckligt för att photodestruct som leder kumulativa över tiden till en högre andel av photoactivated fluorescerande proteiner.
Med widefield belysning utsätts fluorophores stochastically och upprepande för 405-nm fotoner. Här, gav exponering för bara 250 ms en 29% ljusaktivering effektivitet för PA-GFP.
Figur 1: begreppet avgöra ljusaktivering effektivitet i bulk och i levande celler. Av koppling spektralt distinkta fluorescerande proteiner, skapas inre linjaler som gör det möjligt för proportionerlig stödnivå-baserad bedömning av ljusaktivering effektivitet. Uppmätta intensiteter av PA-körsbär och PA-GFP var relaterade till beräknade stödnivåerna. Beräknade stödnivåerna härleddes från att fastställa fluorescensintensiteten hos de alltid-på fluorescerande proteinerna i GFP-Cherry, GFP-PA-Cherry eller PA-GFP-Cherry chimärer före ljusaktivering. Figur modifierad från Renz och Wunder 201717. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Bulk ljusaktivering av PA-GFP-körsbär (a) och GFP-PA-körsbär (b) som omedelbart och fullständigt som möjligt med confocal laserskanning Mikroskop i levande celler. 8% av PA-GFP uttryckt var photoactivated med en pixel uppehållstid av 2 μs och en AOTF överföring av 38% vilket resultera i lasereffekt av 90 μW, mätt på objektivet och 3 iterationer (c). Öka 405-nm laser makt ökade inte ljusaktivering effektivitet. Figur modifierad från Renz och Wunder 201717. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: iterativa lågenergi-ljusaktivering med confocal laserskanning Mikroskop (a) och kort high-power widefield belysning (b) avkastning högre ljusaktivering effektivitet. 29% av PA-GFP var photoactivated med en pixel uppehållstid av 2 μs och en AOTF överföring av 6%, vilket resultera i lasereffekt av 40 μW, mätt på objektivet och 450 iterationer (c). Figur modifierad från Renz och Wunder 201717. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hittills fanns ingen metod för att bestämma i bulk fraktionen av PA-FPs uttryckt i levande celler som är photoactivated att vara fluorescerande. Presenterade protokollet kan användas för spektralt distinkta fluorescerande protein två. Medan exemplifieras här för den oåterkalleliga PA-FPs PA-GFP och PA-Cherry, är detta tillvägagångssätt i princip tillämplig på photoconvertible proteiner också. Spektralt distinkta fluorescerande proteinet, dock måste väljas noggrant att minimera spektrala överlappning med tanke på att photoconvertible fluorescerande proteiner skifta sin absorbans och utsläpp spectra, e.g. från grön till röd fluorescens.
Enligt ovan, är det viktigt att konstatera att den presenterade metoden är proportionerlig och intensitet-baserade. Det kan användas att standardisera den okända uttryck nivån i celler och definiera relativa skillnader i ljusaktivering effektivitet av olika lägen av ljusaktivering. Protokollet kan också användas för att bedöma den absoluta fraktionen av photoactivated PA-FPs. Olika spektrala egenskaper av olika FPs måste beaktas.
Molekylär ljusstyrkan (MB) är en produkt av kvantutbyte (QY), extinktionskoefficient (EG) och procent absorbansen vid viss magnetisering våglängden i förhållande till absorbans toppen. För Cherry12 och PA-Cherry13, har respektive värden QY och EG offentliggjorts. Procent absorbansen vid viss magnetisering våglängden av 543 nm i förhållande till absorbansen peak är 0,5 och 0,7, respektive.
MBCherry = 0,22 * 72 000 * 0,5 = 7,920
MBPA-Cherry = 0,46 * 18.000 * 0,7 = 5 796
Därmed kan lägre molekylär ljusstyrkan på PA-Cherry jämfört med körsbär beaktas genom att dividera jagRed_expected av 1,37 (härlett från 7,920/5 796).
Det är dock okänt vilka villkor angående ljusaktivering PA-Cherry publicerade molekylär ljusstyrka har fastställts. Detta är viktigt, eftersom vi visar här att funktionsläget av ljusaktivering ändras den uppmätta fraktionen av photoactivated PA-FPs. Dessutom för monomer versioner bestående A206K mutationen. dvs mEGFP och PA-mEGFP, inga molekylära ljusstyrka har publicerats.
I detta proportionerlig stödnivå-baserat tillvägagångssätt, har PA-FPs molekylär ljusstyrka och de alltid-på FP motsvarigheterna i en första approximation ansetts vara identiska. Vi beslutade om detta synsätt, eftersom (i) för vissa FPs inga molekylära ljusstyrka har rapporterats, och (ii) det är hittills oklart i hur långt olika lägen av ljusaktivering kan påverka molekylär ljusstyrkan på PA-FPs rapporterats i litteraturen. Dessutom (iii) för en jämförande analys kunskap om molekylära ljusstyrkan inte är nödvändigt. det behövs bara för intensitet-baserade bestämning av absoluta fraktionen av photoactivated PA-FPs som kan beräknas enligt ovan.
Vår strategi som involverar fluorescerande protein chimärer som interna linjaler visar att olika exponering för UV-ljus ger olika ljusaktivering effektivitetsvinster. Därigenom definierar alternativ som hur man photoactivate en större PA-FP bråkdel och uppnå en bättre signal-brus-förhållande. Dessutom den öppnar möjligheter till differentially photoactivate olika PA-FPs i samma cell gett sin differentiell svar till UV-ljus eller differentially photoactivate samma PA-FP i olika subcellulär fack genom att utsätta den annorlunda för UV-ljus. Sammanfattningsvis hjälper våra protokoll ytterligare kvantitativa förståelsen av cellulära processer med PA-FPs i live-cell mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Dorigo laboratoriet och neurovetenskap Imaging-tjänsten vid Stanford University School of Medicine för att tillhandahålla utrustning och utrymme för detta projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEGFP-N1 mammalian cell expression vector | Clontech | ||
| DMEM w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Trypsin w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8-well chambers #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 |
References
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Renz, M., Lippincott-Schwartz, J. Ch. 9. The Fluorescent Protein Revolution Series in Cellular and Clinical Imaging. Day, R. N., Davidson, M. W. , CRC Press. 201-228 (2014).
- Shcherbakova, D. M., Sengupta, P., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Photocontrollable fluorescent proteins for superresolution imaging. Annual Review of Biophysics. , 303-329 (2014).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Henderson, J. N., et al. Structure and mechanism of the photoactivatable green fluorescent protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (12), 4176-4177 (2009).
- Subach, F. V., et al. Photoactivation mechanism of PAmCherry based on crystal structures of the protein in the dark and fluorescent states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21097-21102 (2009).
- Wiedenmann, J., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (45), 15905-15910 (2004).
- Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3 (12), e3944 (2008).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature Methods. 6 (2), 153-159 (2009).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Slocum, J. D., Webb, L. J. A Double Decarboxylation in Superfolder Green Fluorescent Protein Leads to High Contrast Photoactivation. Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (13), 2862-2868 (2017).
- Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6481-6491 (2010).
- Renz, M., Wunder, C. Internal rulers to assess fluorescent protein photoactivation efficiency. Cytometry A. , (2017).
- Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), E2989-E2997 (2012).
