Summary
Her presenterer vi en protokoll som innebærer genetisk kombinert spectrally forskjellige photoactivatable og fluorescerende proteiner. Disse fluorescerende protein chimeras tillater kvantifisering av PA-FP brøken som photoactivated skal fluorescerende, dvs photoactivation effektivitet. Protokollen avslører at forskjellige moduser av photoactivation gir forskjellige photoactivation effektivitet.
Abstract
Photoactivatable og -cabriolet fluorescerende proteiner (PA-FPs) har blitt brukt i fluorescens live-celle mikroskopi for å analysere dynamikken i celler og protein ensembler. Så langt ingen metode er tilgjengelig å kvantifisere samtidig og i levende celler hvor mange av PA-FPs uttrykt er photoactivated til fluoresce.
Her presenterer vi en protokoll med interne herskere, dvs koblet genetisk spectrally distinkte (photoactivatable) fluorescerende proteiner, til ratiometrically kvantifisere brøkdel av alle PA-FPs uttrykt i en celle som er slått på skal fluorescerende. Bruker denne protokollen, viser vi at forskjellige moduser av photoactivation gitt forskjellige photoactivation effektivitet. Kort høyeffekts photoactivation med en AC confocal laserskanning mikroskopet (CLSM) førte til fire ganger lavere photoactivation effektivitet enn hundrevis av lavnivå eksponeringer av CLSM eller en kort puls av widefield belysning. Mens protokollen har vært eksemplifisert her (PA-) GFP og (PA-) Cherry, kan den i prinsippet brukes noen spectrally distinkte photoactivatable eller photoconvertible fluorescerende protein par og noen eksperimentelle set-up.
Introduction
I 2002 beskrevet den første bredt aktuelt photoactivatable (PA-GFP1) og photoconvertible (Kaede2) fluorescerende proteiner. Disse optisk merkepenn fluorescerende proteiner endre spektrale egenskapene ved bestråling med UV-lys, dvs. de blir lyse (photoactivatable fluorescerende proteiner, dvs., PA-FPs), eller endre farge (photoconvertible FPs). Hittil har flere reversible og irreversible photoactivatable og photoconvertible fluorescerende proteiner vært utviklet3,4. I ensemble eller bulk studier, har optisk merkepenner blitt brukt til å studere dynamikken i hele celler eller proteiner og tilkobling av subcellular rom. Videre basert optisk merkepenner aktivert single-molekylet superresolution imaging teknikker som PALM5 og FPALM6.
Selv om Fotokjemiske prosesser under photoactivation eller -konvertering har blitt beskrevet i mange optisk merkepenner og selv krystallografisk strukturer før og etter photoactivation / - konvertering er gjort tilgjengelig7 , 8, den underliggende bildetfysisk mekanismen av photoactivation og -konvertering er ikke helt forstått. Videre så langt bare grove anslag finnes for effektiviteten av photoactivation og -konvertering, dvs brøkdel av fluorescerende proteiner uttrykt som er faktisk photoconverted eller photoactivated skal fluorescerende. In vitro ensemble studier har rapportert kvantifisere skifte i absorpsjon spectra og mengden av innfødte og aktivert protein i en gel9,10,11.
Her presenterer vi en protokoll med fluorescerende protein chimeras å vurdere brøkdel av photoactivated fluorescerende proteiner i bulk og lever celler. Når arbeider med genetisk kodet fluorescerende proteiner, den absolutte mengden protein uttrykt varierer fra celle til celle og er ukjent. Hvis en celle uttrykke PA-FP viser et klarere signal etter photoactivation enn en annen celle, kan ikke det differensieres hvis lysere signalet skyldes høyere uttrykk for PA-FP eller en mer effektiv photoactivation av PA-FP. For å standardisere hvilket uttrykk i celler, introdusere vi interne herskere av genetisk kombinert spectrally distinkte fluorescerende proteiner. Ved kobling den genetiske informasjonen som en photoactivatable fluorescerende protein en spectrally distinkte alltid fluorescerende proteiner, interne herskere opprettes som fortsatt måles til en ukjent totalbeløp, men i en fast og kjente relative 1: 1 denne strategien kan kvantitative karakterisering av ulike UV-lys photoactivation ordninger, dvs. vurdering av relative PA-FPs som kan være photoactivated med forskjellige moduser av photoactivation, og dermed tillater definere photoactivation ordninger som er mer effektive enn andre. Videre, denne strategien kan i prinsippet vurdering av den absolutte kvantifiseringen av photoactivated PA-FP brøken. Dette er det viktig å innse at presentert ensemble studiene er intensitetsbasert som gjør analysen mer komplisert som fastsatt i denne protokollen. Bestemme målt fluorescerende intensitet, dvs. forskjellige molekylær lysstyrken, absorbansen og utslipp spectra og bånd effekter, må vurderes når man sammenligner fluorescens intensiteter av ulike fluorescerende proteiner.
Presentert ratiometric intensitetsbasert kvantifisering av photoactivation effektiviteten er eksemplifisert PA-GFP og PA-Cherry i levende celler, men er i prinsippet bredt aktuelt og kan brukes for alle photoactivatable fluorescerende protein under noen eksperimentell tilstand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. plasmider konstruksjon
- Generer to farger fusion sonder. Bruke en pattedyr celle uttrykk vektor (se Tabell for materiale) i som mCherry112 og PA-mCherry113 er satt inn med begrensning nettsteder AgeI og BsrGI.
- For egendefinerte oligo-nukleotider å forsterke monomerisk variantene av eGFP og PA-eGFP som inneholder A206K mutasjon, dvs mEGFP og PA-mEGFP14 uten en stopp codon som et SalI-BamHI -fragment. Bruk N-terminal primer 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3 og C-terminalen primer 5'-AAT ATA TGG ATC CCG CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC 3 og denne SalI-BamHI fragment inn flere kloning området av uttrykket vektoren. Dette vil opprette fem aminosyre linker RNPPV mellom grønne og røde fluorescerende protein. Vi vil referere til fluorophore chimeras som GFP, kirsebær, PA-GFP-Cherry, og GFP-PA-Cherry for resten av denne artikkelen.
Merk: Koblingen av fluorophores og etableringen av interne herskere å vurdere photoactivation effektivitet kan gjøres med noen spectrally distinkte fluorophore par, f.eks superfolder PA-GFP 15/ PA-TagRFP 16, osv. Mange av photoactivatable fluorescerende proteiner er avledet fra GFP. Derfor kan primer rekkefølgen ovenfor brukes for mange fluorescerende proteiner for å konstruere et fluorophore chimera i en pattedyr celle uttrykk vektor.
2. celle kultur og hva
- Bruk enten en standard cellen linje som HeLa, NRK, Cos-7 eller en bestemt celle linje som skal brukes for bestemte photoactivation eksperimenter. Bruk DMEM (supplert med 10% fosterets bovin serum og 2 mM glutamin) og trypsin uten fenol rød (se Tabell for materiale) å redusere bakgrunnen fluorescens.
- Koble cellene i en confluent kultur med trypsin, teller antall celler i cellen suspensjon bruker en Neubauer kammer og frø 5 000 – 10 000 celler per brønn. Alternativt bruke 1 dråpe fra en 2-mL pipette av en 10-mL celle suspensjon fra en confluent cellekultur dyrket i en T 25-celle kultur kolbe eller 3 dråper fra en 5-mL celle suspensjon fra en confluent kultur dyrket i en T 12,5-celle kultur kolbe.
- Vokse celler i 8-vel kamre med #1.0 dekke glass (se Tabell for materiale) for fluorescens live-celle mikroskopi.
- Transfect celler 24 timer etter plating med kommersielle reagenser (se Tabell for materiale) per distributer's protokoll med GFP, kirsebær, PA-GFP-Cherry, og GFP-PA-Cherry chimeras.
- Bildet celler etter totalt 20 h legge transfection for protein uttrykk, bretting og modning.
3. imaging og Photoactivation
- Bildet celler i en fuktet og oppvarmet miljømessige kammer på 37 grader Celsius. Å bufre cellen media på fysiologisk pH og gjengi den CO2-uavhengig, legge til 20 mM HEPES, eller bruke CO2 gass satt til 5% flyt.
- Først, bilde celler som uttrykker GFP, kirsebær konstruksjon. Angi parametere som definerer tid integrert laser intensitet per piksel AC confocal bilde, dvs. pixel bor tid i mikrosekunder, acousto-optiske tunable filter (AOTF) overføring i prosent og digital bratt stigning.
Merk: Bruker en 60 x mål og en digital zoom 3 x kan avbildning av en celle i sin helhet samtidig som det gir nok forstørrelse. Angi piksel holdetiden 2-4 μs og AOTF overføring for 488-nm og 561-nm laser slik at bildene viser et godt signal-til-støy-forhold uten noen bleking og ingen piksler som angir fluorescens intensitet metning. - Bilde, bruker angi laser makt, AOTF overføring, pixel holdetiden og digital zoom, 15-20 celler uttrykke GFP, kirsebær.
- Deretter bilde med samme sett laser makt, pixel holdetiden, AOTF overføring og digital zoom celler uttrykke GFP-PA-kirsebær og PA-GFP-Cherry. Søk etter uttrykke celler i grønne kanalen eller røde kanalen, henholdsvis. Unngå lang eksponering av cellene under søket for å uttrykke celler for å ikke blekemiddel fluorescerende proteiner.
- Definere en mini tidsserier med en pre-aktivisering bilde og tre etter aktivisering bilder. Etter aktivisering bildene vil bidra til å identifisere potensielle forbigående mørke stater på grunn av eksponering for UV-lys.
Merk: I våre hender, endringer i oppdaget fluorescens intensitet på grunn av forbigående mørke stater var < 1% og kan være neglisjert, men de mørke statene bør vurderes for hver eksperimentelle set-up. - For å fastslå photoactivation effektivitet, dvs. brøkdel av PA-FPs som er slått på skal fluorescerende, i de bestemte photoactivation eksperimentene som allerede er etablert, bruke samme photoactivation innstillinger på 15-20 celler som uttrykker interne linjalene innført her og gå videre med bildeanalyser (del 4). Hvis begynner å sette opp photoactivation eksperimenter, Finn her noen forskjellige innstillinger basert på vår eksperimentelle erfaring med PA-GFP og PA-Cherry; endre etter behov.
- Øyeblikkelig photoactivation PA-GFP og PA-Cherry ved hjelp av en AC confocal laserskanning mikroskopet (CLSM), bruk 90 μW 405-nm laser lys i 3 eller 5 gjentakelser, henholdsvis.
Merk: Med vår mikroskopiske oppsett, en 38% AOTM overføring og en 2 μs pixel holdetiden, vi målt dette 405-nm laser makt i linje-skannemodus på linsen. Med disse innstillingene kan ca 8% og 16% av PA-GFP og PA-Cherry uttrykt photoactivated være fluorescerende. Hele titrering serien med CLSM for øyeblikkelig photoactivation har vært publisert tidligere17. - Hvis en høyere brøkdel av photoactivated PA-GFP og PA-kirsebær fluorophores er fordelaktig f.eks å oppnå en høyere signal-til-støy-forhold, og photoactivation trenger ikke å være umiddelbart, bruke 40 μW av 405-nm laserlys med 2 μs pixel bor tid og 6% AOTF overføring for 450 gjentakelser. Da photoactivation vil ta opptil 4 min i motsetning til bare 1-2 sekunder, men photoactivation effektivitet for PA-GFP vil være 29% i stedet for 8%, slik at for en høyere signal-til-støy-forhold.
- Øyeblikkelig photoactivation PA-GFP og PA-Cherry ved hjelp av en AC confocal laserskanning mikroskopet (CLSM), bruk 90 μW 405-nm laser lys i 3 eller 5 gjentakelser, henholdsvis.
- Hvis det finnes en mosaikk digital belysning system som inneholder micro speil matriser i en romlige lys modulator, kan 405-nm laserlys brukes for widefield-photoactivation. Dette gir effektiv photoactivation i millisekunder.
Merk: 1.6 mW laser makt målt i linsen og en eksponeringstid på 250 ms, 29% av PA-GFP kan være photoactivated å være fluorescerende. - Bilde med angitt photoactivation parametere 15-20 celler uttrykke PA-GFP, kirsebær og GFP-PA-Cherry, henholdsvis.
- Siden pH, reaktive oksygen arter og andre miljømessige faktorer kan påvirke photoactivation effektivitet, kan det være viktig å vurdere photoactivation effektivitet av PA-FPs i de respektive subcellular micromilieu der protein av interesse er beliggenhet. Ved å koble fluorophore chimeras protein av interesse, som forfatterne har gjort med plasma membranen protein VSVG 18, kan photoactivation effektivitet bli vurdert i bestemte subcellular rommet rundt.
4. image analyse og algoritme for Ratiometric intensitetsbasert kvantifisering av Photoactivation effektiviteten
- Bildeanalyse kan gjøres med åpen kildekode-plattformer ImageJ eller Fiji for bildebehandling. Bestemme bakgrunn fluorescens intensiteten i ikke-transfekterte celler i grønt (B-1) og rød (B-2) kanal. Unngå perinuclear eller områder viser økt auto-fluorescens.
- For å bestemme fluorescens intensiteten i en transfekterte celle, skissere celle kroppen med verktøyet Frihånd valg. Igjen unngå perinuclear eller noen andre områder viser automatisk-fluorescens.
- Trekk bakgrunnen fra målt fluorescens intensiteten i hver enkelt kanal.
JegG = jegGreen_measured -B1
JegR = jegRed_measured -B2 - Bruk av GFP, kirsebær konstruere å beregne rød til grønn forholdet (RtoGr) og korriger donor-slukker på grunn av fluorescens resonans energioverføring (bånd). BÅND effektiviteten E ble identifisert som 0,3 i forrige eksperimenter for GFP-kirsebær konstruksjon med samme aminosyre linker mellom de to fluorophores18.
RtoGr = (jegRed_measured -B2) / (jegGreen_measured -B1)
RtoGrcorr = RtoGr * (1-E)
Merk: I denne intensitet-basert tilnærming, donor slukke for mEGFP og PA-mGFP kan være forskjellig gitt mulig distinkte spektrale egenskapene som ikke har vært preget. Frekvensen av bånd (kET) og Foerster avstand (R0) er avhengig av quantum avkastningen av en giver som ikke har blitt bestemt for mEGFP og PA-mGFP. - Bruk til GFP-PA-Cherry konstruere å vurdere brøkdel av photoactivated PA-Cherry. Bestemme forventet fluorescens intensiteten av PA-Cherry ved å multiplisere målt unquenched grønne fluorescens intensiteten av GFP-PA-Cherry konstruere tidligere photoactivation med korrigert rød-til-grønn-forholdet (RtoGrcorr ).
JegRed_expected = (jegGreen_measured -B-1) * RtoGrcorr
Merk: Som angitt ovenfor, molekylær lysstyrken i FP- og photoactivatable FP kan være forskjellig. Se diskusjon for mer informasjon om hvordan din for disse forskjellene. - Beregne PA-Cherry photoactivation effektiviteten som en brøkdel av målte røde fluorescens intensiteten etter photoactivation og forventede fluorescens intensiteten i den røde kanalen.
(FPA-kirsebær) = (jegRed_measured -B2) / jegRed_expected - Bruke PA-GFP-kirsebær konstruere å vurdere brøkdel av photoactivated PA-GFP. Bestemme forventet fluorescens intensiteten av PA-GFP ved å dele målt røde fluorescens intensiteten av PA-GFP-Cherry konstruere tidligere photoactivation ved den røde-til-grønn-ratio (RtoGr). Her trenger i RtoGr ikke korrigeres for donor slukke, fordi GFP og PA-GFP er underlagt donor slukke til samme beløp.
JegGreen_expected = (jegRed_measured -B2) / RtoGr - Beregne PA-GFP photoactivation effektiviteten som en brøkdel av målte grønne fluorescens intensiteten etter photoactivation og forventede fluorescens intensiteten i den grønne kanalen.
(FPA-GFP) = (jegGreen_measured -B1) / jegGreen_expected
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen presenteres her viser ratiometric kvantifisering av brøkdelen av fluorescerende proteiner som er photoactivated skal fluorescerende (figur 1). Denne fraksjonen være forskjellig avhengig av modus for photoactivation.
Et vanlig resultat kort tid høyeffekts photoactivation med en AC confocal laserskanning mikroskopet (CLSM) vises i figur 2 c. Etter titrating laser kraften målt på linsen piksel bor tid og ATOF girkasse, maksimal photoactivation effektiviteten for PA-GFP var om lag 8% og PA-Cherry ca 16%. Relativt lav photoactivation effektiviteten av PA-GFP og PA-kirsebær kan forklares med samtidige photoactivation og -ødeleggelse når de utsettes for en kontinuerlig deterministisk strøm av fotoner ved CLSM. De kortere fluorescens levetid og de annen, høyre-forskjøvet absorpsjon spektra av røde PA-FPs kan bidra til høyere photoactivation effektiviteten av PA-Cherry sammenlignet med PA-GFP.
Bruke lav laser makt og hundrevis av gjentakelser, oppnås en høyere photoactivation effektivitet. 450 gjentakelser av UV-lys levert av en CLSM over totalt 4 min gitt en photoactivation effektivitet på 29% for PA-GFP (Figur 3 c). Høyere photoactivation effektiviteten med repeterende eksponering for UV-lys fotoner kan foreslå en flertrinns photoactivation prosess. Alternativt er anvendt UV-lyset sterkt nok photoactivate men ikke nok til å photodestruct som fører akkumulert over tid til en høyere brøkdel av photoactivated fluorescerende proteiner.
Med widefield belysning utsatt fluorophores stochastically og full av gjentagelser for 405-nm fotoner. Her, gitt eksponering for bare 250 ms en 29% photoactivation effektivitet for PA-GFP.
Figur 1: begrepet fastslå photoactivation effektivitet i bulk og lever celler. Ved å koble spectrally distinkte fluorescerende proteiner, opprettes interne herskere som tillater ratiometric intensitetsbasert vurdering av photoactivation effektiviteten. Målt intensiteter av PA-kirsebær og PA-GFP var knyttet til forventede intensiteter. Forventet intensiteter var avledet fra bestemme fluorescens intensiteten av alltid fluorescerende proteiner i GFP-Cherry, GFP-PA-kirsebær eller PA-GFP-Cherry chimeras før photoactivation. Figur endret Renz og Wunder 201717. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Bulk photoactivation av PA-GFP-kirsebær (a) og GFP-PA-kirsebær (b) som umiddelbart og fullstendig som mulig bruke AC confocal laser-skanning mikroskop i levende celler. 8% av PA-GFP uttrykt var photoactivated med en piksel bor tid med 2 μs og en AOTF overføring av 38% som resultere i laser makt av 90 μW, målt i linsen og 3 gjentakelser (c). 405-nm laser makt økte ikke photoactivation effektivitet. Figur endret Renz og Wunder 201717. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: iterativ strømsparende photoactivation AC confocal laser-skanning mikroskop (a) og korte høyeffekts widefield belysning (b) gir høyere photoactivation effektivitet. 29% av PA-GFP var photoactivated med en piksel bor tid med 2 μs og en AOTF overføring av 6%, noe som resulterer i laser makt av 40 μW, målt i linsen og 450 gjentakelser (c). Figur endret Renz og Wunder 201717. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Så langt eksisterte ingen metode for å bestemme bulk brøkdel av PA-FPs uttrykt i levende celler som er photoactivated skal fluorescerende. Presentert protokollen kan brukes for alle spectrally distinkte fluorescerende protein par. Mens eksemplifisert her for den irreversibel PA-FPs PA-GFP og PA-kirsebær, er denne tilnærmingen i prinsippet gjelder for photoconvertible proteiner også. Spectrally distinkte fluorescerende protein, men må velges nøye å minimere spectral overlapping gitt at photoconvertible fluorescerende proteiner skifte deres absorbansen og utslipp spectra, f.eks fra grønt til rødt fluorescens.
Som beskrevet ovenfor, er det viktig å si at presentert tilnærming er ratiometric og intensitetsbasert. Det kan brukes til å standardisere ukjent uttrykk nivået i celler og definere relative forskjeller i photoactivation effektivitet av forskjellige moduser av photoactivation. Protokollen kan også brukes til å vurdere den absolutte brøkdelen av photoactivated PA-FPs. Deretter må forskjellige spektrale egenskapene til ulike FPs tas i betraktning.
Molekylær lysstyrken (MB) er et produkt av quantum avkastning (QY), utryddelse koeffisient (EC) og prosent absorbans ved gitt eksitasjon bølgelengden i forhold til absorbansen toppen. For kirsebær12 og PA-Cherry13, er verdier i QY og EC publisert. Prosent absorbansen på gitt eksitasjon bølgelengden til 543 nm i forhold til absorbansen peak er 0,5 og 0,7, henholdsvis.
MBCherry = 0.22 * 72,000 * 0,5 = 7,920
MBPA-Cherry = 0.46 * 18.000 * 0,7 = 5,796
Dermed kan lavere molekylær lysstyrken på PA-Cherry sammenlignet med kirsebær tas i betraktning ved å dele jegRed_expected av 1.37 (avledet fra 7,920/5,796).
Men er det ukjent under hvilke photoactivation publiserte molekylær lysstyrken på PA-kirsebær er fastslått. Dette er viktig, siden vi viser her at modus for photoactivation endres målt brøkdel av photoactivated PA-FPs. Videre for monomerisk versjoner omfatter A206K mutasjon. dvs mEGFP og PA-mEGFP, ingen molekylær lysstyrke er publisert.
I denne ratiometric intensitetsbasert tilnærming, har molekylær lysstyrken på PA-FPs og FP-kolleger i en første tilnærming vært vurdert identiske. Vi bestemte oss på denne siden (i) for noen FPs ingen molekylær lysstyrke er rapportert, og (ii) det er uklart hvordan så langt langt forskjellige moduser av photoactivation kan påvirke molekylær lysstyrken på PA-FPs rapportert i litteraturen. Videre, (iii) for en komparativ analyse kunnskap om molekylære lysstyrken ikke er nødvendig; Det er bare nødvendig for intensitetsbasert fastsettelse av absolutt brøkdel av photoactivated PA-FPs som kan beregnes som vist ovenfor.
Vår tilnærming med fluorescerende protein chimeras som interne herskere viser at ulike eksponering for UV-lys gir forskjellige photoactivation effektivitet. Dermed det definerer alternativene som hvordan du photoactivate større PA-FP brøk og oppnå et bedre signal-til-støy-forhold. Videre åpner opp muligheter til ulikt photoactivate forskjellige PA-FPs i samme celle gitt sitt differensial svar UV-lys eller ulikt photoactivate samme PA-FP i forskjellige subcellular rom ved å utsette det annerledes å UV-lys. Oppsummert vil våre protokollen hjelpe videre kvantitative forståelse av mobilnettet prosesser bruker PA-FPs i live-celle mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Dorigo laboratorium og nevrovitenskap Imaging tjenesten på Stanford University School of Medicine for å tilby utstyr og plass for dette prosjektet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEGFP-N1 mammalian cell expression vector | Clontech | ||
| DMEM w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Trypsin w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8-well chambers #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 |
References
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Renz, M., Lippincott-Schwartz, J. Ch. 9. The Fluorescent Protein Revolution Series in Cellular and Clinical Imaging. Day, R. N., Davidson, M. W. , CRC Press. 201-228 (2014).
- Shcherbakova, D. M., Sengupta, P., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Photocontrollable fluorescent proteins for superresolution imaging. Annual Review of Biophysics. , 303-329 (2014).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Henderson, J. N., et al. Structure and mechanism of the photoactivatable green fluorescent protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (12), 4176-4177 (2009).
- Subach, F. V., et al. Photoactivation mechanism of PAmCherry based on crystal structures of the protein in the dark and fluorescent states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21097-21102 (2009).
- Wiedenmann, J., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (45), 15905-15910 (2004).
- Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3 (12), e3944 (2008).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature Methods. 6 (2), 153-159 (2009).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Slocum, J. D., Webb, L. J. A Double Decarboxylation in Superfolder Green Fluorescent Protein Leads to High Contrast Photoactivation. Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (13), 2862-2868 (2017).
- Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6481-6491 (2010).
- Renz, M., Wunder, C. Internal rulers to assess fluorescent protein photoactivation efficiency. Cytometry A. , (2017).
- Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), E2989-E2997 (2012).
